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Introducción
El gas de monóxido de carbono (CO) no es irritante, es insípido, inodoro, incoloro y se forma como resultado de la combustión incompleta de sustancias que contienen carbono. Las fuentes de gas CO son causadas por incendios, incendios forestales, calderas de gas defectuosas, gases de escape de vehículos de motor, etc. Hay 20,000-50,000 casos de intoxicación por exposición a CO en los EE.UU. cada año. La intoxicación por CO se conoce como la causa de muchas intoxicaciones fatales en algunos países1.
El gas CO se difunde rápidamente a través de las membranas capilares alveolares, se une al oxígeno y conduce a la formación de carboxihemoglobina (COHb). La afinidad del CO por la Hb es aproximadamente 200-250 veces mayor que la del oxígeno. La intoxicación por CO causa hipoxia en el cuerpo y el cerebro es uno de los órganos más sensibles a la hipoxia. Se ha observado atrofia del hipocampo, cambios en las estructuras subcorticales y el pálido1,2.
Las regiones organizadoras nucleolares (NOR) son locus genéticos en los cromosomas. Estas regiones se producen a partir de proteínas y ADN ribosómico (ADNr), algunos de los cuales son características argirofílicas. Las NOR son bucles de ADN, repetidos en serie con espaciadores intergénicos y transcritos en ARN ribosómico (ARNr), que es parte de los ribosomas maduros en los nucléolos, y finalmente se convierte en parte de los ribosomas maduros en el citoplasma. Las NOR son subunidades funcionales del nucleolo3.
Hasta donde sabemos, no existen estudios sobre la relación entre el envenenamiento por CO y las proteínas organizadoras nucleolares argirófilas (AgNOR) en los tejidos cerebrales. Además, las AgNOR revelan la actividad metabólica, la proliferación y el potencial de autorrenovación de las células dañadas en eventos isquémicos. Por lo tanto, nuestro objetivo fue evaluar los efectos potenciales de la intoxicación por CO en la síntesis de proteína NOR de los tejidos cerebrales e investigar si existe alguna relación no solo entre la cantidad de proteína AgNOR y los niveles de COHb, sino también entre el grado de hipoxia y ambas cantidades de AgNOR (número medio de AgNOR y proporción de área total de AgNOR/área nuclear total [TAA/TNA]) en el estudio actual.
Materiales y métodos
Procedimientos experimentales
El presente estudio fue aprobado de acuerdo con los principios aceptados internacionalmente para el cuidado y uso de animales de laboratorio por el comité de ética de experimentos con animales local. Usamos los tejidos cerebrales de las ratas utilizadas en nuestro estudio anterior2. Se incluyeron en el estudio veinte ratas albinas Wistar macho adultas (con un peso de 150 y 180 g) seleccionadas de la misma raza.
Se constituyeron cuatro grupos que contenían cada uno cinco ratas de la siguiente manera:
- Grupo A: el grupo de control (que consiste en ratas expuestas al aire ambiente).
- Grupo B: formado por ratas expuestas a CO en una concentración baja (mezcla de aire ambiente y 1,000 ppm de CO).
- Grupo C: formado por ratas expuestas a CO en una concentración media (mezcla de aire ambiente y 3,000 ppm de CO).
- Grupo D: compuesto por ratas expuestas a CO en una alta concentración (mezcla de aire ambiente y 5,000 ppm de CO).
Se utilizaron tres tubos de acero (Habas, Industrial and Medical Gases Production Industries Inc., Kocaeli, Turquía) que contenían 10 l de gas CO y diferentes concentraciones de mezcla de aire (1,000, 3,000 y 5,000 ppm). Todas las ratas se expusieron a gas CO en una cámara de plástico cerrada (tamaño: 20 x 40 x 60 cm3). Había dos aberturas (salida y entrada) con 2 cm de diámetro en lados opuestos de la cámara de plástico.
Los grupos B, C y D se expusieron a gas CO en tres densidades (1,000 ppm, 3,000 ppm y 5,000 ppm) a un caudal de 4 l/minuto durante 30 minutos en la cámara de plástico. Después de siete días de exposición, las ratas fueron anestesiadas con 50 mg/kg de hidrocloruro de ketamina por vía intraperitoneal (Ketalar, Parke-Davis, Eczacibasi, Estambul-Turquía) y 3 mg/kg de hidrocloruro de xilacina por vía intraperitoneal (Rompun, Bayer AG, Leverkusen-Alemania). Las muestras de sangre para la detección del nivel de COHb se obtuvieron de la vena yugular derecha mediante cateterismo en cada grupo. Después de tomar la muestra de sangre se retiró el catéter.
