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Introducción
La producción de carne de pollo es una práctica pecuaria que utiliza diferentes estrategias para cubrir la creciente demanda del consumidor. Por lo que una estrategia es el uso de promotores de crecimiento ya sea de origen natural o sintético, con el fin de acelerar los procesos de crecimiento, aumentar la producción de carne y reducir los costos de alimentación (Peña-Torres et al. 2022). Sin embargo, las dosis y los periodos de retiro de estos compuestos son ineficientes y los residuos pueden encontrarse en carne y vísceras y pueden ser un riesgo para la salud humana (Rivera-Alegría et al. 2018). Entre los compuestos utilizados como promotores de crecimiento en pollos se encuentra el acetato de trembolona, zeranol y dietilestilbestrol (DES), entre otros (Hirpessa et al. 2020). Estas hormonas se definen como mensajeros químicos de origen natural o sintético que coordinan las actividades en células blanco (Qaid y Abdoun 2022). En este sentido DES, zeranol, y acetato de trembolona, son compuestos con actividad anabólica del grupo de los estilbénicos y no estilbénicos con propiedades fisiológicas análogas a los esteroides sexuales naturales. Sin embargo, se han detectado efectos fisiológicos negativos como hiperestrogenismo, reducción de fertilidad, trastornos en el desarrollo, inclusive se han catalogado como potenciadores de cáncer, específicamente cáncer de mama y útero (Tan et al. 2020). Otro reporte indica una relación directa del dietilestilbestrol con la prevalencia a la aparición de adenocarcinoma en vagina y cérvix, además de otras patologías relacionadas (White et al. 2022). Como antecedente, en 1989, la Unión Europea prohibió el uso de anabólicos en animales productivos de carne y huevo con el propósito de preservar la seguridad e inocuidad alimentaria; por su parte en América se utilizan de forma rutinaria los compuestos como testosterona, acetato de trembolona y zeranol, apoyados de normas oficiales que indique los límites máximos permitidos en carne y vísceras (Orihuela y Ungerfeld 2020). Por lo que es recomendable evaluar la presencia de hormonas, conocer los límites de seguridad y establecer los riesgos que ocurren por la ingesta de carne y/o vísceras de animales tratados con hormonas de tipo esteroideo y otras sustancias para proteger al consumidor (Suleman et al. 2022). Con base a lo anterior, el objetivo de este trabajo de investigación fue identificar la presencia y concentración de las hormonas Dietilestilbestrol (DES), zeranol y acetato de trembolona en muestras de pechuga de pollo de origen local e importado por ensayo inmunoenzimático.
Materiales y métodos
Se tomaron 144 muestras al azar de pechuga de pollo congeladas con una fecha de empaque de máximo 3 días; donde 72 fueron de origen nacional y 72 de Estados Unidos. Los supermercados fueron seleccionados a través de un muestreo por conveniencia, considerando aquellos establecimientos que tuvieran en existencia pechuga de pollo de origen nacional y estadounidense. Además, se seleccionaron los supermercados más cercanos al laboratorio de estudio para un rápido traslado y almacenamiento. Una vez trasladadas las muestras al laboratorio se congelaron a-18 °C hasta su análisis. El cálculo de tamaño de muestra se obtuvo a partir de la fórmula descrita por Villavicencio (2017) a un nivel del 95% de confianza; obteniéndose un número de muestra de 68.
Extracción
Las pechugas se colocaron a 4°C, 24 horas antes del análisis. La metodología de extracción se realizó de acuerdo con el protocolo de Ridascreen®. Para zeranol se homogeneizaron aproximadamente 10 g de muestra y se tomó 1 g para transferirla a un tubo de ensayo con 4 mL de acetonitrilo y se agitó en vortex hasta que la solución fuera una emulsión homogénea, posteriormente se centrifugó a 2 500 g por 10 min. El sobrenadante se colocó en un tubo de 50 mL y se evaporó la fase líquida con nitrógeno, consecuentemente se agregó 100 µL de metanol al 100% y se agitó por 1 min para finalmente obtener una alícuota de 50 µL.
