Antecedentes

Tanto 5-hidroxitriptamina (5-HT) como sus receptores específicos unidos a canales iónicos o a cascadas metabotrópicas tienen diversas funciones en los primeros períodos del desarrollo cerebral.¹-³ En el Laboratorio de Neurontogenia el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) se obtuvo información complementaria sobre el papel funcional de 5-HT en estructuras neuroblásticas, como los conos de crecimiento axonal del encéfalo de rata en el día 17 de gestación,⁴ la presencia de los receptores 5-HT_1A y 5-HT_1B⁵ y la vía sintética de 5-HT, así como la presencia de un sistema liberador de 5-HT dependiente de K⁺ y Ca⁺⁺, y un sistema de captación dependiente de Na⁺.⁴,⁶ Durante el desarrollo cerebral también se ha descrito un aumento transitorio de la expresión del transportador de serotonina (SERT) y 5-HT en las terminales nerviosas de las áreas sensoriales de la corteza cerebral.⁷,⁸ La aparición temprana de terminales serotoninérgicas en la corteza cerebral en maduración es particularmente intensa, especialmente en las áreas sensoriales, incluidas la visual, somatosensorial y auditiva.⁷,⁹,¹⁰ Mazer¹¹ informó que una disminución de las señales serotoninérgicas influye en el desarrollo normal y la maduración de la corteza cerebral al reducirse la densidad sináptica, con el consiguiente daño del desarrollo cognitivo. Asimismo, 5-HT desempeña un papel regulador en diversas áreas corticales a través de las terminales axónicas de las neuronas serotoninérgicas ubicadas en los núcleos del rafe mesencefálico; hasta donde sabemos, esto último no se observó en la corteza cerebral en desarrollo de ratas. En el pez cebra se han observado células 5-HT en el área pretectal del prosencéfalo basal¹²,¹³ y se ha reportado la expresión transitoria de SERT y VMAT₂.¹⁴ Lebrand¹⁴ propuso que la regulación de la corticogénesis por 5-HT en ratas se produce mediante fibras tálamo-corticales apoyadas por receptores 5-HT_1A y 5-HT_1B, así como SERT.¹⁵,¹⁶

Existen otros tipos de neuronas de aparición temprana en la corteza cerebral en crecimiento, como las neuronas de Cajal-Retzius en la zona marginal, relacionadas con la migración celular y el patrón de desarrollo celular de adentro hacia afuera de la corteza;¹⁷,¹⁸ así como las neuronas inmunopositivas GABAérgicas y la tirosina hidroxilasa en la corteza dorsolateral y medial que se identifican antes y después del nacimiento de la rata.¹⁹,²⁰ Es probable que su expresión fenotípica esté regulada epigenéticamente, como en el sistema nervioso periférico.²¹,²² Por lo tanto, las neuronas corticales pueden expresar transitoriamente algunas moléculas enzimáticas como tirosina hidroxilasa²⁰ y otros neurotransmisores.²³ La aparición temprana (días 10 y 11 de gestación) de neuronas GABAérgicas y noradrenérgicas también se observa durante los períodos pre y posnatal. Su expresión en el cerebro en maduración puede ser transitoria y desempeñar un papel importante en la diferenciación de las células corticales.²⁰

Conforme a los resultados mencionados, el presente trabajo se llevó a cabo con la intención de obtener más información sobre la presencia de células serotoninérgicas y la expresión de triptófano-5-hidroxilasa, SERT, 5-HT, el receptor 5-HT_1A y Pet-1 en la corteza cerebral en desarrollo.

Material y métodos

Estudio observacional descriptivo en ratas Wistar hembras nulíparas con un peso de 200 ± 10 g. Las ratas se adaptaron durante dos semanas bajo las siguientes condiciones: 22 ± 2 °C de temperatura, luces encendidas de 7:00 a 19:00 horas, así como mínimo ruido y manipulación. Durante este período, los animales fueron alimentados con pélets (Purina) y agua ad libitum. Después de dos semanas, las ratas se aparearon con machos normales. La presencia de tapón se consideró como el día de gestación 1 y la edad gestacional se determinó con la distancia del cráneo a la rabadilla de los fetos. En los días de gestación 13, 16 y 17 se realizó una cesárea bajo anestesia (40 mg/kg de pentobarbital intraperitoneal. Los encéfalos se diseccionaron en dos regiones, es decir, el mesencéfalo y el neopalio, para determinar la presencia de células serotoninérgicas y la expresión de TPH, SERT, 5-HT, 5-HT_1A y Pet-1 in situ y en cultivos organotípicos, mediante inmunofluorescencia con anticuerpos para cada molécula; la observación se llevó a cabo con microscopio confocal (Leica TCS SP2™, Leica Microsystems).

