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Revista mexicana de fitopatología

On-line version ISSN 2007-8080Print version ISSN 0185-3309

Rev. mex. fitopatol vol.39 n.1 Texcoco Jan. 2021  Epub May 07, 2021

https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.2009-1 

Notas Fitopatológicas

Filogenia de la enzima ATP/ADP translocasa de Candidatus Liberibacter spp., agentes causales del HLB

Felipe Roberto Flores-de la Rosa1 

Cynthia Guadalupe Rodríguez-Quibrera1 

Ricardo Santillán-Mendoza1 

1 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Campo Experimental Ixtacuaco. Km 4.5 carretera Federal Martínez de la Torre-Tlapacoyan. Tlapacoyan, Veracruz, México. CP. 93650.


Resumen.

Las bacterias causantes del huanglongbing (HLB), Canditatus Liberibacter spp., son bacterias obligadas al floema de los cítricos y a diferentes sistemas del insecto vector, Diaphorina citri, por lo tanto, el enfoque genómico ha sido útil para estudiar sus mecanismos de patogenicidad. Dicho enfoque ha permitido identificar una copia homóloga del gen codificante de la enzima ATP/ADP translocasa, la cual tiene la capacidad de importar ATP y nucleótidos desde el hospedante, causando un parasitismo de energía considerable. Esta enzima se ha relacionado con la actividad endoparasítica de patógenos animales y humanos más que con fitopatógenos. El presente trabajo analizó la relación evolutiva entre la secuencia de aminoácidos de la ATP/ADP translocasa entre diferentes especies de Ca. Liberibacter y grupos como Ricketssia sp. y Chlamydia sp. Análisis filogenéticos muestran que la variación en la secuencia del gen codificante de la enzima está delimitada en clados correspondientes a las especies de Ca. Liberibacter, sugiriendo que la variación en la enzima responde a un proceso coevolutivo con los hospederos. Asimismo, la filogenia muestra que el ancestro común más cercano a Ca. Liberibacter podría ser un endosimbionte no patogénico del género Ca. Midichloria. Análisis de conservación de la secuencia de aminoácidos muestran que existen varias posiciones en la secuencia que podrían estar relacionadas con la variación específica de esta enzima dentro de Ca. Liberibacter. Este trabajo presenta la hipótesis de que el origen evolutivo de la capacidad de parasitismo energético del género Ca. Liberibacter, causantes del HLB, es un endosimbionte no patogénico.

Palabras clave: Coevolución; parasitismo de energía; Dragón Amarillo

Abstract.

The bacteria that cause citrus huanglongbing (HLB), Candidatus Liberibacter spp., are obligate bacteria to the citrus phloem and to different systems of the vector insect, Diaphorina citri, therefore, the genomic approach has been useful to study its pathogenicity mechanisms. This approach has allowed the identification of a homologous copy of the gene coding for the enzyme ATP / ADP translocase, which has the ability to import ATP and nucleotides from the host, causing considerable energy parasitism. This enzyme has been related to the endoparasitic activity of animal and human pathogens more than to phytopathogens. The present work analyzed the evolutionary relationship between the amino acid sequence of ATP / ADP translocase between different species of Ca. Liberibacter and groups such as Ricketssia sp. and Chlamydia sp. Phylogenetic analyzes show that the variation in the sequence of the gene coding for the enzyme is delimited in clades corresponding to the species of Ca. Liberibacter, suggesting that the variation in the enzyme responds to a co-evolutionary process. Also, the phylogeny shows that the closest common ancestor to Ca. Liberibacter could be a non-pathogenic endosymbiont of the genus Ca. Midichloria. Amino acid sequence conservation analysis shows that there are several positions in the sequence that could be related to species variation. The present work offers the hypothesis that the evolutionary origin of the energy parasitism capacity of the causal agents of HLB is a non-pathogenic endosymbiont.

