Material experimental

La investigación se llevó a cabo con 14 genotipos de melina, que forman parte de la colección genética del Inisefor. Se evaluaron 10 plantas por clon, para un total de 140. Los genotipos fueron reproducidos a partir de jardines clonales de la colección genética de la misma institución.

Determinación de la cantidad de clorofila y nitrógeno

Se estimó la cantidad de clorofila a partir de dos métodos:

1) Determinación mediante un medidor portátil: las lecturas se realizaron con el medidor Minolta SPAD ^® 502 en una hoja de cada una de las 140 plantas evaluadas, sobre el primer par nuevo con pleno desarrollo que no exhibieran daño. Por hoja se tomaron cinco lecturas en distintas partes, una en el centro y las restantes cuatro en su contorno, de tal forma que abarcara la mayor parte del área foliar (10 cm² en promedio); dichas mediciones las promedia automáticamente el equipo, con lo que se registró un solo dato por muestra. Las mediciones se hicieron durante el día.

2) Determinación en laboratorio: las hojas sobre las cuales se realizó la lectura del medidor portátil fueron marcadas para su identificación y seccionadas de las plantas. De cada una se extrajo un disco de 1 cm de diámetro con un peso promedio de 0.6 ± 0.01 mg, que posteriormente se maceró en un mortero con ayuda de un pistilo y 5 mL de etanol al 90 %. El contenido del mortero se transfirió a tubos de 50 mL, los cuales se centrifugaron a 2 000 rpm durante 5 minutos. Del sobrenadante se tomaron 1.5 mL para medir las absorbancias en el nanofotómetro Implen P300 con las siguientes longitudes de onda: 430, 470, 620, 665, 645, 647, 663, y 750. Por último, se determinaron las variables clorofila a, b y total, así como los carotenoides (mg L^-1) según ^{Lichtenthaler (1987)}; y el nitrógeno foliar mediante el método de Kjeldahl (^{Horneck y Miller, 1998}).

Análisis estadístico

Para calcular diferencias estadísticamente significativas para las variables evaluadas entre los genotipos, se practicó un análisis de varianza y una prueba de medias de Tukey (p>0.05) para la base de datos procedentes del laboratorio y del medidor portátil.

Se aplicó una prueba de correlación de Pearson entre las lecturas de clorofila obtenidas a partir del medidor portátil (unidades SPAD) y las determinadas en el laboratorio (mg L^-1), tanto de clorofila como de nitrógeno para todos los individuos (n = 140) y para cada uno de los clones (n = 10). Posteriormente, se agruparon los resultados en tres subconjuntos clonales según su nivel de correlación en alta (≥0.61), media (0.31≤r≤0.60) y baja (r≤0.30).

Finalmente, se efectuó una prueba de correlación de Pearson entre la clorofila en vivero y las variables dasométricas de crecimiento de los genotipos muestreados en el campo a un año de edad, plantados en un ensayo genético donde están presentes los 14 genotipos. Las variables dasométricas consideradas fueron las siguientes:

Diámetro a la Altura del Pecho (DAP) = 1.30 m para cada árbol, con una cinta diamétrica Forestry Suppliers

Altura Total (HT) = a partir de la lectura del clinómetro Suunto Pm5/15-20 m

Volumen Total (VT) = ((DAP/100)²)*0.7854*HT*0.65

Para los análisis estadísticos se utilizó el programa estadístico InfoStat versión 2015 (^{Balzarini et al., 2008};^{InfoStat, 2015}).

Evaluación de la clorofila determinada mediante medidor portátil y en laboratorio

La clorofila registró un promedio para la especie de 21.51 unidades. ^{Ávila (2013)}, en la misma región y edad de los individuos, obtuvo un promedio general de clorofila de 23.57 unidades SPAD para material clonal de melina, dato que respalda los resultados aquí documentados.