Bajo anestesia, las ratas se colocaron en posición supina, se afeitó la pared torácica y se desinfectó utilizando una solución de povidona yodada al 10% para el procedimiento quirúrgico. La toracotomía se aplicó a través de una incisión en la línea media. La fijación por perfusión se obtuvo con una solución de formaldehído al 10% (administrada por vía intracardiaca). Luego se extrajeron los tejidos del cerebro y se colocaron en una solución de formaldehído al 10% para su fijación. Después de eso, estos tejidos se incrustaron en bloques de parafina después de los protocolos de procesamiento de tejidos habituales.
Detección de proteínas AgNOR
Se lograron secciones con 4 mm de espesor de tejido cerebral, se desparafinaron en solución de xileno y se rehidrataron en soluciones de alcohol graduado. Luego los portaobjetos se secaron al aire a temperatura ambiente durante 15 minutos y se logró la fijación en metanol absoluto durante 5 minutos. La tinción de AgNOR se aplicó utilizando una forma indistintamente modificada del protocolo de Benn y Perle4 y Lindner5. Los portaobjetos se evaluaron mediante microscopio óptico (Olympus CHK 2, Olympus, Japón) y los tejidos cerebrales se fotografiaron con una cámara digital (Axio Cam ICc5, ZEISS, Alemania). Las imágenes capturadas se transfirieron a un programa de procesamiento de imágenes digitales (ImageJ 1.53f, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU.). Las mediciones del área AgNOR y del área nuclear se actualizaron utilizando la herramienta de «selecciones a mano alzada». Se evaluaron 50 núcleos por rata y se detectó la relación TAA/TNA y el número medio de AgNOR para cada núcleo de células cerebrales.
Análisis de laboratorio
Medimos los niveles de COHb con análisis de gases en sangre. Se evaluó la relación entre los niveles de COHb y los tejidos cerebrales. El análisis de gases en sangre se aplicó con el dispositivo ABL 800 (Radiometer, Carlsbad, California-EE.UU.).
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó SPSS versión 22 (Statistical Package for Social Sciences). Al evaluar los resultados del estudio, además de la estadística descriptiva (número, media, desviación estándar, mediana y rango), se realizó la prueba de Kruskall-Wallis para la comparación de todos los grupos y la prueba U de Mann-Whitney para la comparación por pares de grupos. Además, se realizó una prueba de regresión polinominal. Una p < 0.05 se aceptó como estadísticamente significativa.
Resultados
El número medio de AgNOR, la relación TAA/TNA de cada subgrupo y su número promedio de AgNOR y la relación TAA/TNA se proporcionan en la tabla 1. Cuando se consideraron todos los grupos, se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre todos los grupos tanto para TAA/TNA relación (χ2: 14.417; p = 0.002) y el número medio de AgNOR (χ2: 14.339; p = 0.002), respectivamente (Tabla 1 y Fig. 1). Para comprender estas diferencias causadas por los grupos, se realizó una comparación binaria entre los grupos. Según doble comparación de grupos para la relación TAA/TNA, las diferencias entre control y 1,000 ppm (Z: –2.611; p = 0.009), entre control y 3,000 ppm (Z: –2.611; p = 0.009), entre control y 5,000 ppm (Z: –2.611; p = 0.009) y entre 1,000 y 5,000 ppm (Z: –2.611; p = 0.009) fueron estadísticamente significativas. Por el contrario, las diferencias entre 1,000 y 3,000 ppm (Z: –1.149; p = 0,251) y entre 3,000 y 5,000 ppm (Z: –1.149; p = 0.251) no fueron significativas para la relación TAA/TNA (Tabla 2).
