Introducción

La albahaca es una planta aromática milenaria de las regiones tropicales y subtropicales del continente asiático pero cultivada en todo el mundo (^{Ono et al., 2011}). Por su agradable olor y sabor, la especie tiene una gran importancia comercial y es ampliamente utilizada en la industria alimentaria, ya sea para consumo fresco o seco y como saborizante para salsa y vinagre (^{Ojeda-Silvera et al., 2015}). Se utiliza en la industria cosmética debido a su contenido de aceites esenciales (^{Nieto et al., 2016}; ^{Mazón-Suástegui et al., 2018a}; ^{Batista-Sánchez et al., 2022}) y en la industria farmacéutica por sus propiedades estimulantes, diuréticas, antiespasmódicas y antialopécicas, entre otras (^{Batista-Sánchez et al., 2015}).

La albahaca se cultiva en los estados mexicanos de Guerrero, Nayarit, Morelos, Puebla, Baja California y Baja California Sur (BCS), de los cuales este último es el estado con mayor producción (^{SIAP, 2017}). No obstante, la productividad de la albahaca en BCS está en riesgo porque las áreas agrícolas con tendencia a la salinidad han aumentado debido a sus condiciones semiáridas (^{Batista-Sánchez et al., 2017}). En los últimos años, el estrés abiótico en plantas asociado a la salinidad ha sido un efecto subyacente para la comunidad científica internacional debido a sus consecuencias negativas, causando una disminución en la producción de biomasa que reduce el rendimiento de las especies cultivadas y la sostenibilidad de la agricultura en las áreas afectadas (^{Kandil et al., 2017}; ^{Mazón-Suástegui et al., 2020a}; ^{Rodríguez-Alvarez et al., 2020}).

Según ^{Khalig et al. (2014}), las pérdidas globales en la agricultura por la salinidad, ha afectado una quinta parte de las tierras cultivadas y superan 12 mil millones de dólares anuales. Entre los efectos nocivos del estrés por salinidad se incluyen la disminución de la absorción de agua, los iones entrantes que podrían causar toxicidad, el desequilibrio nutricional y los cambios fisiológicos, como la tasa fotosintética por la reducción del área foliar y el menor intercambio de gases, que aislados o sinérgicos reducen la viabilidad del cultivo (^{Abbas et al., 2015}; ^{Hessini et al., 2015}).

En la actualidad, se han desarrollado muchos estudios de investigación para enfrentar el problema asociado al agua y la salinidad. Estos estudios se han centrado en la selección de variedades tolerantes al estrés abiótico (^{Ojeda-Silvera et al., 2013}), evaluación de factores de transcripción de tolerancia mediante técnicas de biología molecular (^{García et al., 2013}) y aplicación de sustancias promotoras del crecimiento (^{Calvo et al., 2014}). En esta misma línea de investigación, la homeopatía agrícola con sustancias bioactivas ultradiluidas o nanomedicamentos es un tema novedoso para la agricultura global (^{Mazón-Suástegui et al., 2018a}).

Estudios recientes han demostrado la acción beneficiosa de algunos medicamentos homeopáticos ultradiluidos en las plantas, ya sea para reducir la presencia o los efectos nocivos de los organismos plaga (^{Martínez et al., 2014}; ^{Meneses, 2017}) o estimular el crecimiento y vigor de las plantas en su presencia (^{Modolon et al., 2016}; ^{Mazón-Suástegui et al., 2020b}; ^{Abasolo-Pacheco et al., 2020}; ^{García-Bernal et al., 2020}). La aplicación de los nanomedicamentos como sustancias elicitoras de los efectos negativos del estrés por salinidad es un tema que ha sido poco explorado.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto elicitor de Natrum muriaticum frente al estrés inducido por NaCl en dos variedades de albahaca (Ocimum basilicum L.) cultivadas en sistema hidropónico, teniendo en cuenta variables de respuesta de actividad fotosintética y producción de biomasa.

Materiales y métodos

Sitio de estudio: el experimento se realizó en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), ubicado a 24° 08’ 10.03” N y 110° 25’ 35.31” O a 7 msnm al norte de la ciudad de La Paz, Baja California Sur, México (^{Ojeda-Silvera et al., 2015}). Una estructura construida con tubos de acero galvanizado cubiertos con un 1610 PME CR (hilos de 16*10 cm, malla color cristal orificios de 0.4*0.8 mm), equivalente a un 40% de sombra y temperatura media, máxima y mínima de 26.84 ±5.21, 44.17 ±4.92, 13.4 ±5.83 °C, respectivamente, y humedad relativa de 52.8 ±14.95%. Estos datos climatológicos se registraron con una estación climatológica portátil (Vantage Pro2^® Davis Instruments, USA) dentro de una estructura de malla.