Los resultados anteriores (Cuadro 1) revelan una relación potencial de 10:1 entre el valor promedio de clorofila del medidor portátil con su similar procedente del laboratorio (unidades SPAD vs mg L^-1). Por lo tanto, es factible predecir el contenido de clorofila que revela el análisis de laboratorio, a partir de la lectura en las unidades del SPAD, aunque se necesitan más estudios al respecto para corroborarlo. Dicha factibilidad ha sido consignada por varios autores para especies como Acer saccharum Marshall (^{Van den Berg y Perkins, 2004}), Betula pendula Roth (^{Uddling et al., 2007}), Lindera melisifolia (Walter) Blume (Hawkins, 2009), Bombacopsis macrocalyx (Ducke) A. Robyns., Eugenia cumini (L.) Druce, Iryanthera macrophylla (Benth.) Warb. y Senna reticulata (Willd.) H. S. Irwin & Barneby (^{Gonçalves et al., 2008}), Platanus occidentalis L., Liquidambar styraciflua L., Fraxinus pennsylvanica Marshall y Populus heterophylla L. (^{Chang y Robinson, 2003}).

El clon 5 registró el valor más destacado de clorofila total (Chl-T) en laboratorio y campo (SPAD) (Cuadro 1) y resultados altos de clorofila a (Chl-a) y clorofila b (Chl-b). Esto supone una mejor capacidad para captar la energía lumínica, con lo que se podría maximizar el proceso fotosintético y, eventualmente, expresarlo con un crecimiento más rápido en condiciones naturales (^{Richardson, 2002}; ^{Rakocevic, 2005}; ^{Ávila, 2013}; ^{Díaz, 2014}; ^{Ávila et al., 2015}). Además, según ^{Umazi et al. (2016)} los árboles con mayor contenido foliar de clorofila muestran mejor crecimiento, lo que aumentaría su resistencia al intemperismo.

El caso contrario se verificó con el clon 3, que alcanzó el valor promedio menor de clorofila SPAD, Chl-T, Chl-a y Chl-b, lo que representa una desventaja para su desarrollo en campo, ya que la cantidad de radiación solar absorbida por una hoja es, en gran parte, una función de las concentraciones foliares de pigmentos fotosintéticos; por lo tanto, bajo esta condición, se puede limitar directamente el potencial fotosintético y, con ello, la producción primaria (^{Umazi et al., 2016}).

De la misma manera, las diferencias clonales en la concentración foliar de N en las que el clon 12 tuvo el mayor promedio (3.64 %), el clon 1 registró el más bajo (2.00 %). La concentración de nitrógeno se asocia de forma directa a variaciones en la capacidad fotosintética de la hoja y, finalmente, a la productividad y desempeño de los genotipos (^{Mattsson, 1996}; ^{Richardson, 2002}; ^{Corcuera et al., 2005}; ^{Ávila et al., 2015}).

Más allá del aspecto genético, los contrastes observados podrían explicarse con base en distintos factores como la calibración de los equipos y el grado de madurez de la hoja muestreada; a pesar de evaluar en todos los casos el primer par de hojas, no siempre fueron del mismo tamaño, ni desarrollo por las disimilitudes en la elongación del tallo entre clones. Al respecto, ^{Silla et al. (2010)} consignaron interacciones significativas entre las lecturas generadas con un medidor portátil y la etapa de hoja para especies de Quercus; por ello, la interpretación de las lecturas debe limitarse a muestras de hojas con aspecto y condiciones semejantes (^{Puttonen, 1989}); entonces, es conveniente homogeneizar al máximo el material que será utilizado.

Por otra parte, la calibración de los medidores de clorofila está ligada a las diferencias en las propiedades ópticas y anatómicas de las hojas. El medidor es sensible a características como las venas de la hoja, su grosor y el contenido de humedad, por lo que se recomienda hacer múltiples evaluaciones a la misma hoja (^{Chang et al., 2003}; ^{Pinkard, 2006}; ^{Wang et al., 2009}).

La lectura no solo depende del contenido de clorofila, sino también de su distribución en la hoja, lo que a su vez está codeterminado por la disposición del cloroplasto en las células, que depende de las condiciones de luz y de su variación durante el día. Dado que el medidor portátil mide la transmitancia de la luz a través de la hoja, el movimiento de los cloroplastos dentro de ella influye también en las lecturas (^{Naus et al., 2010}). Por lo tanto, se ratifica la importancia de contar con una metodología estandarizada para la utilización del medidor portátil en la obtención de un valor confiable de clorofila para la especie en cuestión.

