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Introducción
La agricultura en México es una de las principales actividades primarias que contribuye con 2.3% del producto interno bruto (PIB) (INEGI, 2020). El municipio de Acatzingo, Puebla-México es uno de los principales productores agrícolas de cultivos como: maíz, frijol, alfalfa, col, lechuga, nopales, tomate, tuna y zanahoria principalmente (SIAP, 2021). Sin embargo, estas superficies agrícolas se han visto afectadas por el uso intensivo de fertilizantes y plaguicidas químicos, además por derrames de diésel, gasolina o petróleo crudo (Cavazos-Arroyo et al., 2014). El deterioro ambiental con respecto a la degradación de suelos genera un costo de 0.41% del PIB (INEGI, 2018). El diésel es un contaminante que causa problemas a la salud por la presencia de compuestos de hidrocarburos poliaromaticos (HPA), que son considerados genotóxicos, mutagénicos y carcinogénicos (Schulte y Hauser, 2012). Por todo esto surge la necesidad de recuperar suelos agrícolas contaminados con diésel de esta región, debido a que es la fuente principal de subsistencia de los campesinos.
Agaricus bisporus ‘champiñón’ contribuye con 15% (34x106 t) de la producción mundial de hongos comestibles y es la cuarta especie más cultivada, principalmente por su sabor y propiedades nutrimentales, funcionales y medicinales (Royse et al., 2017). En México, la producción de A. bisporus fue de 59 349 ton, representando 93.7% de la producción nacional de hongos, donde mantiene el liderazgo en Latinoamérica (Martínez-Carrera et al., 2016). Durante el crecimiento y fructificación de A. bisporus, aproximadamente 44% de celulosa, 29% de xilano y 8% de lignina, son degradados; sin embargo, existe 20 a 30% de los polisacáridos presentes en el sustrato que permanecen sin degradar; este cálculo no considera la conversión de sustrato en micelio vegetativo (Kapu et al., 2012; Vos et al., 2017) así, una parte significativa del sustrato pueden ser utilizado como sustrato residual o poscosecha (SR).
En promedio una planta productora genera 5 kg de sustratos residuales (Lau et al., 2003) por cada kg de hongos cosechados, obteniendo hasta 24 t de sustrato residuales al mes (Singh et al., 2011). El sustrato residual se ha estudiado como alimento animal (Kim et al., 2011; Li et al., 2018), para la purificación y extracción de enzimas, para aplicaciones de producción de biogas, biocombustible o biorremediación (Phan y Sabaratnam, 2012; Wan y Li, 2012), ya que presenta altas concentraciones de nutrientes, microorganismos y enzimas (Ball y Jackson, 1995; Chiu et al., 1998; González-Matute et al., 2011; Kapu et al., 2012). Por lo que esta investigación tuvo como objetivo evaluar el sustrato residual de A. bisporus en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con diésel a nivel microcosmos, permitiendo ofrecer una alternativa biotecnológica para la restauración de suelos agrícolas impactados con hidrocarburos.
Materiales y métodos
Se realizó un muestreo de suelo agrícola no contaminado en Acatzingo, Puebla, México con las siguientes coordenadas geográficas 18º 57’ 01” latitud norte y 97º 43’ 40” longitud oeste. El sustrato residual de Agaricus bisporus utilizado en este estudio se obtuvo de productores locales de la ciudad de Puebla, México.
Caracterización física, química y microbiológica del suelo y del sustrato residual de A. bisporus
Se llevó a cabo la caracterización física y química del suelo agrícola y del sustrato residual de A. bisporus como se describe en la NOM-021-SEMARNAT-2000 (DOF, 2002). Para la caracterización microbiológica del suelo y del SR se realizaron diluciones seriadas y la técnica de cuenta en placa en medios de cultivo diferenciales para la cuantificación de poblaciones de bacterias, hongos, actinomicetos y bacterias tolerantes a diésel expresadas como log10 UFC gss -1 (unidades formadoras de colonias/gramo de suelo seco).
La población bacteriana mesofilica fue cuantificada en medio agar nutritivo (Bioxon, México), los hongos en medio Agar de Papa Dextrosa (PDA), los actinomicetos en Agar Czapek Dox y las bacterias tolerantes a diésel en medio basal; este último con la siguiente preparación (g L-1): NH4NO3, 1; K2HPO4, 1; KH2PO4, 1; MgSO47H2O, 0.409; CaCl2, 0.02; FeCl3, 0.00005; agar bacteriológico, 6.5; pH 7, suplementado con 100 (l de diésel estéril distribuido sobre el agar gelificado (Mauricio-Gutiérrez et al., 2014). Las bacterias mesofilicas, bacterias tolerantes y actinomicetos fueron incubados a 30 oC por 72 h, los hongos fueron incubados a 25 oC por 72 h.