Tabla 1 Número medio de regiones organizadoras nucleolares argirófilas (AgNOR), relación área total de AgNOR/área nuclear total (TAA/TNA) de cada subgrupo y su número de AgNOR medio, relación TAA/TNA
| Grupos | Número medio de AgNOR ± DE (n = 50) | TAA/TNA media ± DE (n = 50) | Número promedio de AgNOR de grupo/mediana (rango) (n = 250) | TAA/TNA promedio del grupo/mediana (rango) (n = 250) | χ2 | p |
|---|---|---|---|---|---|---|
| C1 | 1.56 ± 0.760 | 0.066 ± 0.017 | 1.565±0.071/1.56 (0.19) | 0.063±0.002/0.064 (0.006) | ||
| C2 | 1.46 ± 0.579 | 0.060 ± 0.019 | 14.339* | 0.002* | ||
| C3 | 1.549 ± 0.541 | 0.064 ± 0.015 | 14.417† | 0.002† | ||
| C4 | 1.647 ± 0.796 | 0.064 ± 0.070 | ||||
| C5 | 1.608 ± 0.532 | 0.063 ± 0.016 | ||||
| A 1,000 ppm 1 | 2.647 ± 0.700 | 0.090 ± 0.028 | 2.675±0.140/2.686 (0.39) | 0.096±0.007/0.097 (0.016) | ||
| A 1,000 ppm 2 | 2.863 ± 0.663 | 0.104 ± 0.030 | ||||
| A 1,000 ppm 3 | 2.706 ± 0.807 | 0.097 ± 0.025 | ||||
| A 1,000 ppm 4 | 2,471 ± 0.731 | 0.101 ± 0.025 | ||||
| A 1,000 ppm 5 | 2.686 ± 0.787 | 0.088 ± 0.024 | ||||
| A 3,000 ppm 1 | 2.420 ± 0.785 | 0.095 ± 0.020 | 2.241±0.216/2.275 (0.49) | 0.107±0.015/0.112 (0.034) | ||
| A 3,000 ppm 2 | 2.275 ± 0.723 | 0.118 ± 0.057 | ||||
| A 3,000 ppm 3 | 2.059 ± 0.580 | 0.122 ± 0.037 | ||||
| A 3,000 ppm 4 | 1.98 ± 0.589 | 0.096 ± 0.015 | ||||
| A 3,000 ppm 5 | 2,471 ± 0.674 | 0.112 ± 0.101 | ||||
| A 5,000 ppm 1 | 2.961 ± 1.039 | 0.113 ± 0.049 | 2.678±0.445/2.706 (1.16) | 0.123±0.016/0.116 (0.037) | ||
| A 5,000 ppm 2 | 2.039 ± 0.871 | 0.105 ± 0.032 | ||||
| A 5,000 ppm 3 | 3.196 ± 1.200 | 0.142 ± 0.057 | ||||
| A 5,000 ppm 4 | 2.706 ± 1.064 | 0.138 ± 0.050 | ||||
| A 5,000 ppm 5 | 2.490 ± 1.027 | 0.116 ± 0.034 |
*Para el número medio de AgNOR.
†Para TAA/TNA.
C: control; A: agudo; DE: desviación estándar.
Figura 1 Comparación del número medio de regiones organizadoras nucleolares argirófilas (AgNOR) (A) y la relación área total de AgNOR/área nuclear total (TAA/TNA) (B) de los grupos. Relación entre el número medio de AgNOR de células cerebrales y los niveles de carboxihemoglobina (COHb) (C) y entre la relación media de TAA/TNA de las células cerebrales y los niveles de COHb (D).
Tabla 2 Resultados de la doble comparación de los grupos para la relación área total de AgNOR/área nuclear total (TAA/TNA) y el número medio de regiones organizadoras nucleolares argirófilas (AgNOR)
| Grupos | C | 1,000 ppm | 3,000 ppm | 5,000 ppm | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Z | p | Z | p | Z | p | Z | p | ||
| AA/TNA | C | – | – | –2.611 | 0.009 | –2.611 | 0.009 | –2.611 | 0.009 |
| 1,000 ppm | –2.611 | 0.009 | – | – | –1.149 | 0.251 | –2.611 | 0.009 | |
| 3,000 ppm | –2.611 | 0.009 | –1.149 | 0.251 | – | – | –1.149 | 0.251 | |
| 5,000 ppm | –2.611 | 0.009 | –2.611 | 0.009 | –1.149 | 0.251 | – | – | |
| Número medio de AgNOR | C | – | – | –2.611 | 0.009 | –2.611 | 0.009 | –2.611 | 0.009 |
| 1,000 ppm | –2.611 | 0.009 | – | – | –2.514 | 0.012 | –0.419 | 0.675 | |
| 3,000 ppm | –2.611 | 0.009 | –2.514 | 0.012 | – | – | –1.776 | 0.076 | |
| 5,000 ppm | –2.611 | 0.009 | –0.419 | 0.675 | –1.776 | 0.076 | – | – | |
C: control.
Cuando se tuvo en cuenta el número medio de AgNOR, se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre el control y 1,000 ppm (Z: –2.611; p = 0.009), entre el control y 3,000 ppm (Z: –2.611; p = 0.009), entre los controles y 5,000 ppm (Z: –2.611; p = 0.009) y entre 1,000 y 3,000 ppm (Z: –2.514; p = 0.012). Pero las diferencias entre 1,000 y 5,000 ppm (Z: –0.419; p = 0.675) y entre 3,000 y 5,000 ppm (Z: –1.776; p = 0.076) no fueron significativas para el número medio de AgNOR (Tabla 2). Además, se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre todos los grupos para COHb (χ2: 16.995; p = 0.001) (Tabla 3).
