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Introducción
Varias líneas de evidencia sugieren que la 5-hidroxitriptamina (5-HT) o serotonina regula la función cardiovascular durante la embriogénesis y en la vida adulta1-3. La 5-HT es sintetizada por las células enterocromafines del intestino, es secretada a la sangre4 y almacenada en las plaquetas5. La 5-HT plasmática también puede ser capturada por las neuronas simpáticas6 y células endoteliales de los vasos sanguíneos7,8. El efecto que tiene la 5-HT en el sistema cardiovascular es complejo; por ejemplo, la 5-HT se ha relacionado con bradicardia o taquicardia, hipotensión o hipertensión, vasodilatación o vasoconstricción9-12, y en la fisiopatología de diversas enfermedades cardiovasculares asociadas con el incremento de los niveles de 5-HT plasmática, como en el síndrome carcinoide13,14, la enfermedad valvular15,16, las arritmias, la fibrilación auricular y el bloqueo auriculoventricular en pacientes que reciben inhibidores de la recaptura de 5-HT17,18. También se ha demostrado que la activación del receptor 5-HT2B en el corazón produce proliferación de fibroblastos y fibrosis subendocárdica16,17,19. Además, la 5-HT regula la actividad de los cardiomiocitos de ratas con insuficiencia cardíaca a través de los receptores 5-HT2A y 5-HT4; ambos inducen un efecto inotrópico positivo a través de la fosforilación de la cadena ligera de miosina20,21. Por otro lado, la liberación de serotonina por las plaquetas contribuye de manera importante en la regulación de los fibroblastos cardíacos, promoviendo su migración y diferenciación a través de la activación del receptor 5-HT2A22. Con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real e inmunohistoquímica se ha demostrado la expresión de los receptores 5-HT2B, 5-HT1B y 5-HT2C en las células intersticiales de las válvulas cardíacas en los humanos; estos receptores pueden ser activados por los niveles de serotonina plasmática16,23. Asimismo, se ha reportado la presencia de mastocitos productores de 5-HT y la expresión de la triptófano-5-hidroxilasa (TPH) durante la cardiogénesis24 y en las células intersticiales localizadas en las válvulas del corazón adulto25.
Todos estos datos interesantes plantean la pregunta acerca del origen de la 5-HT en el corazón. En los seres humanos, el miocardio contiene alrededor de 0.4 mg de 5-HT/g de tejido26, y su origen no está claro. Se ha sugerido que procede de la síntesis local por la TPH2 en los ganglios autónomos27 o que es capturada por el transportador de serotonina (SERT) de los depósitos plasmáticos. Sin embargo, hay evidencia de la presencia de TPH1 y TPH2, SERT y receptores serotoninérgicos 5-HT1B, 5-HT2A y 5-HT2B en ratas normales28 y con cardiomiopatía diabética29. Recientemente también se han reportado en corazones de humanos fallecidos por causas ajenas a enfermedad cardiovascular30. Por lo tanto, estos hallazgos, en conjunto, sugieren la presencia de un sistema serotoninérgico intrínseco que participa en la modulación autocrina y paracrina del funcionamiento del corazón en los humanos28-30.
Basándonos en estos hallazgos, el objetivo del presente trabajo fue determinar la expresión de TPH1 y TPH2, SERT y receptores serotoninérgicos 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT4 en los cardiomiocitos de la pared libre del ventrículo izquierdo y del septum interventricular de pacientes fallecidos por miocardiopatía dilatada (MCD) en comparación con controles.