Material genético: las plántulas se obtuvieron a partir de semillas orgánicas certificadas de dos variedades de albahaca (Emily y Napoletano), de Seed Company (San Diego, CA, USA) con respuesta diferencial al estrés por NaCl.

Diseño experimental y tratamientos: se sembraron semillas en charolas de poliestireno de 200 pocillos con sustrato comercial inerte Sogemix PM^® (Canadá). Para mantener la humedad y lograr una emergencia homogénea, se aplicó riego diario hasta lograr la saturación del sustrato. Cuando las plantas alcanzaron una altura promedio de 10 cm, se trasplantaron en macetas de 150 ml con vermiculita como sustrato de soporte y una fracción de fibra de algodón absorbente, lo que se realizó durante los primeros días posteriores al trasplante para garantizar el contacto de las plántulas con el agua en el momento de colocarlas en un sistema hidropónico.

El sistema se acondicionó con cajas de poliuretano expandido de 69 × 38.5 × 25 cm y 38 L de capacidad, calibradas con agua de la planta potabilizadora en el CIBNOR con una conductividad eléctrica de 0.22 dS m^-1. Las macetas se colocaron en la tapa de la caja de poliuretano en pozos [con un diámetro de 4 cm] (seis por caja) para garantizar el contacto del sistema radicular con el agua. Para la nutrición de las plantas, se utilizó una solución nutritiva (1 L 100 L^-1 de agua) adaptada para la albahaca según ^{Samperio (1997}), ajustando el pH para garantizar un rango óptimo de 6.5 ±0.2 (^{Mazón-Suástegui et al., 2018a}).

Los tratamientos NaM-7CH y NaM-13CH fueron preparados en el CIBNOR a partir de Natrum muriaticum 6CH y Natrum muriaticum 12CH (Similia-México^®), que cuenta con registro oficial en la Secretaría de Salud de México como medicamento para uso humano (comprado a Farmacia Homeopática Nacional, CDMX, México). Su ingrediente activo inicial es la sal marina o sal de Guérande, cuyo componente principal es el NaCl, pero también contiene oligoelementos, como magnesio biodisponible, cloruro de potasio, hierro y calcio. Brevemente, para preparar las dinamizaciones de NaM 7CH y NaM 13CH, diluciones centesimales (1:99) en agua destilada y desionizada se agitaron vigorosamente en un equipo de vortex (BenchMixer^®, Edison, NJ, USA) durante dos min, aplicando procedimientos básicos de homeopatía para obtener sustancias ultradiluidas (^{Mazón-Suástegui et al., 2017}; ^{Ortiz et al., 2017}).

Se aplicó un experimento completamente al azar con un arreglo factorial (2A × 2B × 3C), considerando las variedades de albahaca (Napoletano y Emily) como factor A, los niveles de NaCl (0 y 75 mM) como factor B y las dinamizaciones homeopáticas de Natrum muriaticum (NM 7CH, 13CH y agua destilada sin tratamiento control) como Factor C, con un total de 12 tratamientos con cuatro repeticiones cada tratamiento.

La aplicación de los tratamientos de NaM comenzó el séptimo día posterior al trasplante y después de un período de aclimatación inicial, asperjando la parte aérea de las plantas con 150 ml por planta cada dos días y con agua destilada solo las del tratamiento control. Una vez que las plantas estaban completamente establecidas (15 días), la aplicación de los tratamientos estresantes de salinidad se inició gradualmente para evitar el shock osmótico (^{Murillo-Amador et al., 2007}). La aplicación inicio con 25 mM de NaCl y aumentó hasta la concentración esperada (75 mM).

Variables evaluadas: la tasa fotosintética (A, μmol m^-2 s^-1) se midió con un Sistema de Fotosíntesis Portátil LCpro-SD (IRGA) que incluía una cámara de hoja ancha (ADC, Hoddesdon, Herts, UK) en una hoja completamente turgente y sana, en días completamente soleados (tres mediciones) durante la semana previa al corte y en el momento de mayor radiación solar. A los 45 días del trasplante, se procedió a cortar y evaluar la biomasa determinando el peso fresco de la parte aérea (PFPA) en una balanza analítica (Mettler Toledo^®, modelo AG204, USA).

