Señalización celular y nanobiomoléculas

Nuestro laboratorio se dedica al estudio de las señales celulares. La transducción de señales es el conjunto de procesos o etapas que ocurren de forma concatenada, por el cual una célula convierte una determinada señal o estímulo exterior, en otra señal o respuesta específica. El proceso de transmisión de señal afecta a una secuencia de reacciones bioquímicas dentro de la célula. Esto se lleva a cabo a través de proteínas o enzimas unidas a otras sustancias llamadas segundos mensajeros. Los cambios en la concentración citosólica de Ca²⁺ han mostrado ser un sistema de señalización muy versátil. Este sistema regula varios procesos celulares diferentes como la motilidad, secreción y la proliferación celular, entre otros. Los cambios en la concentración intracelular de Ca²⁺ son detectados por las células como una señal con un significado que debe ser decodificado. Esta decodificación de la información contenida en las señales de Ca²⁺ es mediada por proteínas capaces de unir Ca²⁺ (sensoras de Ca²⁺) que transmiten esta información al blanco final. Como forma de garantizar la función de señalización del Ca²⁺, las células cuentan con varios sistemas de transporte de dicho ion, que regulan su homeostasis en forma muy precisa (^{Sotelo y Benech, 1997}). Uno de estos sistemas de transporte, son las llamadas bombas de Ca²⁺ (Ca²⁺Mg²⁺-ATPasas). Estas bombas son proteínas y por lo tanto nanoestructuras biológicas.

Trabajando con este transportador hemos obtenido aportes relevantes. Encontramos evidencias de que en ciertas condiciones experimentales, la bomba de Ca²⁺ puede comportarse como un canal de Ca²⁺ (^{Benech et al., 1991}, ¹⁹⁹⁵; ^{García-Teijeiro et al., 1999}). Caracterizamos el ciclo de reacciones de la Ca²⁺ ATPasa del sistema tubular denso de plaquetas humanas y mostramos que la estequiometría de esta SERCA (Sarco Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) es diferente a la SERCA de retículo sarcoplásmico de músculo esquelético de conejo (^{Benech et al., 1995}). También mostramos la capacidad de ciertas drogas de desacoplar la enzima y promover un aumento en el eflujo de Ca²⁺ pero sin síntesis de ATP (^{García-Teijeiro et al., 1999}).

Por otra parte, en colaboración con el Dr. J. R. Sotelo, hemos trabajado en aspectos metabólicos del sistema nervioso, especialmente en la síntesis proteica en el territorio axonal, sináptico y su regulación. En los, organismos eucariotas la síntesis de proteínas extra mitocondriales ocurre en nanoestructuras biológicas denominadas ribosomas. Éste es un tema de investigación muy interesante e importante, ya que en los últimos años han aumentado las evidencias de la existencia de ribosomas y polisomas activos en el dominio axonal y presináptico. De acuerdo con el dogma establecido en las células nerviosas todas las proteínas son sintetizadas en el soma de la neurona y luego transportadas por transporte axonal, al axón y al terminal nervioso (véase ^{Ochs, 1982}). Sin embargo, varios grupos de investigación (Dr. E. Koenig, Universidad de Buffalo, USA; Dr. A. Giuditta, Universidad de Nápoles, Italia; Dr. Jaime Álvarez, Universidad Católica de Chile), incluyendo el nuestro, han presentado evidencias muy convincentes que apoyan la existencia de un Sistema Local de Síntesis de Proteínas en axones y terminales nerviosas. En este sentido, hemos contribuido con varias publicaciones utilizando diversas técnicas como auto radiografía a nivel de microscopía óptica, inmunocitoquímica a nivel óptico y electrónico, inmunoprecipitación, Northern blot, RT-PCR, inmunoblot, etc. (^{Sotelo y Benech, 1997}; ^{Sotelo et al., 1999}; ^{Sotelo-Silveira et al., 2000}; ^{Calliari et al., 2002}). (Véase también ^{Koenig y Giuditta, 1999} y ^{Álvarez et al., 2000}).