Para la extracción de acetato de trembolona se homogenizaron 10 g de muestra con 10 mL de buffer PBS 67 mM, posteriormente se agitó 5 min en vórtex y se tomaron 2 g de la muestra para homogenizar con 5 mL de terbutilmetiléter, se centrifugó por 10 min a 3 000 g a 10 °C; después se realizó el mismo proceso de extracción con 5 mL de terbutilmetiléter y finalmente se evaporó con nitrógeno y se disolvió la muestra en 1 mL de metanol al 80% y 2 mL de tampón PBS 20 mM.
Para extracción de DES se pesó 1 g de carne y homogenizó con 5 mL de acetato de etilo y centrifugó por 5 min a 4000 g, se tomaron 2.5 mL de la capa su perior y se trasladaron a un tubo nuevo para evaporar con nitrógeno, seguido se disolvió la muestra con 400 µL de metanol y se agitó con el vórtex por 10 seg, después se añadieron 600 µL de buffer tampón y se agitó en vórtex por 1 min, se centrifugó por 5 min a 4000 g y 50µL del extracto se diluyeron con 150 mL de solución buffer. Las muestras hidrolizadas de las tres hormonas se purificaron mediante la columna C18 de acuerdo con el protocolo de Ridascreen®.
La determinación cuantitativa de DES, zeranol y acetato de trembolona se realizó mediante el inmunoensayo en microplaca con el kit comercial de ELISA (Ridascreen®, R-Biopharm, Darmstadt, Germany) en los cuales los contenedores de la microplaca se encontraban recubiertos con la proteína conjugada para cada hormona en específico. Se tomaron 25 µL de muestra por duplicado y en la microplaca se adicionó en orden lo siguiente, la muestra, el anticuerpo de zeranol, acetato de trembolona o DES, un conjugado de anticuerpo marcado con en zima, el sustrato y el cromógeno, posteriormente se evaluó en el espectrofotómetro (ELISA Opsys MR- Dynex) a 450 nm de absorbancia. Para la estandarización se realizó una curva de calibración con concentraciones de 0.001, 0.003, 0.006, 0.009, 0.012, 0.015, 0.018 y 0.021 de la hormona a analizar la cual se midió a una absorbancia a 450 nm y se calculó la pendiente, y los resultados se expresaron en partes por billón (ppb).
Análisis de datos
Se realizó un análisis descriptivo de los datos, donde se evaluó la frecuencia de muestras con la hormona. Además, se analizó la normalidad de los datos bajo la prueba de Kolmogórov-Smirnov y una vez comprobada la normalidad de los datos, se realizó una prueba de hipótesis para dos muestras independientes donde se comparó la concentración de hormonas en pechugas de origen nacional e importado a un nivel de significancia del 95%. Todos los datos fueron analizados en el programa estadístico NCSS versión 2006.
Resultados y discusión
Zeranol se encontró presente en el 100% (n = 72) de las pechugas de pollo de origen nacional, y en la carne de origen importado se detectó en un 83.3% (n = 60) de las pechugas. Mientras que acetato de trembolona, se detectó una presencia en la carne de origen nacional e importado del 87.5% (n = 63) y 94.4% (n = 68), respectivamente (Tabla 1). Para la DES, no se detectó en ninguna de las muestras analizadas. Existe información sobre la evaluación de estos compuestos en pechuga de pollo. La presente investigación coincide con un estudio realizado por Ibrahim et al. (2018), quienes reportan la presencia de zeranol en el 100% de la carne de pollo en concentración inferior a las 2 ppb. Otro estudio realizado en carne de res y productos cárnicos en Turquía reporta la presencia de zeranol en el 100% de las muestras, trembolona en el 80% de las muestras, y DES en el 35% de las muestras (Nazli et al. 2005), lo que demuestra que, a pesar de las regulaciones internacionales y la prohibición en países de la Unión Europea, dichos compuestos se siguen utilizando de forma deliberada o clandestina en la producción animal. Mientras que Parmar et al. (2021), reportan que 2 o 3 meses después del implante de trembolona, los residuos aún estaban presentes en la carne. Otro estudio en un mercado de Egipto, en muestras de carne de hamburguesa de res y sus embutidos detectó zeranol con valores promedio de 0.37 ppb y acetato de trembolona en promedio de 0.14 ppb (Mehawed et al. 2021). Por ello, tomando en cuenta el presente estudio y las evidencias a través de diferentes países, la técnica de ELISA es efectiva para detectar de forma rápida y en ese sentido regular el uso y estudiar más a fondo la farmacocinética y farmacodinamia en la salud humana y animal.