Para obtener el peso seco de la parte aérea (PSPA), todo el material fresco de cada planta se colocó en bolsas de papel, que se introdujeron en una estufa de secado (Shel-Lab^®, modelo FX-5, serie-1000203, USA) a 70 ° C durante 72 h para su deshidratación total y luego se pesaron en una balanza analítica (Mettler Toledo^®, AG204, USA) expresando el valor del material vegetal seco en gramos. Análisis estadísticos: Se realizaron análisis de varianza y comparaciones múltiples (DSH de Tukey, p≤ 0.05) con el programa Statistica v. 10.0 para Windows (^{StatSoft, Inc, 2011}).

Resultados y discusión

Los resultados revelaron diferencias significativas (p= 0.005) para la tasa fotosintética en la interacción variedades x concentración de salinidad (NaCl), corroborando el efecto negativo y estresante del NaCl en esta variable de respuesta. Se registró una disminución superior al 25% en esta variable para ambas variedades de albahaca cuando las plantas fueron sometidas a una mayor prueba de salinidad de 75 mM (Cuadro 1).

^{Reyes et al. (2017}) obtuvieron resultados similares cuando las plantas de arroz (Oryza sativa) fueron sometidas a estrés con 100 mM de NaCl. Otros autores encontraron una disminución en la actividad fotosintética de la mostaza (Sinapis alba) durante el cultivo bajo estrés por salinidad (^{Jamil et al., 2013}). Ambos estudios coincidieron en que la disminución significativa de la actividad fotosintética en plantas sometidas a estrés por salinidad podría explicarse en función del efecto osmótico asociado al cierre estomático; como consecuencia, mostró una disminución del CO₂ entrante a las células. No obstante, al analizar el efecto de la interacción variedades × NaM, se observó una respuesta diferencial con tendencia a aumentar la tasa fotosintética (A) cuando las plantas de albahaca fueron tratadas con el medicamento homeopático elicitor Natrum muriaticum.

Este resultado se obtuvo independientemente de la dinamización aplicada (NaM 7CH o NaM 13CH), pero la variedad Napoletano tratada con NaM 7CH registró el mayor aumento significativo (p= 0.008) en la tasa fotosintética (Cuadro 2). Este resultado podría explicarse por la presencia de nanopartículas o nanoestructuras moleculares del ingrediente activo en el tratamiento de NaM 7CH en ultradiluciones (^{Mazón-Suástegui et al., 2018a}).

Los resultados obtenidos confirmaron un principio básico de homeopatía ‘La Ley de Los Similares’ citado por ^{Mazón-Suástegui et al. (2018b} y 2018c), porque la misma sustancia (NaCl) homeopática ultradiluida tuvo un efecto elicitor y atenuante favorable del estrés por salinidad, mismo que se indujo experimentalmente con una dosis masiva de sal marina. La sal marina está constituida principalmente por NaCl, pero también contiene oligoelementos, como el magnesio (Mg), que juegan un papel crucial en la formación de la molécula de clorofila, que es el centro de acción directa de la reacción luminosa durante la fotosíntesis (^{Mazón-Suástegui et al., 2018a}).

Para la variable BFPA, los resultados mostraron diferencias significativas al analizar la interacción variedades × NaCl (p= 0.05), observando una disminución en ambos de más del 35% cuando se aplicaron 75 mM de NaCl (Cuadro 1). Esta respuesta fue determinada por el efecto de inhibición del NaCl en las plantas a nivel celular que causa toxicidad, lo que limita el correcto desarrollo metabólico, afectando también la división y elongación celular (^{Asghari y Ahmadvand, 2018}). Otra explicación aplicable podría ser la disminución de la tasa fotosintética observada bajo salinidad (75 mM) ya que las plantas tienen menos acumulación de biomasa y menos producción orgánica cuando experimentan una disminución en la fotosíntesis (^{Reyes et al., 2017}; ^{Sandoval et al., 2010}).