Método
Se realizó un estudio transversal comparativo en seis bloques de tejido de la pared libre del ventrículo izquierdo (PLVI) y del septum interventricular (SIV) de pacientes fallecidos de MCD y seis que murieron de enfermedades no cardiovasculares. Las muestras de tejido fueron obtenidas de los archivos de patología del Hospital de Cardiología del Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social y del Hospital General de México, SSA. Al no existir antecedentes de un estudio similar en la literatura, el tamaño de la muestra se adecuó a la disponibilidad de los tejidos. Se obtuvieron cinco cortes de la PLVI y del SIV en cada uno de los bloques de tejido de cada grupo, con el objetivo de determinar las expresiones de TPH1 y TPH2, SERT y receptores serotoninérgicos 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT4 por inmunofluorescencia mediante anticuerpos específicos para cada una de las moléculas, las cuales fueron observadas y cuantificadas en un microscopio confocal invertido Nikon Ti Eclipse equipado con un sistema de imágenes AI, ambos controlados por el software NIS Elements v.5.50.
Inmunofluorescencia para TPH 1 y TPH 2, SERT, 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT4
Los cortes de los corazones, de 4 mM de grosor, fueron colocados en portaobjetos electrocargados. La desparafinación de los cortes se realizó en xilol y alcohol, y se hidrataron en PBS. Posteriormente se bloquearon con el bloqueador de fluorescencia (Blocking Flourescense Merk-Millipore, USA) por 30 minutos en cámara húmeda a 37 °C. Después, los cortes fueron incubados con los anticuerpos primarios monoclonales específicos para TPH1 (Gene Tex International Corp) y TPH2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), y policlonales para SERT (Chemicon, USA), 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT4 (Santa Cruz, Biotechnology Inc, USA), a una dilución de 1:500 en solución de bloqueo para fluorescencia. Al día siguiente, los cortes se lavaron con PBS-Tween al 0.1%, después se incubaron con Alexa Fluor 564 anti rabbit en una dilución de 1:500 por 2 horas. Al término, los cortes fueron montados con ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI (Life Technologies Corporation, USA), para la inmunofluorescencia, y después fueron analizados en un microscopio confocal invertido Nikon Ti Eclipse equipado con un sistema de imágenes AI, ambos controlados por el software NIS Elements v.5.50. Las imágenes se obtuvieron mediante un objetivo de 40× (aceite 1.3). Los colorantes utilizados fueron excitados de modo secuencial utilizando la línea de láser 405 nm (DAPI) y 564 nm (Alexa 564). La fluorescencia correspondiente fue adquirida en los rangos de 401-472 nm (DAPI) y 570-620 nm (Alexa 564), utilizando los conjuntos de filtros proporcionados por el fabricante. Las imágenes fueron analizadas mediante el programa NIS Elements v 5.50.
Métodos estadísticos
Las expresiones de TPH1 y TPH2, SERT y receptores serotoninérgicos 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT4 en la PLVI y el SIV se obtuvieron mediante la intensidad de fluorescencia de cada una de las moléculas en cada uno de los grupos. Primero se obtuvieron los promedios y las desviaciones estándar, y luego la intensidad de fluorescencia fue normalizada (IFN). Después, los grupos fueron comparados con la prueba t de Student, aceptando un nivel de significancia de p < 0.05.
Resultados
La figura 1 A muestra la expresión de TPH1 en los cardiomiocitos de la PLVI y el SIV en ambos grupos. La IFN de la enzima aumentó significativamente en ambas estructuras de los corazones con MCD en comparación a los controles (PLVI, p = 0.041, diferencia de medias (DM) −0.124 ± 0.063, p < 0.05; SIV, p < 0.0006, DM −0.277 ± 0.048, p < 0.001) (Fig. 1 B). Con relación a la expresión de la TPH2 que mostraron los cardiomiocitos en los corazones con MCD y los controles, se muestra en la figura 2 A. Nótese que la expresión de la TPH2 incrementó en ambas estructuras dilatadas al compararlas con las controles (PLVI, p = 0.0001, DM −0.231 ± 0.029, p < 0.001; SIV, p = 0.01, DM −0.111 ± 0.039, p < 0.05) (Fig. 2 B).