Con respecto al terminal nervioso, al inicio de la década de los 90, se reportó que la fracción sinaptosomal obtenida del lóbulo óptico del calamar fue capaz de sintetizar proteínas extra-mitocondriales (^{Crispino et al., 1993}). Esta fracción fue caracterizada por técnicas bioquímicas y de auto radiografía a nivel de microscopía electrónica. Se encontró que la fracción corresponde al componente presináptico de las neuronas fotorreceptoras del lóbulo óptico del calamar, el cual contiene polisomas activos (^{Crispino et al., 1997}). La caracterización de la existencia de síntesis local de proteínas a nivel axonal y del terminal nervioso, nos llevó a estudiar posibles mecanismos de regulación y uno de los candidatos obvios era el Ca²⁺. En este sentido, en colaboración con el Dr. A. Giuditta comenzamos a estudiar la modulación del sistema local de síntesis proteica en los sinaptosomas preparados del lóbulo óptico del calamar. Observamos que este proceso estaba muy próximo de su máximo, a la concentración basal de Ca²⁺ citosólico y era marcadamente inhibida cuando la concentración de este ión era disminuida o aumentada (^{Benech et al., 1994}, ¹⁹⁹⁶, ¹⁹⁹⁷, ¹⁹⁹⁹). La posibilidad de que el Ca²⁺ module la síntesis local de proteínas sinaptosomal, fue confirmada midiendo la concentración de Ca2+ en un único sinaptosoma (Figura 1), previamente cargado con Fura-2-acetoximetil éster (FURA2 AM). Estos experimentos fueron realizados en colaboración con el Dr. E. Brown del Laboratorio de Neurobiología de la Estación Zoológica de Nápoles, Italia. En su estado de reposo, la concentración de Ca²⁺ fue de 80 nM (n=10). La adición de cafeína, tapsigargina y KCl, aumentaron la concentración de Ca²⁺ a 300 nM. Por otra parte, el quelante de Ca²⁺ BAPTA AM disminuyó la concentración citosólica de dicho ion a menos de 100 nM (^{Benech et al., 2000}). El conjunto de estos resultados sugiere que el rango de sensibilidad de modulación de la síntesis proteica local está en una “ventana” de Ca²⁺ entre 80 y 300 nM. Estos resultados sugieren que la nanomaquinaria de síntesis proteica eucariota (ribosomas) está presente a nivel presináptico. Los resultados también sugieren, que variaciones en la concentración del Ca²⁺ citosólico en el terminal presináptico, producto de la actividad neuronal, pueden contribuir a la modulación de la síntesis local de proteínas con importancia para procesos plásticos neuronales como la memoria o el aprendizaje. Por último, los resultados también sugieren la existencia de poblaciones de ARNm específicas a nivel del terminal nervioso, aspecto que llevó a interesarnos en el proceso de síntesis de ARN a nivel del núcleo celular y su regulación.

Figura 1 A: Microscopía láser confocal de un sinaptosoma típico obtenido del lóbulo óptico del calamar en agua artificial de mar (imagen de transmisión). B: Imagen confocal de fluorescencia del mismo sinaptosoma incubado previamente con Fluo-3. La señal de fluorescencia fue fijada al máximo con propósitos ilustrativos. Barra de escala, 2µm. 

En los últimos años, el papel del Ca²⁺ como segundo mensajero se ha expandido a una gran variedad de eventos, desde mecanismos celulares de transducción ya clásicos, como lo es el acoplamiento excitación-contracción en las células musculares, a fenómenos cognitivos tan complejos como el aprendizaje y la memoria. En este contexto, el núcleo celular se ha convertido en uno de los focos principales de investigación. En particular, cómo las señales de Ca²⁺ que se generan en el citosol pueden afectar fenómenos nucleares. Asimismo, de un tiempo a esta parte, se ha comenzado a concebir al núcleo como un organelo capaz de generar y mantener su propia homeostasis de Ca²⁺ con relativa independencia de las variaciones en el Ca²⁺ citosólico (Hardingham et al., 1997; ^{Itano et al., 2003}; ^{Echeverría et al., 2003}). En esta línea de investigación, estamos estudiando la señalización a nivel nuclear por Ca²⁺ y el proceso de transcripción (Figuras 2 y 3). Estamos utilizando como paradigma experimental núcleos aislados de hígado de rata y células en cultivo (cultivo primario de células miometriales humanas y de neuronas). Hemos encontrado la existencia de por lo menos 2 componentes de Ca²⁺ que afectan la síntesis de ARN: a) concentración de Ca²⁺ en el nucleoplasma en sí misma; b) calcio acumulado en el envoltorio nuclear en forma dependiente de la bomba de calcio SERCA presente en dicho envoltorio (^{Benech et al. 2002}, ²⁰⁰³ y ²⁰⁰⁵; ^{Escande et al., 2007 a}, ^b y ^c]. Hemos encontrado también, que la liberación de Ca²⁺ desde el envoltorio nuclear en respuesta a IP₃ fue capaz de promover la fosforilación del factor de transcripción CREB y que un aumento del Ca²⁺ nuclear a 500 nM, promovió la activación de la transcripción del ARNm de PGC1-á (^{Escande, tesis de maestría, 2007}). Esta proteína es un co-activador de la trascripción y en conjunto con CREB estimula la expresión de los mensajeros de PEPCK1 y G-6-Pasa, contribuyendo de esta forma a la regulación de la gluconeogénesis en hígado.