Tabla 1 Porcentaje y frecuencias de muestras de residuos en carne de pechuga de pollo.
| Hormonas | %Nacional | %Importado |
|---|---|---|
| Zeranol | 100% (72) | 83.3% (60) |
| Acetato de Trembolona | 87.5% (63) | 94.4% (68) |
| Dietilestilbestrol | 0%(0) | 0%, (0) |
n =72.
Para las concentraciones de zeranol y acetato de trembolona en muestras de origen nacional e importado, no se encontraron diferencias estadísticas en las concentraciones de zeranol entre los grupos evaluados (p > 0.05) donde las medias fueron de 0.0124 y 0.0162 ppb para la carne de origen nacional e importado, respectivamente. Por otro lado, tomando en cuenta la presencia de acetato de trembolona en las muestras, la comparación de medias encontró una concentración significativamente mayor en las muestras de pechuga de pollo nacional respecto a la de Estados Unidos con medias de 0.006 ppb y 0.002 ppb, respectivamente (p < 0.05) (Figura 1).
Figura 1 Concentración de zeranol y acetato de trembolona en pechuga de pollo. a, b = Literales diferentes indican significancia estadística (P < 0.05). n = 72.
Con base a los resultados de concentración de hormonas, en los Estados Unidos se encuentra prohibido el uso de estilbenos, mientras que el zeranol se permite, siempre y cuando los residuos de tejido muscular no sobrepasen el valor máximo de 2 ppb (Widiastuti y Anastasia, 2020). Para las Normas Oficiales Mexicanas, se indica un límite máximo permitido de 0.05 ppm para zeranol y acetato de trembolona, lo cual es mayor a lo encontrado en el presente estudio y se podría establecer que las pechugas de pollos evaluadas de ambos orígenes cumplen con los límites permitidos por la norma en México, y son aptas para consumo humano (SG 1994). En el caso de DES, la norma mexicana no permite su uso a ninguna dosis y en los resultados del presente estudio cumplen lo regulado por la norma oficial (SG 1994). Como se muestra en los resultados para zeranol y acetato de trembolona, se obtuvieron valores inferiores a los niveles permitidos por las normas de la Comisión Europea y las Normas Oficiales Mexicanas. Sin embargo, la presencia de dichos compuestos sugiere que se debe continuar monitoreando y regulando el uso de zeranol y acetato de trembolona en la cría de animales, su control en la carne y derivados tanto en México como en el material de importación que llega desde Estados Unidos.
La carne y sus productos derivados forman un papel importante en la nutrición humana, por lo que se sugiere que deben ser inocuos y no contener sustancias perjudiciales para la salud humana o al menos cumplir con los límites establecidos por las entidades gubernamentales. Sin embargo, los agentes anabólicos que se usan con diferentes fines en la crianza de animales con fines zootécnicos, tienden a dejar residuos en carne y vísceras, por lo tanto, un consumo continuo de estos productos puede conllevar a la aparición de problemas en la salud del consumidor (Al-Amri et al. 2021). En este sentido, la Comunidad Económica Europea (CEE) desde 1985 prohibió el uso de compuestos anabólicos como aceleradores del crecimiento en animales destinados al consumo humano, mientras que la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) permite el uso regulado de algunas hormonas de origen natural como testosterona y estradiol y otras sintéticas como zeranol y trembolona (Qaid y Abdoun 2022). La Organización Mundial de la Salud estableció que los residuos de zeranol y acetato de trembolona no deben exceder de las 2 ppb en carne y 10 ppb en vísceras (Codex Alimentarius 2004).