Figura 1 A: micrografías de cortes transversales de la PLVI (a,
control; b, dilatada) y del SIV (c, control; d, dilatado) que muestran
cardiomiocitos inmunorreactivos a TPH1. Las flechas señalan la
inmunorreactividad en el citoplasma. Escala 40×, 
20 μM. B: IFN
de la PLVI y del SIV. Cada barra corresponde a los promedios ± la desviación
estándar de cinco determinaciones en cada grupo. La diferencia entre grupos
se obtuvo por la prueba t de Student. *p < 0.05. ***p < 0.001.
Figura 2 A: micrografías de cortes transversales de la PLVI (a,
control; b, dilatada) y del SIV (c, control; d, dilatado) que muestran
cardiomiocitos inmunorreactivos a TPH2. Las flechas señalan la
inmunorreactividad en el citoplasma. Escala 40×, 20 μM. B: IFN
de la PLVI y del SIV. Cada barra corresponde a los promedios ± la desviación
estándar de cinco determinaciones en cada grupo. La diferencia entre grupos
se obtuvo por la prueba t de Student. *p < 0.05. ***p < 0.001.
La expresión del receptor 5-HT2A en los cardiomiocitos de la PLVI y el SIV en los corazones de ambos grupos se muestra en la figura 3 A. Como se puede ver en la figura 3 B, la IFN que mostró el receptor 5-HT2A fue significativamente mayor en ambas estructuras de los corazones con MCD en comparación con los controles (PLVI, p = 0.0027, DM −0.268 ± 0.070, p < 0.01; SIV, p = 0.02, DM −0.148 ± 0.067, p < 0.05). En la figura 4 A se muestra la expresión del receptor 5-HT2B en los corazones de ambos grupos; la IFN aumentó significativamente en los cardiomiocitos de ambas estructuras dilatadas en comparación con las controles (PLVI, p = 0.0001, DM −0.256 ± 0.037, p < 0.001; SIV, p = 0.01, DM −0.169 ± 0.058, p < 0.05) (Fig. 4 B).
Figura 3 A micrografías de cortes transversales de la PLVI (a,
control; b, dilatada) y del SIV (c, control; d, dilatado) que muestran
cardiomiocitos inmunorreactivos a 5-HT2A. Las flechas señalan la
inmunorreactividad en el citoplasma. Escala 40×, 20 μM. B: IFN
de la PLVI y del SIV. Cada barra corresponde a los promedios ± la desviación
estándar de cinco determinaciones en cada grupo. La diferencia entre grupos
se obtuvo por la prueba t de Student. *p < 0.05. **p < 0.01.
Figura 4 A micrografías de cortes transversales de la PLVI (a,
control; b, dilatada) y del SIV (c, control; d, dilatado) que muestran
cardiomiocitos inmunorreactivos a 5-HT2B. Las flechas señalan la
inmunorreactividad en el citoplasma. Escala 40×, 20 μM. B: IFN
de la PLVI y del SIV. Cada barra corresponde a los promedios ± la desviación
estándar de cinco determinaciones en cada grupo. La diferencia entre grupos
se obtuvo por la prueba t de Student. *p < 0.05. ***p < 0.001.
En la figura 5 A se muestra la expresión del receptor 5-HT4 en los cardiomiocitos de la PLVI y el SIV. La IFN del receptor en la PLVI no mostró diferencias significativas en ambos grupos; en cambio, el SIV dilatado tuvo un aumento significativo al compararlo con el control (p = 0.0023, DM −0.269 ± 0.065, p < 0.01) (Fig. 5 B). Y con respecto a la expresión de SERT en los cardiomiocitos de ambos grupos, se muestra en la figura 6 A. Se observó un aumento significativo de la IFN en la PLVI en los corazones con MCD en comparación con los controles (PLVI, p = 0.0022, DM −0.235 ± 0.059, p < 0.01) y no hubo diferencias en el SIV entre ambos grupos (Fig. 6 B).