Imágenes microscopía confocal (C-E). Núcleos aislados fueron cargados con fluo-3, AM y tratados como descrito en (^{Benech et al, 2005}). (C) 1ìM Ca2+libre y 1mM ATP tiempo cero; (D) ìM Ca2+ libre y 1mM ATP a los15 minutos; (E) 1ìM Ca2+libre y 1mM ATP a los 15 minutos, pero con 5ìM thapsigargin. Barra de escala: 5ìm. Reproducido con permiso de Elsevier Ltd.

Figure 2 Carga de Ca2+ dependiente de ATP y sensibilidad a thapsigargin e ionomicina. Nucleaos aislados fueron incubados en un medio de reacción conteniendo: 1mM ATP, 20 ìM GTP, CTP, UTP, 80 mM KCl, 3mM NaCl, 5mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 5 mM oxalato de potasio y 1 ìM Ca2+ libre suplementado con 45Ca2+ (0.5 ìCi/ml). La concentración de Ca2+ libre fue calculada de las constantes de asociación aparentes Ca-EGTA de acuerdo con Schwartzenbach, usando un programa de computación como descrito por ^{Fabiato & Fabiato, 1979}. (A) Carga de calcio condición control (1ìM Ca2+ libre y 1mM ATP) (?), control más 10 ìM thapsigargin, TG ( ), o control más 2 ìM Ionomycin (¦, o 1ìM Ca2+ libre sin ATP (?). (B) Movilización del 45Ca2+ por EGTA. Se dejaron a los nucleaos aislados cargar 45Ca2+ por 15 min y luego se adiciono 0.5mM EGTA al medio de reacción. 

Figure 3 Modelo actualizado de señales de Ca²⁺ en el núcleo celular. 

En conjunto, estos resultados sugieren que el núcleo celular es capaz de generar y mantener su propia homeostasis de Ca²⁺. Variaciones en la homeostasis de Ca²⁺nuclear originadas en el propio núcleo celular, podría estar modulando procesos tan importantes como la transcripción.

Dendrímeros y músculo liso

Los dendrímeros son una clase única de vehículos nanoestructurados para la entrega de drogas y material genético a blancos intracelulares (^{Kolhe et al., 2003}; ^{Perumal et al., 2008}). Como agentes de entrega de drogas, los dendrímeros presentan ventajas como la monodispersión y la multivalencia (^{Perumal et al., 2008}; ^{Cho et al., 2008}). Se caracterizan por poseer un núcleo central y un gran número de grupos superficiales. Esto hace que moléculas pequeñas como drogas, enzimas o agentes de imagenología, puedan ser encapsulados o conjugados a los dendrímeros (^{Tassano et al., 2011}; ^{Hamoudeh et al., 2008}). Estos polímeros han mostrado ser capaces de producir altos niveles intracelulares de droga y por lo tanto tienen un gran potencial terapéutico [^{He et al., 2011}; ^{Perumal et al., 2008}). Asimismo, han demostrado un gran potencial como agentes de diagnóstico (^{Perumal et al., 2008}). Su interacción con las membranas celulares y su internalización celular parecen depender del tamaño, generación y grupos funcionales de superficie (^{Perumal et al., 2008}). En los últimos años, se han realizado varios estudios para evaluar los dendrímeros como transportadores de droga por vía oral [^{Sadekar y Ghandehari, 2012}]. Por otra parte, ha sido observado que los dendrímeros PAMAM de la generación 4 redujeron los niveles de glucosa en sangre en ratas diabéticas [^{Karolczak , K. et al., 2012}] y que dendrímeros modificados PAMAM-OH inhibieron la actividad de la Na⁺/K⁺ ATPasa y Ca²⁺ ATPasa de eritrocitos humanos (^{Ciolkowski et al., 2011}).

La interacción de los dendrímeros con las membranas celulares y la internalización celular parecen depender del tamaño, generación y grupos funcionales de superficie (^{Perumal et al. 2008}). Particularmente, los grupos funcionales superficiales pueden producir una densidad de cargas altamente localizada, que puede tener una influencia importante en la interacción del dendrímero con la membrana celular y su internalización celular.