Se verificó una diferencia entre la cantidad de Chl-a y Chl-b para cada uno de los clones evaluados, con una relación muy cercana de 3:1, lo cual coincide con valores para otras plantas superiores (^{Mustafa et al., 2015}). ^{Chazdon y Montgomery (2002)} indican que la proporción de los diferentes tipos de clorofila constituye una adaptación a la cantidad de luz recibida. Las especies heliófitas contienen mayor contenido de clorofila “a” que “b”. Melina se ubica dentro de tales especies, lo que le da validez al resultado obtenido en la presente investigación.

Diferencias entre genotipos para clorofila SPAD y laboratorio

Se registraron diferencias estadísticamente significativas entre clones para todas las variables evaluadas (p< 0.05) (Cuadro 1). La clorofila obtenida mediante el medidor portátil presentó la mayor cantidad de ellas entre clones, contrario a la clorofila b. Los clones 3 y 5 alcanzaron promedios extremos (17.32 y 25.45 unidades SPAD, respectivamente).

Para todos los valores de clorofila y nitrógeno, tanto de laboratorio como del medidor portátil, se configuró un patrón de tres grupos. El primero, con los genotipos superiores; un segundo grupo amplio que comparte valores intermedios entre sí, y el tercero conformado por los clones con los valores promedio más bajos.

Tal patrón de grupos es resultado de la variabilidad entre genotipos; no obstante, llama la atención el integrado por los clones 3 y 9 con contenidos de pigmentos tan reducidos, a pesar de los crecimientos en campo sin diferencias estadísticamente significativas, comparados con los demás genotipos. Para este caso en particular, los valores de clorofila podrían deberse, en primera instancia, a que las hojas evaluadas tenían distinto grado de madurez, en relación con los demás, lo que se explica porque todos los genotipos no tienen la misma velocidad en el desarrollo y maduración de sus hojas (^{Silla et al., 2010}). Este es un aspecto metodológico que se debe tomar en cuenta en futuros estudios; y en segunda instancia, una afectación por factores ópticos, lo que es factible que influya directamente en los contenidos de los pigmentos.

Las diferencias entre clones para cada una de las variables evaluadas se ilustran en la Figura 1. Al igual que se deduce del Cuadro 1, la lectura de clorofila con el SPAD exhibe el mayor número de diferencias entre clones; los clones 3 y 9 se ubican hacia la derecha de los gráficos de clorofila con los valores más bajos.

A) Clorofila SPAD; B) Chl-T= Clorofila total; C) Chl-a= Clorofila a; D) Chl-b= Clorofila b; N= Nitrógeno foliar; E) Car-T.

Figura 1 Valores promedio de contenido de clorofila y caroteno en clones de Gmelina arborea Roxb. 

Intentar predecir el contenido de clorofila de las plantas mediante evaluaciones sencillas, necesariamente, implica confiabilidad en las mediciones realizadas sobre las variables predictoras; por eso, es importante observar la posición que ocupa cada clon por variable y la posible correlación entre ellas. Identificar los subconjuntos de genotipos evidencia su variabilidad genética y la posibilidad de generar modelos de predicción.

Diez genotipos mantuvieron una tendencia estable en cuanto a su posición para ambas variables (Figura 2), lo que sugiere que la medición con SPAD tiene una relación lineal, o directamente proporcional, con el dato de clorofila generado en laboratorio, ya que presenta la misma (o muy similar) ordenación, con base en su promedio.

Figura 2 Posición de los clones por promedio de clorofila total obtenida con SPAD vs laboratorio. 

La identificación de esos tres subconjuntos sugiere dos hipótesis. La primera se refiere a que es posible descartar el uso de ciertos genotipos debido a sus bajos valores de pigmentos fotosintéticos; y la segunda, que las lecturas de clorofila en melina mediante medidores portátiles son confiables.

Posibilidad de predicción en la lectura de clorofila en laboratorio a partir del SPAD

Una lectura confiable de la cantidad de clorofila, a partir de una medición sencilla como la realizada con el equipo SPAD ^®, resulta de gran utilidad en los programas de investigación y mejoramiento genético forestal. Para la presente investigación, casi todas las correlaciones fueron positivas y superiores a 0.50, a excepción de la registrada entre SPAD y Chl-b (debido a la dificultad de generar el valor de Chl-b, explicado anteriormente) (Cuadro 2). En lo que respecta a Chl-b, otros autores han descrito un patrón similar; así, ^{Gonçalves et al. (2008)} registraron una correlación más baja entre Chl-b - Chl-T, en comparación con las obtenidas entre Chl-a y Chl-T. En el Cuadro 3 se ordenan los valores de correlación entre las variables evaluadas por cada genotipo.