Cabe reiterar que el uso de compuestos de tipo hormonal o cualquier derivado de estos está prohibido en la Unión Europea (Valenzuela-Grijalva et al. 2017). Esta prohibición está sustentada con evidencia científica sobre efectos negativos o nocivos a la salud por el consumo de productos hormonales como, el incremento de incidencia de cáncer de mama, cervicouterino y enfermedades reproductivas como el ovario poliquístico, hiperestrogenismo e infertilidad (Qaid y Abdoun 2022). En el caso de zeranol y sus metabolitos como zearalenona tiene un efecto carcinogénico y mayor incidencia a la proliferación de tumores en el lóbulo anterior de la glándula pituitaria, debido a las propiedades estrogénicas del zeranol (Ben-Jonathan 2019). También se reporta que el acetato de trembolona a dosis de 80 µg al día en ratones, tiene efecto negativo en el desarrollo gonadal y neurológico, además de la inhibición en la secreción de hormonas endógenas y la disminución de la formación de la vaina de mielina a nivel neurológico (Zhang et al. 2020). También, se reporta que existen efectos hormonales negativos del acetato de trembolona en deportistas como la reducción de los niveles de testosterona, se redujo el peso de los testículos, ovarios y úteros; atrofia de las células intersticiales testiculares; supresión de la actividad ovárica; ausencia de desarrollo glandular del endometrio uterino; y falta de desarrollo alveolar y secreción en las glándulas mamarias (Bhasin et al. 2021). Por otra parte, debido que dietilestilbestrol es potencialmente cancerígeno y no es metabolizado por el organismo, por ello se prohíbe su uso en animales de engorda y no se permite su presencia en los alimentos, debido que la exposición a esta sustancia en el organismo aumenta el riesgo de displasia de cuello uterino y de adenocarcinoma de células en la vagina y el cuello uterino (Saltos et al. 2019).
El método de ELISA, es una técnica rápida y práctica para la detección de residuos en alimentos y sus derivados, además que se encuentra recomen dada por la Unión Europea. Al respecto, Yin et al. (2020) evaluaron la eficacia de la técnica de ELISA en residuos de zeranol, β-zearalanol, α-zearalenol, β-zearalenol y zearalenone en carne de bovino; y detectaron la presencia de estos compuestos por debajo de los límites permitidos, y una adecuada eficacia ya que se reportaron correlaciones por encima de 0.98. En este sentido, los resultados son de importancia, ya que se brinda información sobre la presencia y concentración de hormonas a través de una técnica válida. El riesgo a la salud del consumidor al usar es tos fármacos en animales con fines zootécnicos está dirigido hacia la posibilidad que los residuos se encuentren presentes en el alimento y un riesgo mayor se podría considerar a que su actividad biológica pueda preservarse, inclusive si dicho alimento se somete a condiciones extremas de temperatura como la cocción o el freído (Darbre 2019).
El presente estudio se centró en probar técnica la detección y cuantificación rápida de hormonas en carne fresca bajo la técnica de ELISA, lo cual se cumplió, ya que existe poca información sobre métodos efectivos que evalúen la residualidad de hormonas específicamente en carne y productos cárnicos, además de ser costosas y de un procesamiento tardado para las empresas que lo solicitan. Con base a los hallazgos donde en el 100% de las muestras se detectó zeranol y un 87% de trembolona, muestra un probable riesgo de efectos secundario para el consumidor, por ello se recomienda seguir un monitoreo constante para la inspección sanitaria de la carne desde la granja hasta el sitio de venta, incluso de la carne proveniente de Estados Unidos. Adicionalmente, es de importancia fomentar una cultura de la concientización a las empresas, medianos y pequeños productores sobre los posibles efectos adversos de los promotores de crecimiento de origen sintético y con base a ello buscar alternativas naturales en producción animal como los fitoquímicos esto con la finalidad de resguardar la salud del consumidor y ofrecer productos inocuos al público.