Nuestro grupo de investigación está estudiando las posibles aplicaciones de los dendrímeros en enfermedades que involucran al músculo liso (como el parto prematuro) y el cáncer.

El parto prematuro es la causa predominante de morbilidad y mortalidad en recién nacidos. Los nanomateriales actualmente en estudio pueden resultar útiles en cuanto al desarrollo de nuevas terapias para tratar los problemas fisiopatológicos de la contracción del músculo liso miometrial (que conllevan al parto prematuro). Para el desarrollo de estas terapias, el conocimiento de los mecanismos de captación celular de los distintos nanomateriales empleados por diferentes tipos celulares, se vuelve primordial. En este sentido, nuestro grupo está estudiando los mecanismos de captación de un nanoconjugado en cultivos primarios de células miometriales humanas (CMH). El nanoconjugado, G4-FITC, fue obtenido al marcar dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) de la generación 4 (G4) con fluoresceína isotiocianato (FITC).

El nanoconjugado obtenido fue caracterizado usando HPLC, NMR y microscopía de fuerza atómica. La concentración de nanoconjugado empleada en los experimentos (7 µg/ml), mostró no afectar significativamente la viabilidad de las CMH hasta las 48 h. El análisis por microscopia láser confocal de CMH incubadas con G4-FITC mostró señal de fluorescencia a nivel perinuclear a partir de las 5 h o más (24, 36 y 48 h) de incubación. A las 24 h, G4-FITC co-localizó parcialmente con “Lysotracker” (Figura 4), un compuesto fluorescente capaz de marcar organelos acídicos en células vivas (lisosomas). Por otra parte, utilizando diferentes tipos de inhibidores de endocitosis y citometría de flujo, logramos identificar el mecanismo de ingreso del nanoconjugado a las CMH. De acuerdo con nuestros resultados, en CMH en cultivo, el G4-FITC estaría siendo captado por medio de endocitosis dependiente de clatrina. Esta conclusión, se basa en el hecho de que la clorpromazina (inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina), inhibió la captación de transferrina (control positivo de endocitosis mediada por clatrina) y G4-FITC de forma significativa. La filipina (inhibidor de la endocitosis mediada por caveolina), sin embargo, no mostró tener un efecto inhibitorio significativo en la captación de BODIPY-LacCer (control positivo de endocitosis mediada por caveolina) ni de G4-FITC. Es interesante destacar, que en CMH, nunca detectamos señal de fluorescencia del nanoconjugado caracterizado (G4-FITC) a nivel del núcleo celular. Sin embargo, cuando electroporamos CMH en presencia de G4-FITC, detectamos fluorescencia a nivel de algunos núcleos de CMH. Comprobamos experimentalmente que núcleos aislados de CMH incubados con G4-FITC presentaron señal de fluorescencia (Figura 5). Esta serie de resultados sugieren que los G4-FITC en CMH estarían siendo internalizados por endocitosis dependiente de clatrina, con localización lisosomal a las 24 h. Por otra parte, los resultados también sugieren que la electroporación modifica la distribución intracelular del G4-FITC en este tipo celular, pudiendo convertirse en una tecnología interesante para electrotransferir drogas al citosol o al núcleo de células de músculo liso (^{Oddone, N. et al., 2013}).

Figura 4 Co-localización parcial de G4-FITC y Lysotracker. Las HMC fueron incubadas por 24 h con G4-FITC y luego 1 h con Lysotracker. Las imágenes se obtuvieron por LCM. G4-FITC (A), Lysotracker (B), Merge (C). Magnificación: 180 x, las barras de escala indicando un tamaño de 10 µm. La longitud de onda de excitación fue de 488 nm y 543 nm para FITC y Lysotracker, respectivamente. Las imágenes fueron superpuestas mediante el software del sistema LCM para observar co-localización. 

Figura 5 El G4-FITC ingresa en núcleos aislados de HMC e hígado de rata. Los núcleos aislados fueron incubados por 1 h con G4-FITC y observados por LCM. Núcleos aislados de HMC: G4-FITC (A), DAPI (B), Merge (C). Núcleos aislados de hígado de rata: G4-FITC (D). Magnificación: 120 x. Las barras de escala indican un tamaño de 10 µm (imágenes a, b, y c). Magnificación: 100 x. Las barras de escala indican un tamaño de 20 µm (imagen d). 