El Comité Interno de Ética del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Instituto Politécnico Nacional, aprobó el protocolo experimental para el uso de animales de experimentación, de acuerdo con la norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999.

Resultados

La Figura 1A muestra células inmunopositivas a 5-HT y proyecciones axonales en el mesencéfalo en cocultivo con neopalio; solo se observaron células inmunopositivas a 5-HT en el neopalio en cocultivo con mesencéfalo a los 13 días de gestación (Figura 1B). Además, se identificaron células de neopalio no cultivadas positivas a TPH y células de neopalio en cocultivo positivas a 5-HT_1A (Figuras 1C y 1D).

Figura 1 A: células inmunopositivas a 5-HT y proyecciones axonales en cocultivo de mesencéfalo con neopalio. Escala: 75 µm. B: células inmunopositivas a 5-HT en neopalio en cocultivo. Escala: 5 µm C: células no cultivadas positivas a TPH en neopalio. Escala: 20 µm D: células positivas a 5-HT_1A en neopalio en cocultivo. Escala: 75 µm. Las puntas de flecha indican células y las flechas, proyecciones. 

En cuanto a las células de neopalio en cocultivo inmunopositivas a TPH y SERT, se observó la colocalización de ambas moléculas en las mismas células el día 13 de gestación (Figura 2A). Asimismo, 5-HT coexiste con SERT en las mismas células de neopalio en cocultivo con mesencéfalo (Figura 2B).

Figura 2 A: TPH (verde) y SERT (rojo) coexisten en células de neopalio en cocultivo (amarillas). B: 5-HT (verde) también coexiste con SERT (rojo) en las mismas células (amarillo) de neopalio en cocultivo con mesencéfalo. Escala: 75 µm. Las puntas de flecha indican células. 

La Figura 3A muestra que TPH y 5-HT coexisten en la misma célula en neopalio en cocultivo, así como que células inmunopositivas a 5-HT también se colocalizan con células inmunopositivas a TPH en neopalio no cultivado en el día 13 de edad gestacional (Figura 3B).

Figura 3 A: 5-HT (roja) coexiste con TPH (verde) en la misma célula (amarilla) de neopalio en cocultivo con mesencéfalo. Escala: 75 μm. B: coexistencia de TPH (verde) y 5-HT (rojo) en la misma célula (amarillo) de neopalio no cultivado. Escala: 35 µm. Las puntas de flecha indican células. 

En la Figura 4A, el anticuerpo GFAP, un marcador glial, fue positivo junto con el anticuerpo TPH, compartiendo la misma ubicación celular en tejido de corteza fetal cultivado e in situ (Figura 4B). Además, GFAP coexiste con 5-HT en la misma célula de neopalio estudiado in situ (Figura 4C).

Figura 4 A: las células positivas a GFAP (verde) también exhiben TPH (rojo) y la coexistencia de ambos marcardores (amarillo) en neopalio en cocultivo con mesencéfalo. Escala: 75 µm. B: se puede observar GFAP y TPH coexistiendo (amarillo) en las células de neopalio no cultivadas. Escala: 30 µm. C: las células gliales, con el marcador positivo para GFAP (verde) también exhiben 5-HT (rojo) en neopalio no cultivado. Escala: 30 µm. Las puntas de flecha indican células. 

Es importante destacar que, como se esperaba, en la Figura 5A se puede observar positividad a Pet-1 en células mesencefálicas cocultivadas e in situ en el rafe fetal en el día 17 de gestación, la cual coexistió con la positividad a otros marcadores de 5-HT. Lo mismo se observó en el neopalio el día 16 de gestación, tanto en cocultivo como in situ (Figura 5B).

Figura 5 A: las células inmunopositivas a Pet-1 (rojas) también son positivas a 5-HT (verde), en mesencéfalo en cocultivo con neopalio. Ambas marcas coexisten en las mismas células (amarillo). B: se pueden observar Pet-1 (rojo) y 5-HT (verde) coexistiendo en células cocultivadas de neopalio (amarillo). Escala: 50 µm. Las puntas de flecha indican células. 