Biodegradación de diésel a nivel microcosmos utilizando SR de A. bisporus
El suelo utilizado fue esterilizado y contaminado intencionalmente con 7 039 ppm de diésel, e intemperizado por tres meses. Se empleo un diseño experimental completamente al azar en sistema de microcosmos para evaluar la participación de las poblaciones microbianas y actividad lacasa (Lac) presente en el sistema de estudio con cuatro tratamientos con diferentes relaciones suelo: sustrato en base seca (T1 (95:5), T2 (90:10), T3 (85:15) y T4 (80:20)) y como testigos se utilizó el suelo contaminado (T01) y SR (T02).
Para cada tratamiento se emplearon frascos serológicos de 120 ml, con 30 g de la mezcla suelo-sustrato y fueron ajustados a la relación C:N:P a 100:10:1 usando soluciones estériles de NH4SO4 1N y K2HPO4 1N. La humedad se mantuvo entre 23.8-25.6% ±5.23. La atmósfera de los frascos fue intercambiada cada tercer día con un flujo de aire (1.8 ml aire s-1); a través, de una membrana estéril (0.22 µm), previamente se evaluó la cantidad de CO2 producida. Todos los tratamientos se incubaron por 28 días a dos temperaturas (25 y 37 ºC).
Se determinó el porcentaje de biodegradación de diésel (%), densidad real por la NOM-021-SEMARNAT-2000, actividad inicial y final de lacasas (Lac), población inicial y final de bacterias y hongos tolerantes a diésel (DOF, 2002). Todos los tratamientos se llevaron a cabo por triplicado. El porcentaje de biodegradación fue determinado de acuerdo con la siguiente ecuación: porcentaje de biodegradación= [(A-B)/A]*100, donde: A= concentración inicial de diésel; B= concentración final de diésel
Respiración basal
El CO2 producido por el suelo durante 24 h fue cuantificado y absorbido por 5 ml de NaOH 0.1 N, se calculó a través de la titulación con HCl 0.1 N utilizando fenolftaleína, previamente se precipitó el exceso de carbonatos con 5 ml de BaCl2 0.5 N (Rivera-Espinoza y Dendooven, 2004).
Cuantificación de diésel
Se cuantificó el diésel inicial y residual con base al Método EPA 8015 C (Nonhalogenated Organics by Gas Chromatography) empleando un GC-MS con una columna capilar HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm), cuyo flujo inicial fue de 1 ml min-1. Las condiciones de análisis del horno fueron: temperatura inicial 50 ºC, Temperatura máxima 300 ºC.
Cuantificación de enzimas
Se realizó una extracción al inicio y final del experimento de la muestra del SR de A. bisporus y de los diferentes tratamientos en relaciones suelo: sustrato (5 g) con 20 ml de buffer de acetato de sodio (50 mM, pH 5) por 2 h a 80 rev min-1 y a 4 oC, posteriormente se filtró a través de papel Whatman No. 1. Los extractos se almacenaron a 4 oC para la determinación de Lacasas (Isikhuemhen y Mikiashvilli, 2009). La actividad fue determinada por oxidación de 2.2’-azinobis, 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate (ABTS) a 25 oC y leída a 420 nm (ε420 = 36 000 mM cm-1), la actividad enzimática fue reportada como actividad específica (U g suelo-1) (Bollag y Leonowicz, 1984; Gayosso-Canales et al., 2011).
Análisis microbiológico
La cuantificación de la población inicial y final de bacterias y hongos tolerantes a diésel fue por conteo directo en placa. La determinación de bacterias se realizó para los tratamientos incubados a 37 oC crecidos en medio basal mencionado anteriormente. La determinación de hongos fue para los tratamientos incubados a 25 oC y se utilizó el medio basal con la siguiente composición química (g L-1): (NH4)2SO4, 7; K2HPO4, 1; KH2PO4, 1; MgSO47H2O, 0.409; dextrosa, 0.1; Sol. E 100x, 100 µl; rosa de bengala, 0.05; sulfato de estreptomicina, 0.05; pH 5.5. Se empleó como fuente de carbono diésel previamente esterilizado por filtración, agregando 100 µl sobre la placa Petri (Mauricio-Gutiérrez et al., 2014). Los microorganismos fueron reportados como log10 UFC gss -1 (unidades formadoras de colonias/gramo de suelo seco).