Dendrímeros y cáncer

El efecto EPR (efecto del incremento de la permeabilidad y retención) se basa en las características fisiopatológicas únicas de los tumores sólidos, las cuales otorgan una ventaja al uso de nanopartículas como vehículos de agentes terapéuticos. Este efecto, surge como consecuencia de la angiogénesis extensa que resulta en la hiper-vascularización, drenaje linfático limitado y aumento de la permeabilidad a los lípidos y macromoléculas. Estas características, ayudan a asegurar el suministro adecuado de nutrientes para satisfacer las necesidades metabólicas de los tumores de crecimiento rápido (^{Heuser et al., 1986}; ^{Maeda et al., 2000}).

El abordaje experimental que emplea nanopartículas tradicionales polidispersas, como por ejemplo liposomas y polímeros convencionales, mostró serias complicaciones. Afortunadamente este problema (la capacidad de ajustar tamaños exactos y uniformes) puede ser abordado con éxito empleando dendrímeros, ya que es posible la selección de una entidad de tamaño exacto (^{Choi y Baker, 2005}). La capacidad de construir poblaciones monodispersas de dendrímeros en el rango de tamaño necesario para aprovechar el efecto EPR, es un paso alentador hacia la explotación de las propiedades tumorales como estrategia de captación pasiva de los dendrímeros. En un trabajo reciente de nuestro grupo (^{Tassano et al., 2011}), se logró marcar los dendrímeros PAMAM G4-FITC con el intermediario [^99mTc(CO)3(H2O)3]+ con una pureza radioquímica de ~90%. Desarrollamos un método de análisis por HPLC usando columnas C18 y encontramos que el compuesto fue estable por 24 horas. En ratones con melanoma inducido, observamos que el patrón de biodistribución del conjugado fue similar al encontrado en ratones normales. Sin embargo, a la hora post-inyección, observamos una alta captación del conjugado por parte del tumor. La captación tumoral, fue 4-10 veces mayor que la captación observada por la musculatura circundante, lo que permitió un buen contraste y la obtención de buenas imágenes centellográficas (Figura 6). La elevada captación por parte del tumor puede ser explicada por el efecto EPR descrito anteriormente. El análisis de las imágenes por microscopía confocal, mostraron que el ^99mTc(CO)3-dendrímero-FITC fue internalizado por las células del hígado y del tumor, con señal fluorescente detectada a nivel del citoplasma celular (Figura 7). Los estudios biológicos mostraron el potencial del compuesto desarrollado en la obtención de imágenes moleculares oncológicas (Tassano et al., 2011). Por otra parte, nuestro grupo estudió la biodistribución de ^99mTc(CO)3-dendrímero en otro modelo de tumor murino. Dicho estudio fue realizado en ratones Balb-c con tumor mamario inducido con células 4T1. La biodistribución empleando ^99mTc (CO) 3-dendrimero en ratón con tumor mamario fue similar a la observada en ratones normales, con una captación significativa, 1 h post-inyección. Los resultados están expresados en % actividad/g a los tiempos 1 h y 3 h, respectivamente. Se observó acumulación hepática (21.9 ± 3.4, 16.4 ± 3.3), renal (27.9 ± 10.2, 12.8 ± 0.9) y tumoral (1.39 ± 0.2, 0.77 ± 0.1). A nivel del tumor, el % actividad/g fue de 3-4 veces mayor que en el músculo circundante donde el % actividad/g fue: 0.4 ± 0.05 y 0.3 ± 0.2 a los tiempos 1 h y 3 h, respectivamente.

Figura 6 Imagen centellográfica de ratón normal (A) y ratón portador de melanoma (B) inyectados con ^99mTc (CO)3-dendrímero-FITC, 1 h post-inyección. (A) Las flechas blancas y amarillas muestran el hígado y los riñones, respectivamente. (B) En blanco se muestra la región donde se localiza el tumor. En amarillo se muestra la región abdominal (hígado y riñones) sobre la cual se colocó una máscara de de manera que no interfiera con la imagen de la región del tumor. 

Figura 7 Imágenes de microscopía láser confocal: secciones de hígado (A) y tumor (B) provenientes de ratones portadores de melanoma inyectados con ^99mTc (CO)3-dendrímero-FITC, 24 h post-inyección 

En este modelo, también se inyectó dendrímero-FITC en forma intravenosa. Se evaluó la captación por las células del tumor a las 24 h post-inyección por microscopía láser confocal. Se observó señal de fluorescencia en el citosol de las células tumorales.