Con base en los resultados de todas las plantas evaluadas para la especie, el contenido de clorofila determinado por SPAD tuvo una correlación de 0.53 con la clorofila total obtenida en laboratorio, la que es considerada como moderada para las especies forestales. En su estudio con Acer saccharum, ^{Van den Berg y Perkins (2004)} calcularon una correlación de 0.76 entre clorofila de lectura con SPAD y clorofila total. De la misma manera, ^{Silla et al. (2010)}, para tres especies de Quercus, registraron correlaciones de 0.58 a 0.83 entre las mismas variables. No obstante, ninguno de los anteriores taxa presenta un comportamiento de heliófita total, similar al de la melina.

La lectura de clorofila del SPAD tuvo una correlación con Chl-a superior a Chl-T, lo que sugiere que la correlación tan baja entre SPAD y Chl-b (0.31) afectó de manera significativa la correlación SPAD - Chl-T; dicho resultado confirma que la determinación en laboratorio de los valores de Chl-b para G.arborea debe ser afinada, al mostrar una variabilidad importante que amerita una lectura más minuciosa de dicho pigmento. Esta identificación de correlaciones significativas entre variables, resulta vital como aspecto adicional en la posibilidad de predecir de manera temprana su desempeño en campo, lo cual es el objetivo final de la presente investigación. De la misma manera, dicha información actuaría como un indicador de la salud y el rendimiento fisiológico de los distintos materiales vegetales (^{Neufeld et al., 2006}; ^{Gonçalves et al., 2008}; ^{Wang et al., 2009}; ^{Silla et al., 2010}; ^{Díaz, 2014}; ^{Umazi et al., 2016}). Todo lo anterior permitiría identificar los genotipos que se deben utilizar en sistemas de producción forestal intensiva (^{Mattsson, 1996}; ^{Ávila, 2013}).

El clon 8 registró los valores de correlación más altos en la mayor parte de las variables; caso contrario, el clon 16, los más bajos. Se obtuvo un comportamiento homogéneo para el clon 3, con grandes correlaciones (r≤0.60) para todas las variables evaluadas (Cuadro 3). Lo anterior permite establecer una línea base para comparación, que podrá ser un punto de referencia en la búsqueda de parámetros para la posible selección temprana de genotipos superiores; no obstante, estas variables son solo algunas de las posibles para seleccionarse.

Los clones se clasificaron en tres grupos, con base en los valores de correlaciones individuales (Cuadro 4).

Los clones 8, 10, 3, 11 y 9 se correlacionaron, principalmente entre SPAD y CHl-T, catalogadas como altas, mientras que para el 1, 12, 13 y 16 fueron bajas (<0.30). La identificación de dichos grupos sugiere que existe una variabilidad marcada entre genotipos, la cual de inicio puede explicarse por diferencias en el grado de madurez y lámina en las hojas evaluadas de cada planta, en el momento de tomar la medición. ^{Calvo et al. (2008)}, ^{Crespo et al. (2011)}, ^{Rojas et al. (2012)} y ^{Umazi et al. (2016)} coinciden en atribuir la variabilidad en el contenido de clorofilas o carotenoides, a situaciones de estrés hídrico; sin embargo, esto no sería extensivo a la presente investigación, al asegurarse homogeneidad en las condiciones experimentales en las que se desarrollaron todos los genotipos durante el periodo de evaluación (^{Puttonen, 1989}; ^{Mattsson, 1996}; ^{Rojas et al., 2012}).

Correlación tipos de clorofila vs desarrollo en campo

Las correlaciones joven - adulto; es decir, las que se basan entre variables evaluadas a edades tempranas y en campo son una herramienta muy valiosa para la selección de materiales vegetales que podrían expresar características deseables en una plantación a nivel productivo. El análisis realizado a todos los individuos indica que las correlaciones entre Chl-T y SPAD con las variables dasométricas (de crecimiento) en campo a un año de edad resultaron ser muy bajas, sin superar 0.19 (Cuadro 5). No obstante, a pesar de no lograr vincular estadísticamente el desempeño en campo a partir de los tipos de clorofila, este resultado tiene gran importancia, ya que es un primer intento de explicar la variabilidad de parámetros de campo de manera muy temprana, a partir de dichos niveles en las plantas bajo condiciones de vivero.