Key words: coevolution; energy parasitism; citrus greening

El huanglongbing (HLB) es considerada, actualmente, la enfermedad de mayor importancia a nivel mundial en la producción citrícola, ya que causa la muerte de los árboles algunos años posterior a la infección, además de que, a la fecha, no existe ningún método de control efectivo y económicamente viable, así como tampoco variedades resistentes al alcance del productor. Se relaciona a la enfermedad con la infección de bacterias del género Candidatus Liberibacter (Ca. L.), así, se ha observado que el HLB es causado por Ca. L. africanus en Sudáfrica (Roberts y Pietersen, 2017), por Ca. L. americanus en Brasil (Wulff et al., 2014) y más extensamente por Ca. L. asiaticus, por ejemplo en Estados Unidos de América (Manjunath et al., 2008) y México (Flores-Sánchez et al., 2015). Estas bacterias son patógenos obligados en el floema de los cítricos y endosimbiontes en diferentes sistemas de su vector, Diaphorina citri (Pelz-Stelinski y Killiny, 2016; Killiny et al., 2018), por lo cual la obtención de cultivos axénicos es muy compleja y dificulta los estudios de patología (Ha et al., 2019; Merfa et al., 2019). En aras de comprender los mecanismos moleculares que permiten el desarrollo del HLB, se ha secuenciado el genoma de varias especies de Ca. Liberibacter spp. (Duan et al., 2009; Lin et al., 2013; Fagen et al., 2014; Zheng et al., 2014, 2015; Cai et al., 2018). Esto ha permitido descubrir genes con alto potencial de patogenicidad en la interacción con la planta. Por ejemplo, Vahling et al. (2010) detectaron la presencia de un gen codificante para una enzima ATP/ADP translocasa funcional y con alta afinidad al ATP y ADP, lo cual resulta importante ya que se ha documentado que una de las respuestas de las plantas a la infección por HLB es la acumulación excesiva de ATP (Pitino et al., 2017). Esta enzima ha sido ampliamente relacionada con endosimbiontes intracelulares obligados, la cual tiene la capacidad de obtener ATP desde la célula del hospedante e importarlo dentro de su propia célula. Este mecanismo se conoce como parasitismo energético (Schmitz-Esser et al., 2004).Lo anterior resulta especialmente de interés debido a que previamente no se conocía este tipo de habilidades parasitarias en fitopatógenos, sino únicamente en patógenos humanos y de animales (Trentmann et al., 2007). La historia evolutiva de esta característica patogénica sugiere que el origen de este gen proviene de un endosimbionte ancestro al actual grupo de Ricketssiales que, tentativamente, se mueve de forma horizontal entre otros grupos de patógenos obligados (Emelyanov, 2007).

El presente trabajo tiene como objetivo analizar las relaciones evolutivas entre genes ATP/ADP translocasa de diferentes patógenos y endosimbiontes humanos y animales y los encontrados en el género Ca. Liberibacter, incluyendo los patógenos causantes del HLB de los cítricos. Para esto, utilizando como base la secuencia de aminoácidos reportada por Vahling et al. (2010), se realizó un análisis BLASTp para identificar las secuencias proteicas con mayor similitud de acuerdo a un e-value <0.001 y un porcentaje de identidad >90% en la base de datos del Genbank pertenecientes a Ca. Liberibacter y a grupos como Ricketssia spp. y Chlamydia spp.

Una vez obtenidas las secuencias de aminoácidos se realizó un alineamiento múltiple utilizando el algoritmo ClustalW (gap open=15; gap extend=3) mediante el software Bioedit (Hall, 1999). Posteriormente, una búsqueda del árbol filogenético óptimo mediante el criterio de la Máxima Parsimonia, para lo cual se utilizó el software T.N.T. (Goloboff et al., 2008), para esto se utilizó una búsqueda mediante algoritmos compuestos (ratchet + sectorial search + drift) y se construyó un árbol consenso estricto. Se realizó un remuestreo mediante bootstrap (1000 iteraciones) utilizando las opciones ofrecidas por el software. En seguida, se elaboró un análisis de conservación entre las secuencias de aminoácidos de la enzima en estudio. Para esto, el alineamiento fue analizado para determinar la conservación por sitios específicos mediante el software Jalview (Waterhouse et al., 2009), adicionalmente se realizó un análisis de entropía posicional mediante la función:

Dónde f(b;l) es la frecuencia con que cada aminoácido aparece en cada columna, siendo mínima cuando la posición está totalmente conservada y máxima cuando todos los aminoácidos están igualmente representados. El análisis fue realizado en el software Bioedit.

Se utilizaron en total 39 secuencias de la enzima ATP/ADP translocasa, como grupo externo para enraizar el árbol filogenético, se incorporó la secuencia de la enzima ATP/ADP translocasa de plastidios de Arabidopsis thaliana (Genbank CAA89201). El análisis filogenético permitió recuperar ocho árboles igualmente parsimoniosos (L=2502), con los cuales se construyó un árbol de consenso estricto (Figura 1). Los resultados del análisis muestran que todas las secuencias provenientes de Ca. Liberibacter spp. se aglomeran en un solo clado (remarcado en azul), este clado es grupo hermana con la enzima proveniente del endosimbionte Candidatus Midichloria mitochondrii, asociado a las garrapatas causantes de diversas enfermedades alrededor del mundo, la cual tiene una característica interesante al ser una bacteria patógena intramitocondrial (Sassera et al., 2006).