En la Figura 6A se observan células 5-HT positivas con fibras ya ramificadas después de nueve días de cultivo; estas fibras no se observaron el día 11 de cultivo (Figura 6B).

Figura 6 Neopalio en cocultivo con mesencéfalo. A: las células positivas a 5-HT se muestran con fibras ya ramificadas (nueve días de cocultivo). B: en una etapa posterior no se observaron estas fibras (11 días de cocultivo). Escala: 50 µm. Las puntas de flecha indican células. 

Discusión

Como lo presentó nuestro grupo en un artículo anterior, inesperadamente se observaron células inmunopositivas a 5-HT en la corteza cerebral en maduración de ratas, tanto en cocultivo con tejido mesencefálico como en tejido de neopalio no cultivado, así como en tejido de neopalio analizado in situ.²⁷ Estas células podrían tener un fenotipo serotoninérgico transitorio y su presencia en la corteza cerebral primitiva podría apoyar los procesos corticogenéticos, porque exhiben toda la maquinaria biosintética de 5-HT.²⁷ 5-HT es uno de los neurotransmisores más abundantes y cruciales en el cerebro de mamíferos y humanos y es fundamental en el desarrollo cerebral prenatal y posnatal.¹

En una etapa inicial, estas células serotoninérgicas revelaron un rasgo diferenciador de tipo neuronal, como la formación temprana de fibras nerviosas (Figura 6A). Sin embargo, posteriormente estos rasgos ya no se observaron (Figura 6B), lo que sugiere su posible participación en un proceso de desdiferenciación. También se han encontrado presencias tempranas de células serotoninérgicas in situ en los días 16 y 17 de gestación. Curiosamente, algunas de estas células también expresaron el fenotipo glial GFAP (Figura 4), lo que sugiere un papel de las células gliales en esta etapa. Otras células también expresaron el dominio específico de transformación de eritroblastos; el factor de transcripción Pet-1 es un componente del complejo genético que genera el fenotipo 5-HT.²⁸ La red molecular de este fenotipo está compuesta no solo por Pet-1, sino también por NAx2.2, Lmx1b, factor B y GATA3, que constituyen la vía molecular para la especificación del fenotipo de las células que expresan 5-HT.²⁸,²⁹ Pet-1 es, según Hendricks et al.²⁸ un marcador temprano y preciso de las neuronas centrales que sintetizan 5-HT. Los sitios de unión de Pet-1 están ubicados en áreas clave de los genes que expresan las principales moléculas específicas de 5-HT, donde Pet-1 ejerce su función reguladora. Estos datos respaldan el uso de Pet-1 como un marcador más viable para las neuronas que expresan el fenotipo 5-HT (Figura 5).²⁸

Se sabe que también aparecen otros tipos de células monoaminérgicas durante un período temprano de maduración cerebral en embriones de rata. Antes del día 10 de vida fetal se pueden identificar células dopaminérgicas y GABAérgicas, que probablemente también estén implicadas en la neurogénesis.¹⁹,²⁰,³⁰ Las neuronas serotoninérgicas también aparecen en los primeros períodos de la gestación neural (días de gestación 11 y 12) y forman los núcleos del rafe mesencefálico.¹⁵ Sin embargo, como se informó y confirmó anteriormente,²⁷ las células 5-HT también aparecen en la corteza cerebral en desarrollo de las ratas en periodo fetal. La interrupción prenatal de 5-HT puede provocar una alteración del desarrollo del cerebro fetal y un mayor riesgo de trastornos psiquiátricos durante la infancia y la edad adulta. La alteración de la señalización 5-HT se ha asociado a diversos trastornos neurológicos como depresión, ansiedad, psicosis, espectro autista, restricción del crecimiento fetal y trastorno por déficit de atención e hiperactividad.³¹-³⁵

Con los datos actuales podemos concluir que las células que llevan el fenotipo serotoninérgico están presentes en la corteza cerebral inmadura y que demuestran características neuronales o gliales. Sugerimos que estas células podrían apoyar la diferenciación cortical y que su presencia es transitoria. Alternativamente pueden pertenecer a las llamadas "células cuasi serotoninérgicas", cuya función y características aún no están definidas.²⁷