Resultados y discusión
El sustrato residual (SR) derivado de la industria de hongos comestibles representan un problema ambiental (Phan y Sabaratnam, 2012), en Europa se generan 3.5 x 106 t al año (García-Delgado et al., 2013). México contribuye con la generación de estos residuos, ya que es el mayor productor de hongos comestibles en Latinoamérica, siendo A. bisporus uno de los principales hongos cultivados (Martínez-Carrera et al., 2016). Por tales motivos, los SR se han estudiado para diferentes aplicaciones como la biorremediación de suelos contaminados con HPA (Cerniglia y Sutherland, 2010; Stabnikova et al., 2010; Pardo‑Giménez et al., 2010; Upadhyay y Singh, 2011; Phan y Sabaratnam, 2012; García-Delgado et al., 2013).
Caracterización física, química y microbiológica del suelo y del SR
De acuerdo con las características físicas y químicas (Cuadro 1) del suelo agrícola de Acatzingo, Puebla, México fue clasificado como franco-arenoso, con valores bajos de humedad (17.35%), materia orgánica (2.04%), nitrógeno total (0.032%) y fósforo (0.003%) comparados con los parámetros del SR (190.32%, 57.62%, 1.46% y 0.79% respectivamente). Además, presentó un valor de pH medianamente alcalino (pH= 8.01). Los SR de Agaricus bisporus se caracterizan por presentar altas concentraciones de nutrientes, estas propiedades han sido utilizadas como agentes bioestimulantes para la biorremediación de xenobiótico ya que presentan altas dosis de nitrógeno (2.16%), fósforo (0.69%) y carbono (54.3%) (Corral-Bobadilla et al., 2019).
Cuadro 1 Caracterización física, química y microbiológica del suelo y del SR de A. bisporus.
| Parámetros | Suelo | Sustrato residual |
| pH | 8.01 | 7.26 |
| CE (µS cm-1) | 205 | Nd |
| Textura (%) [arcilla, limo, arena] | 17.4, 18, 64.6 | Nd |
| Humedad (%) | 17.355 | 190.328 |
| Materia orgánica total (%) | 2.04 | 57.625 |
| Nitrógeno total (%) | 0.032 | 1.46 |
| Fósforo disponible (%) | 0.003 | 0.791 |
| Densidad real (g ml-1) | 2.464 | Nd |
| Bacterias (log UFC gss -1) | 6.021 | 7.708 |
| Hongos (log UFC gss -1) | 3.455 | 5.554 |
| Actinomicetos (log UFC gss -1) | 2.895 | 3.559 |
| Bacterias hidrocarbonoclastas (log UFC gss -1) | 5.037 | 3.828 |
Nd= no determinado; gss= gramos de suelo seco.
Con respecto a la cuantificación de microorganismos cultivables del Cuadro 1, la población bacteriana presentó los valores más altos en el suelo (6.021 log UFC gss -1) y el SR (7.708 log UFC gss -1). El tamaño de las otras poblaciones microbianas varió entre las muestras, siendo el suelo agrícola donde hubo una mayor cantidad de bacterias hidrocarbonoclastas (5.037 log UFC gss -1), seguido de la población fúngica (3.455 log UFC gss -1) y finalmente actinomicetos (2.895 log UFC gss -1). Sin embargo, en el SR hubo una mayor cantidad de hongos (5.554 log UFC gss -1) y los grupos de actinomicetos y bacterias hidrocarbonoclastas se mantuvieron en el mismo orden de magnitud (3.559 y 3.828 log UFC gss -1). El suelo y el SR alberga población microbiana autóctona, estos últimos han utilizados como fuentes de bioaumentación para procesos de biorremediación (Wang et al., 2016; Leong et al., 2022).
Biodegradación de diésel a nivel microcosmos utilizando SR de A. bisporus
Los experimentos de biodegradación de diésel a nivel microcosmos Cuadro 2, presentaron una mayor biodegradación a 37 ºC; el tratamiento T4 fue el que obtuvo la mayor remoción (68.747%) seguido de T4 a 25 ºC (61.261%) y T3 a 37 ºC (60.14%). Por el contrario, los tratamientos con menor porcentaje de remoción fueron el T01 (suelo contaminado) a 25 ºC con una remoción de 20.603%, seguido del T1 (27.034%) y el T2 (29.791%) a 25 ºC, presentando diferencias estadísticas altamente significativas (p= 0.001).