Al analizar la triple interacción de los factores de variedades × NaCl × NaM para la tasa fotosintética, se encontraron diferencias significativas (p= 0.01), observando un aumento de la variable (A) en plantas tratadas con ambas dinamizaciones de Natrum muriaticum, ultradiluidas a partir de sal marina (NaM 7CH y NaM 13CH), incluso cuando fueron sometidas simultáneamente a estrés mediante la adición de NaCl (Figura 1).

Figura 1 Efecto de la interacción variedades × NaCl × NaM en la tasa fotosintética de dos variedades de albahaca cultivadas en condiciones de estrés por salinidad. Letras diferentes muestran diferencias estadísticas significativas (p= 0.05). 

Este resultado confirmó la hipótesis de que NaM provoca y atenúa el efecto del estrés por salinidad en las plantas de albahaca como se describió anteriormente. Estos resultados podrían estar determinados por la activación de los mecanismos fisiológicos intrínsecos de la planta para la autodefensa cuando se enfrenta a condiciones de salinidad estresantes, ya sea como respuesta directa a las nanopartículas de sal marina o indirectamente ante la presencia de nanoagregados moleculares que desencadenan una serie de mecanismos de señalización en cascada que propician una respuesta positiva en los organismos tratados, citado por ^{Chikramane et al. (2010}); ^{García (2018}); ^{Mazón-Suástegui et al. (2018a}); Mazón-Suástegui et al. (2020a y 2020b); ^{Rodríguez-Álvarez et al. (2020}) y cuya transducción permite activar mecanismos que aún requieren más estudios, como las sustancias osmoprotectoras en las plantas (^{Batista-Sánchez et al., 2017}).

Al analizar la interacción variedades × NaM, se observaron diferencias significativas (p= 0.048) para BFPA, independientemente de la dinamización homeopática aplicada. Ambas variedades de albahaca registraron un aumento de esta variable en plantas tratadas con NaM 7CH y NaM 13CH, aunque la mejor respuesta correspondió a Napoletano con aplicación de NaM 7CH (Cuadro 2).

Este resultado podría explicarse porque esta variedad tiene la característica de una mayor tolerancia a la salinidad causada por el NaCl, ya que estudios previos de ^{Batista-Sánchez et al. (2017}) reportaron resultados similares al estudiar la interacción de los bioestimulantes naturales (FitoMas-E) en la germinación inicial de las plantas y el crecimiento de la albahaca sometida a diferentes concentraciones de NaCl. Este estudio confirma que la variedad Napoletano responde más fácilmente a los efectos negativos del estrés salino por NaCl, lo que puede estar determinado por su información genética, que garantiza un crecimiento más rápido de sus diferentes órganos, incluso en condiciones desfavorables.

La triple interacción variedades × NaCl × NaM mostró diferencias significativas (p= 0.05) para la variable de respuesta BFPA, que aumentó en ambas variedades de albahaca con la aplicación de NaM incluso cuando se encontraban simultáneamente en condiciones de estrés por salinidad (Figura 2). Este resultado confirmó la hipótesis de que el tratamiento con NaM tenía propiedades para mitigar el estrés por salinidad en plantas ya estresadas por la adición experimental de NaCl, lo que ya se discutió anteriormente.

Figura 2 Efecto de la interacción variedades × NaCl × NaM en la biomasa fresca de la parte aérea de las dos variedades de albahaca cultivadas en condiciones de estrés por salinidad. Letras diferentes muestran diferencias estadísticas significativas (p= 0.05). 

Los resultados de este estudio concuerdan con los encontrados por ^{Giardini et al. (2012}) al estudiar el efecto atenuante del estrés por salinidad de Natrum muriaicum (NaM) en tomate (Solanum lycopersicom), lo que también podría justificarse por la presencia de oligoelementos, como magnesio biodisponible, cloruro de potasio, hierro y calcio en cantidades traza, probablemente como nanopartículas o nanoagregados moleculares, citado por ^{Mazón-Suástegui et al. (2018a}) de estos elementos químicos y compuestos que constituyen el ingrediente activo original del medicamento homeopático oficinal Natrum muriaticum 6CH y 12 CH (Similia^® CDMX, México).