Figura 5 A: micrografías de cortes transversales de la PLVI (a,
control; b, dilatada) y del SIV (c, control; d, dilatado) que muestran
cardiomiocitos inmunorreactivos a 5-HT4. Las flechas señalan la
inmunorreactividad en el citoplasma. Escala 40×, 20 μM. B: IFN
de la PLVI y del SIV. Cada barra corresponde a los promedios ± la desviación
estándar de cinco determinaciones en cada grupo. La diferencia entre grupos
se obtuvo por la prueba t de Student. **p < 0.001. NS: no
significativo.
Figura 6 A: micrografías de cortes transversales de la PLVI (a,
control; b, dilatada) y del SIV (c, control; d, dilatado) que muestran
cardiomiocitos inmunorreactivos a SERT. Las flechas señalan la
inmunorreactividad en el citoplasma. Escala 40×, 20 μM. B: IFN
de la PLVI y del SIV. Cada barra corresponde a los promedios ± la desviación
estándar de cinco determinaciones en cada grupo. La diferencia entre grupos
se obtuvo por la prueba t de Student. **p < 0.01. NS: no
significativo.
Discusión
El principal objetivo de nuestro estudio fue determinar la expresión de TPH1 y TPH2, SERT y receptores serotoninérgicos 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT4 en los cardiomiocitos de la PLVI y el SIV en corazones de pacientes fallecidos de MCD en comparación con corazones de pacientes que murieron por enfermedades no cardiovasculares. El presente trabajo confirma resultados previos observados en los cardiomiocitos ubicados en las estructuras de corazones normales en ratas y humanos que expresan ambas isoformas de la TPH, SERT y receptores serotoninérgicos 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT428,30, y los amplía a los cardiomiocitos de corazones con MCD. Es importante señalar que la PLVI y el SIV de los corazones con MCD mostraron un aumento significativo de las expresiones de ambas isoformas de la TPH y de los receptores 5-HT2A y 5-HT2B. El receptor 5-HT4 solo aumentó en el SIV y SERT en la PLVI en comparación con los corazones controles. El aumento de la expresión de las isoformas de la TPH en las estructuras dilatadas sugiere que los cardiomiocitos de estas regiones del corazón tienen la capacidad de sintetizar serotonina, la cual podría participar en la modulación autocrina y paracrina de la actividad de los cardiomiocitos30.
De la misma manera, los aumentos observados en las expresiones de los receptores 5-HT2A y 5-HT4 en los corazones con MCD sugieren que estos receptores podrían participar en la actividad eléctrica de los cardiomiocitos y en la regulación de la fuerza de contracción ventricular durante la evolución de la MCD, similar a lo reportado en un modelo experimental de insuficiencia ventricular aguda20. También en este estudio se observó un aumento significativo de la expresión del receptor 5-HT2B en ambas estructuras de los corazones con MCD en comparación con las estructuras cardíacas controles. Se ha demostrado que este receptor regula el desarrollo y las funciones cardíacas31,32, y existe evidencia de que su sobreexpresión en los cardiomiocitos de ratones induce una proliferación mitocondrial dentro de los mecanismos moleculares que se han propuesto en la transición de la hipertrofia de los cardiomiocitos a la insuficiencia cardíaca33-35, aspectos que comúnmente se presentan en fisiopatología de la MCD36,37. Además, también se demostró un aumento significativo de la expresión de SERT en la PLVI en los corazones dilatados en comparación con los controles. El aumento de SERT en los cardiomiocitos podría participar activamente en la dinámica entre la recaptura y el catabolismo de la serotonina en los corazones de los humanos con MCD2,3,38.
Conclusiones
Con la información disponible y los resultados obtenidos, podemos confirmar que la MCD causa importantes aumentos en la expresión de TPH, SERT y receptores serotoninérgicos en los cardiomiocitos en comparación con los cardiomiocitos controles. Por lo tanto, estos incrementos en conjunto podrían tener un papel importante en el desarrollo de la fisiopatología de la MCD en los humanos.