Cuadro 2 Biodegradación de diésel y producción de CO2 acumulativo usando SR de A. bisporus.
| Tratamiento | Biodegradación | mmol CO2 m-3 día* | |||
| 25 oC | 37 oC | 25 oC | 37 oC | ||
| (%) | (x10-4) | ||||
| T1 | 27.034 c | 40.966 bc | 4.319 ±0.287 c | 5.608 ±0.533 b | |
| T2 | 29.791 c | 48.408 b | 4.343 ±0.266 c | 5.685 ±0.564 b | |
| T3 | 37.177 b | 60.14 a | 4.808 ±0.574 b | 6.014 ±0.214 a | |
| T4 | 61.261 a | 68.747 a | 5.785 ±0.46 a | 6.144 ±0.429 a | |
| T01 | 20.603 d | 37.357 c | 4.902 ±0.334 b | 5.432 ±0.346 b | |
| T02 | Nd | Nd | 6.173 ±0.245 a | 5.767 ±0 b | |
*= ±desviación estándar; Nd= no detectado. Letras diferentes en la columna indican diferencias estadísticas significativas de acuerdo con la prueba Tukey (p= 0.05).
La generación de CO2 acumulativa y cuantificada en el sistema de estudio indicó que los tratamientos incubados a 37 ºC produjeron una mayor concentración (mmol CO2 m-3 día) Cuadro 2. Los tratamientos que obtuvieron mayor producción de CO2 fueron el T02 (SR) (6.173 x 10-4 mmol CO2 m-3 día) a 25 ºC, T4 (6.144 x 10-4 mmol CO2 m-3 día) y T3 (6.014 x 10-4 mmol CO2 m-3 día) a 37 ºC. Y los tratamientos: T1 (4.319 x 10-4 mmol CO2 m-3 día) a 25 ºC, T2 (4.343 x 10-4 mmol CO2 m-3 día), T3 (4.808 x 10-4 mmol CO2 m-3 día) y T01 (suelo contaminado) (4.902 x 10-4 mmol CO2 m-3 día) a 25 ºC presentaron menor tasa de producción de CO2. Margesin et al. (2007) correlacionaron positivamente la degradación de hidrocarburos con la actividad y biomasa microbiana, resultados similares a los obtenidos en la presente investigación.
Una relación 4:1 de suelo: sustrato (T4) biodegradó el 68.747% de diésel en 28 días, lo que permite tratar 6.92 t m-3 de suelo, como lo mencionan Sasek et al. (2003) quienes adicionaron SR de A. bisporus a una relación 4:1 (suelo: sustrato) y obtuvieron una degradación de 68.8% de HPA (hidrocarburos poliaromáticos) al termino de 154 días en 2.8 m3 de suelo. Mientras, Mohammadi-Sichani et al. (2019) reportaron una degradación de 71.5% en tres meses de HTP (hidrocarburos totales de petróleo) en suelo, aplicando 10% de SR de A. bisporus. Además, se determinó la densidad real de cada tratamiento con la finalidad de valorar el SR de A. bisporus como agente texturizante para su aplicación en biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos.
Los resultados obtenidos indicaron que no existe diferencia estadística significativa de la densidad real entre los tratamientos, donde los valores están en el intervalo de 2.36 a 2.536 g ml-1Cuadro 3. Los porcentajes de biodegradación obtenidos se pueden deber a las propiedades físicas y químicas que aporta el SR al suelo como: textura, capacidad de retención de agua, porosidad y aportación de nutrientes esenciales como nitrógeno y fósforo (Cuadro 1), que permiten estimular la actividad microbiana degradativa ayudando en la bioremediación del suelo (Stabnikova et al., 2010; García-Delgado et al., 2013).
Cuadro 3 Densidad real y cantidad de suelo contaminado tratado por SR de A. bisporus aplicado.
| Tratamiento | Densidad real | Suelo tratado/sustrato residual | |
| (g ml-1) | (t m-3) | ||
| T1 | 2.536 a | 32.85 | |
| T2 | 2.413 a | 15.56 | |
| T3 | 2.43 a | 9.76 | |
| T4 | 2.36 a | 6.92 | |
| T01 | 2.334 a | Na | |
| T02 | 1.729 b | Na |
Letras diferentes en la columna indican diferencias estadísticas significativas de acuerdo con la prueba Tukey (p= 0.05); Na= no aplica.
La dinámica poblacional de bacterias tolerantes a diésel en el sistema de estudio indicó un aumento estadístico significativo (p= 0.001) al final del experimento para todos los tratamientos: T1 (7.83 log UFC gss -1), T2 (8.9 log UFC gss -1), T3 (7.7 log UFC gss -1) y T4 (7.6 log UFC gss -1). Sin embargo, el conteo poblacional de hongos tolerantes mostró una disminución estadística significativa (p= 0.001) con tamaño de poblaciones de 4.8 a 5.6 log UFC gss -1 (Figura 1).