Tabla 3 Comparación de los niveles de carboxihemoglobina (COHb) en todos los grupos
| Grupos | Media de COHb (n = 50) | COHb promedio del grupo/mediana (rango) (n = 250) | χ2 | p |
|---|---|---|---|---|
| C1 | 3 | 2.6 ± 0.894/3 (2) | ||
| C2 | 3 | 16.995 | 0.001 | |
| C3 | 3 | |||
| C4 | 3 | |||
| C5 | 1 | |||
| A 1,000 ppm 1 | 29 | 29.2 ± 0.837/29 (2) | ||
| A 1,000 ppm 2 | 28 | |||
| A 1,000 ppm 3 | 30 | |||
| A 1,000 ppm 4 | 30 | |||
| A 1,000 ppm 5 | 29 | |||
| A 3,000 ppm 1 | 43 | 42.8 ± 2.490/43 (6) | ||
| A 3,000 ppm 2 | 42 | |||
| A 3,000 ppm 3 | 45 | |||
| A 3,000 ppm 4 | 45 | |||
| A 3,000 ppm 5 | 39 | |||
| A 5,000 ppm 1 | 52 | 49.8 ± 6.221/52 (16) | ||
| A 5,000 ppm 2 | 39 | |||
| A 5,000 ppm 3 | 55 | |||
| A 5,000 ppm 4 | 51 | |||
| A 5,000 ppm 5 | 52 |
C: control; A: agudo.
Para detectar la relación entre los niveles de COHb y las cantidades de AgNOR se realizó un análisis de regresión polinominal y se detectó una relación estadísticamente significativa entre los niveles de COHb y el número medio de AgNOR de células cerebrales (p < 0.05) (Tabla 4, Fig. 1C). Además, la relación entre la relación TAA/TNA de las células cerebrales y los niveles de COHb también fue estadísticamente significativa (p < 0.05) (Tabla 4, Fig. 1D).
Tabla 4 Resumen del modelo y estimaciones de los parámetros para los niveles de carboxihemoglobina (COHb) y los números medios de regiones organizadoras nucleolares argirófilas (AgNOR), relación área total de AgNOR/área nuclear total (TAA/TNA)
| Variable | Ecuación | Resumen modelo | Estimaciones de parámetros | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| R2 | F | df1 | df2 | sig. | Constante | b1 | b2 | b3 | ||
| M –AgNOR –N y COHb | Lineal | 0.567 | 23.544 | 1 | 18 | 0.000 | –30.679 | 26.982 | ||
| Logarítmico | 0.615 | 28.803 | 1 | 18 | 0.000 | –17.556 | 60.703 | |||
| Cúbico | 0.665 | 16.843 | 2 | 17 | 0.000 | –144.662 | 134.271 | –23.926 | 0.000 | |
| TAA/TNA y COHb | Lineal | 0.831 | 88.719 | 1 | 18 | 0.000 | –36.059 | 691.112 | ||
| Logarítmico | 0.874 | 124.603 | 1 | 18 | 0.000 | 184.976 | 65.081 | |||
| Cúbico | 0.885 | 65.595 | 2 | 17 | 0.000 | –96.421 | 2019.695 | -6856.583 | 0.000 | |
M-AgNOR-N: número medio de AgNOR
Demostración experimental de la toxicidad por monóxido de carbono in vivo. La hipoxia cerebral causada por la intoxicación por monóxido de carbono provoca daño celular y se produce una respuesta en el núcleo. Los genes de ADNr se replican a partir del núcleo, los ARNr se transcriben a partir de ADNr y las NOR se traducen a partir de ARNr. NOR teñida con plata en las células cerebrales expuso diferentes niveles de CO (control y 1,000, 3,000 y 5,000 ppm para las células cerebrales) (Fig. 2).
Figura 2 Demostración experimental de la toxicidad por monóxido de carbono (CO) in vivo. La hipoxia cerebral causada por la intoxicación por monóxido de carbono provoca daño celular y se produce una respuesta en el núcleo. Los genes de ADN ribosómico (ADNr) se replican a partir del núcleo, los ARN ribosómico (ARNr) se transcriben a partir de ADNr y las regiones organizadoras nucleolares (NOR) se traducen a partir de ARNr. NOR teñidas con plata en células cerebrales expuestas a diferentes niveles de CO. A: control; B: 1,000 ppm; C: 3,000 ppm; D: 5,000 ppm para células cerebrales (aumento X100).