Por último, conviene destacar que estos oligoelementos, incluso a dosis mínimas, aunque medibles ponderables, juegan un papel importante en el desarrollo, crecimiento y productividad del tejido vegetal (^{Jeyasubramanian et al., 2016}). La BSPA fue significativa (p= 0.04) para las interacciones variedades × NaCl, con una disminución de esta variable en ambas plantas de albahaca estresadas con 75 mM de NaCl (Cuadro 1). El estrés por salinidad es uno de los factores esenciales que afectan la división y diferenciación celular en las plantas, que tienen como consecuencia menor producción y acumulación de biomasa, producto de la toxicidad de Na que favorece un desequilibrio nutricional y genera afectaciones directas al proceso fotosintético (^{Rahneshan et al., 2018}).

De acuerdo con el resultado producido por el análisis de la interacción variedades × NaM, se observaron diferencias significativas (p= 0.05), notando aumento de BSPA con respecto al control cuando se aplicó NaM 7CH (Cuadro 2). Por el contrario, no hubo diferencias significativas en esta variable para el tratamiento NaM 13CH con respecto al tratamiento control. En este caso, se podría argumentar que la dinamización 7CH contenía cantidades medibles del ingrediente activo original (sal marina) porque el factor de dilución aplicado (siete diluciones en serie 1:99) se encontraba debajo del límite establecido por el número de Avogadro, mientras que la dinamización 13CH se encontraba justo por encima de ese límite. Sin embargo, se ha comprobado que las especies marinas, como moluscos, camarones y peces obtienen beneficios medibles con la aplicación de medicamentos homeopáticos ultradiluidos más allá del límite de Avogadro (dilución en serie equivalente a 1×10^-23). Esto se explica en función de los nanoagregados moleculares que activan los mecanismos de respuesta en los individuos tratados (^{Mazón-Suástegui et al., 2017}; ^{2018 a}, ^b y ^c; ^{Ortiz et al., 2017}; ^{Rosero, 2017}; ^{García, 2018}; ^{Mazón-Suástegui et al., 2020a} y ^2020b).

Al analizar la triple interacción variedades × NaCl × NaM para BSPA, los resultados mostraron diferencias significativas (p= 0.041), de las cuales la que destacó fue un aumento de esta variable de respuesta en plantas cultivadas en condiciones de salinidad y tratadas con NaM (Figura 3). Este hallazgo fue positivo por las sustancias ultradiluidas de NaM para activar los mecanismos de defensa de las plantas de albahaca que enfrentan estrés temprano por NaCl debido a la presencia de nanopartículas o nanoagregados moleculares contenidos en las dinamizaciones homeopáticas; estas partículas fueron capaces de activar señales a nivel celular que identificaron condiciones de estrés y activaron mecanismos de defensa y adaptación que aún deben ser estudiados más a fondo.

Figura 3 Efecto de las interacciones variedades × NaCl × NaM en la biomasa seca de la parte aérea de dos variedades de albahaca cultivadas bajo estrés por salinidad. Letras diferentes muestran diferencias estadísticas significativas (p= 0.05). 

En este sentido, autores como ^{Zhu (2002}) sugirieron que las plantas podían identificar y percibir señales referidas al estrés, mismas que eran transducidas en las células y transmitidas, desencadenando una cascada de respuestas bioquímicas, fisiológicas y genéticas que permitían a la planta adaptarse a condiciones desfavorables o claramente estresantes en el entorno circundante. Esta respuesta adaptativa es posible cuando el cambio en tales condiciones es gradual, lo que depende de la especie y agente que modula la señal, pero siempre enfocado a mantener un equilibrio u homeostasis interna del individuo con respecto a las condiciones ambientales.

Conclusiones

La albahaca (Ocimum basilicum L. variedades Napoletano y Emiliy) en cultivo hidropónico sometido a estrés por salinidad mediante la adición de cloruro de sodio (NaCl), mostró una respuesta fisiológica diferencial para las diferentes variables de respuesta evaluadas, como la tasa fotosintética y la productividad en términos de biomasa vegetal fresca y seca de la parte aérea. Esta respuesta favorable también fue diferencial con respecto a la aplicación de dinamizaciones centesimales (7 CH y 13 CH) del medicamento homeopático Natrum muriaticum (NaM) para uso humano. En general, la aplicación de NaM 7 CH favoreció los resultados y los valores más altos en las variables de respuesta en condiciones de alta salinidad (75 mM). Este nanomedicamento homeopático mitigó los efectos negativos del estrés por salinidad inducido con NaCl en ambas variedades (Napoletano y Emily) de albahaca (Ocimum basilicum L.), pero la mayor respuesta con respecto al tratamiento control se obtuvo con NaM 7CH en la variedad Napoletano.