Figura 1 a) dinámica poblacional bacteriana de los tratamientos incubados a 37 oC; y b) fúngica de los tratamientos incubados a 25 oC tolerantes a diésel. Al inicio (barras claras) y final (barras oscuras) del experimento con diferentes relaciones suelo: SR de A. bisporus en base seca. Cada valor representa el promedio de triplicados. Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos (p= 0.05) de acuerdo con la prueba Tukey.
La cuantificación de Lac disminuyó significativamente (p= 0) en los tratamientos incubados a 25 oC cuantificándose actividades enzimáticas específicas de 0.083 a 0.48 U g-1 (Figura 2). El tratamiento T4 (80:20) presentó la mayor actividad enzimática (0.48 U g-1) a diferencia del grupo testigo T02 (SR) de A. bisporus (2.46 U g-1). En los tratamientos incubados a 37 oC no se detectó la actividad de Lac de acuerdo con la metodología establecida.
Figura 2 Actividad de lacasas a nivel microcosmos con diferentes relaciones suelo: SR de A. bisporus en base seca. Cada valor representa el promedio de triplicados de los tratamientos al inicio (barras claras) y final (barras oscuras) del experimento. *= letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos (p= 0.05) de acuerdo con la prueba Tukey.
El grupo de microorganismos estudiados en la biodegradación de diésel fueron las bacterias tolerantes autóctonas del SR y del suelo, ya que presentaron una efectiva en la biodegradación y contribuyeron en el proceso de biorremediación (Gallego et al., 2001). Por el contrario, los tratamientos incubados a 25 ºC mostraron una disminución de la población de hongos ya que fueron afectados por las condiciones del microcosmos (ambiente) y el tipo de contaminante empleado, así como en la producción de enzimas como las Lac. Bento et al. (2005) mencionan que los microorganismos en un ambiente hostil disminuyen su actividad metabólica y limitan el crecimiento de su población.
Aunque existen diferentes reportes de enzimas extracelulares secretadas por A. bisporus en el SR que pueden ser aprovechadas en procesos de biorremediación (García-Delgado et al., 2013; Chatterjee et al., 2017). Es importante mencionar, que el tratamiento testigo T01 (suelo) presentó una biodegradación de diésel de 37.357%, este valor puede estar asociado a la perdida por volatilización ya que puede ser de 35-40% en suelo (Rhykerd et al., 1999; Saviozzi et al., 2009) y a la presencia de estructuras reproductivas de la microbiota autóctona que resistió la esterilización del suelo (Sylvia et al., 1999), ya que en el presente estudio el T01 (suelo) presentó poblaciones de bacterias y hongos finales de 5.3 y 4.4 log UFC gss -1.
El SR de A. bisporus se caracterizó como agente bioestimulante por presentar nutrientes orgánicos, además aumentó la porosidad del suelo contaminado mejorando la difusión de oxígeno y la capacidad de retención de agua. También presentó características de bioaumentación, ya que aportó carga microbiana como fuente degradadora de diésel con un efecto potencial en la biodegradación de hidrocarburos. Como lo establecen Chiu et al. (1998) donde mencionan que los SR presentan la ventaja de degradar compuestos xenobióticos por el consorcio de enzimas de diversos microorganismos, además de ser relativamente ricos en nutrientes que estimulan a estos microorganimos en la secreción de enzimas sin tener alguna limitación nutrimental.
En este contexto, existen diversos estudios donde evalúan diferentes SR como: lodos activados, bagazo de caña de azúcar, cachaza de caña de azúcar y residuos de maíz para fines de biorremediación de suelos contaminados con diésel con porcentajes de biodegradación de 61 al 90% en un tiempo de 15 a 109 días, resultados similares a los obtenidos en la presente investigación (Gallego et al., 2001; Molina-Barahona et al., 2004; Rivera-Espinoza y Dendooven, 2004; Bento et al., 2005; García-Torres et al., 2011).
Conclusiones
Esta investigación identificó un uso alternativo del SR de A. bisporus para la biorremediación de suelos agrícolas contaminados con diésel, atribuyendo a la actividad bacteriana autóctona del SR y del suelo esta biodegradación; además, el SR fue una fuente importante de nutrientes. Por lo que se requieren estudios posteriores sobre los microorganismos y rutas de biodegradación involucradas, para su aplicación a pequeña escala e industrial bajo condiciones reales en ensayos de campo.