Resultados similares se han obtenido en estudios retrospectivos para selección temprana, generalmente con correlaciones muy bajas (^{Harfouche, 2003}; ^{Ávila et al., 2016}). Dichos autores señalan varias razones para explicar esta situación. A partir de la interacción genotipo-ambiente, los contenidos de clorofila pueden afectase por la temperatura, irradiación solar y estrés hídrico.

^{Jansson (1998)} suma a las anteriores explicaciones, que diversos conjuntos de genes regulan el crecimiento en diferentes edades, por lo que la edad de las plántulas utilizadas en la medición de vivero pudo no haber sido la necesaria para generar la inferencia vivero- campo. Lo anterior es ratificado por distintos autores, al concluir que las plántulas deben alcanzar una etapa de desarrollo mínimo para que los rasgos juveniles se conviertan en un criterio de selección confiable (^{Erickson et al., 1993}; ^{Rojas et al., 2012}). La cantidad de material evaluado, también se ha señalado en la literatura como una posible razón que incide las correlaciones juvenil-adulto (^{Puttonen, 1989}). Todo lo anterior debe considerarse en el planteamiento metodológico de próximas investigaciones.

De la misma manera que en las evaluaciones anteriores, se identificaron clones con correlaciones muy bajas (Cuadro 6), lo cual pudo afectar la base de datos general y explicaría las correlaciones bajas de clorofila y crecimiento, en general determinadas para la especie.

Cuadro 6 Matriz de Correlación de Pearson entre la lectura de clorofila del SPAD y las variables dasométricas en plantación a un año de edad, para cada uno de los clones evaluados de Gmelina arborea Roxb. 

DAP = Diámetro a la Altura del Pecho; HT = Altura total; VT = Volumen total. Significativo = p ≤ 0.05.

Los clones 12 y 10 alcanzaron las correlaciones más altas entre el SPAD - DAP y SPAD - HT; los clones 1 y 8 presentaron valores medios para las mismas correlaciones, y los genotipos restantes, valores muy bajos entre la lectura del SPAD y todas las variables dasométricas (<0.18).

Este nuevo patrón de agrupamiento de genotipos condujo a una estratificación según el nivel de correlación entre SPAD y Volumen Total (VT), en alta (x>0.60), media (0.30>x<0.60) y baja (x<0.30). El patrón identificado sugiere que los genotipos se comportan con tendencia grupal. Los resultados de la prueba de correlación, por separado para cada uno de los grupos determinados anteriormente, se presentan en el Cuadro 7.

Se registraron clones con alta correlación del SPAD con el DAP y VT (clones 10 y 12). Este resultado sugiere la posibilidad de que exista una relación entre los contenidos de clorofila en vivero y las variables de crecimiento en campo, que aporten como un aspecto más en la selección temprana de clones. Sin embargo, se debe tener cuidado en la interpretación de dichas correlaciones, ya que es necesario establecer parámetros específicos para cada especie (^{Mattsson, 1996}).

A excepción del tercer grupo de clones, el valor siempre fue superior a 0.30 para las correlaciones entre clorofila y las variables dasométricas; las correlaciones bajas se pueden explicar por la débil expresión genética a nivel de plántulas en vivero vs su desempeño en plantación (^{Ávila, 2013}). El número de clones evaluados también influyó en la estimación de las correlaciones, así como lo mencionado respecto a la interacción genotipo - ambiente, incluso a nivel de micrositio (^{Puttonen, 1989}; ^{Mattsson, 1996}). Algunos estudios que se han realizado en condiciones de ambiente controlado (^{Mattsson, 1996}; Karisson et al., 2002; ^{Jansson et al., 2005}), así como en combinaciones de rasgos juveniles en la medición de vivero (^{Jansson et al., 2005}), evidencian incrementos en las correlaciones con el desarrollo en campo. Por su parte, ^{Jansson et al. (1998)} sugieren la necesidad de llevar a cabo investigaciones genómicas, para identificar los genes que regulan el crecimiento de juveniles y adultos. Lo anterior ratifica la complejidad de intentar predecir el comportamiento de los genotipos en campo, a partir de la identificación en primera instancia de variables - parámetros - indicadores confiables (^{Mattsson, 1996}).