Es destacable que, dentro del clado antes mencionado, se ubican subclados bien definidos y con soporte bootstrap alto de acuerdo a cada especie del género. El ancestro hipotético basal del clado se comparte entre Candidatus Midichloria mitochondrii y Ca. Liberibacter aeuropaeus, esto resulta de interés ya que ambos organismos son considerados endosimbiontes no patogénicos en garrapatas (Najm et al., 2012) y en perales (Raddadi et al., 2011; Camerota et al., 2012), respectivamente. Los subclados de Ca. Liberibacter americanus y Ca. Liberibacter africanus se encuentran igualmente bien definidos, los cuales son agentes patógenos causantes de HLB en Brasil (do Carmo Teixeira et al., 2005; Teixeira et al., 2008) y en África (Lin et al., 2006). Igualmente, la presencia de Ca. L. solanacearum y Ca. L. asiaticus como subclados bien definidos y soportados permite plantear dos hipótesis: a) la capacidad patogénica de algunas especies de Ca. Liberibacter pudo haber sido desarrollada en un ancestro endófito no patogénico, esto debido a que Ca. L. aeuropaeus es muy basal dentro del clado de los Ca. Liberibacter y b) los subclados bien definidos por especie sugieren una coevolución de la patogenicidad con los hospederos.

Figura 1 Análisis filogenético de la enzima ATP/ADP translocasa. Se muestra el árbol consenso de ocho árboles igualmente parsimoniosos (L=2502). El clado generado de las especies de Ca. Liberibacter está resaltado en azul. Los nodos marcados con un asterisco muestran soporte 100% mediante Bootstrap (1000 réplicas). El nombre de cada terminal del árbol está compuesto por el número de acceso a Genbank, seguido por la inicial del género y la especie. Abreviaciones de los géneros: CL o CaLib= Candidatus Liberibacter, R=Ricketssia, O=Orientia.  

Las secuencias del clado Ca. Liberibacter muestran un alto grado de conservación en algunas regiones, y el motivo relacionado con el transporte de ATP se encuentra intacto en todas ellas (datos no mostrados). Sin embargo, algunas regiones son altamente variables, siguiendo un patrón de acuerdo a la especie a que pertenece la secuencia de la enzima, lo cual podría generar una cambio en la dinámica estructural y en la función de la proteína (Liu y Bahar, 2012). En la Figura 2A se muestran los sitios con mayor nivel de conservación y los que presentan una mayor variabilidad de acuerdo a la frecuencia en el alineamiento. El análisis de entropía (Figura 2B) demuestra que varias posiciones de la secuencia de la enzima ATP/ADP translocasa contiene un nivel entrópico que sugiere una alta variabilidad en otras posibles secuencias, por tanto, de encontrarse nuevas especies dentro de Ca. Liberibacter con hospederos no reportados, la variación en las secuencias podría ser específicas a cada hospedero. Ahondar en el estudio de la función y la evolución de este gen permitirá comprender mejor los mecanismos por los cuales se genera el daño en la planta durante el desarrollo del HLB y coadyuvar al desarrollo de posibles estrategias de control de la enfermedad. Los resultados presentados en este estudio sugieren que la capacidad de parasitar ATP que tiene Ca. Liberibacter spp. es una característica compartida con endosimbiontes y endopatógenos; sin embargo, la secuencia de la enzima responsable por este parasitismo varía de acuerdo a cada especie dentro del género lo que sugiere eventos de coevolución del parasitismo con el hospedante.

Figura 2 A) Fragmento del alineamiento de secuencias de aminoácidos de la enzima ATP/ADP translocasa. Se muestra la variabilidad aminoacídica en cada especie de Ca. Liberibacter con respecto a la secuencia de Ca. Midichloria mitocondrii. B) Entropía de las posiciones de cada aminoácido en la secuencia de la enzima ATP/ADP translocasa de Ca. Liberibacter. Eje X= Posición de aminoácido, eje Y= Entropía de cada posición. 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 01 de Septiembre de 2020; Aprobado: 06 de Noviembre de 2020

*Autor para correspondencia: flores.felipe@inifap.gob.mx

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