Discusión
La aparición de inflamación, estrés oxidativo, radicales de oxígeno y apoptosis es comparable a una lesión por reperfusión y constituye un mecanismo de daño considerable. Las lesiones neurológicas ocurrirán a largo plazo (déficit de concentración, demencia, ataxias o comportamiento anormal, etc.). Se pueden observar cambios en el pálido y las estructuras subcorticales. La gravedad del envenenamiento inicial no puede correlacionarse con el desarrollo de daño neuronal a largo plazo1.
Las concentraciones de oxígeno pueden reducirse por diferentes agentes internos y externos como la intoxicación por CO. Esta situación provoca hipoxia y acidosis de las diferentes células como corazón, pulmón, músculo, cerebro, etc. En esta condición puede ocurrir daño estructural y funcional de diferentes tejidos y células dependiendo de la duración, tiempo y grado de hipoxia. Por lo tanto, la detección temprana de la duración, el tiempo y el grado de la hipoxia es de gran importancia no solo para reducir el daño de la hipoxia, sino también para el desarrollo de una estrategia de tratamiento eficaz.
Las mediciones de las cantidades de proteína AgNOR (especialmente la relación TAA/TNA) mediante software dan resultados más confiables sobre los cambios de estas proteínas. La técnica de tinción AgNOR es un método eficaz, fiable, económico y sensible en la evaluación del daño por isquemia del cerebro. Además, las AgNOR son un buen indicador para la detección de la proliferación, la actividad metabólica, la formación de subunidades ribosómicas, la capacidad de síntesis de proteínas de las células y el potencial de autorrenovación de las células dañadas por eventos isquémicos. Por ello se han realizado diversos estudios sobre diferentes células como células de la raíz del cabello humano6, células epiteliales bucales del síndrome de Down7 y humanos sanos8, células tiroideas benignas y malignas9-12, diferentes tipos de células cancerosas13-15 e hipoxia provocada por intoxicación por CO en diferentes células2,3,16-18. Según nuestros resultados, en el primer estudio en la literatura sobre el cerebro expuesto a intoxicación por CO, se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre todos los grupos tanto para la relación TAA/TNA como para el número medio de AgNOR. Según la doble comparación de grupos, las diferencias entre control y 1,000 ppm, entre control y 3,000 ppm, entre control y 5,000 ppm y entre 1,000 y 5,000 ppm fueron estadísticamente significativas para la relación TAA/TNA. Además, se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre el control y 1,000 ppm, entre el control y 3,000 ppm, entre el control y 5,000 ppm y entre 1,000 y 3,000 ppm para el número de AgNOR medio.
Anteriormente informamos de que el nivel de las proteínas AgNOR aumentaba dependiendo de la duración y los niveles de exposición al CO en pulmón2, miocitos3,16 y células musculares17,18. En nuestro estudio actual, los niveles de las proteínas AgNOR también aumentaron significativamente dependiendo de los niveles de exposición al CO en las células cerebrales. Además, las relaciones entre los niveles de COHb y las cantidades de AgNOR (números medios de AgNOR y relación TAA/TNA) fueron estadísticamente significativas.
Todos los organismos vivos deben protegerse a sí mismos de agentes peligrosos externos e internos como la intoxicación por CO. ¿Se pueden sintetizar las proteínas AgNOR contra la intoxicación por CO con fines protectores o desencadenar la síntesis de otras proteínas, que tienen un efecto protector sobre la regulación de las vías de transducción de señales y genes en la condición de intoxicación por CO? ¿Se pueden utilizar esas proteínas como agente terapéutico para prevenir los efectos peligrosos de la intoxicación por CO? La hipoxia y la asfixia son un importante problema de salud que enfrenta la humanidad y pueden causar graves daños a la vida del organismo. Por tanto, ¿puede la administración de estas proteínas a individuos con riesgo de nacimiento hipóxico y asfixiante, como B12 y folato por vía oral, reducir las secuelas? ¿Pueden reducirse las deficiencias de algunos órganos durante la morfogénesis embrionaria utilizando esas proteínas? Se necesitan estudios adicionales que incluyan grandes series para comprender este tema con mayor claridad.
Como conclusión, las AgNOR brindan información sobre la actividad metabólica, la proliferación y el potencial de autorrenovación de las células dañadas en eventos isquémicos. También se puede decir que las proteínas AgNOR pueden usarse para la detección temprana de la duración, intensidad y daño de la intoxicación por CO en las células cerebrales. Por lo tanto, se pueden desarrollar estrategias de tratamiento efectivas para la prevención de condiciones hipóxicas.
