Nota de investigación

 

Fenotipado de cepas de Vibrio aisladas de la hemolinfa de camarones marinos

 

Phenotyping of vibrios isolated from marine shrimp hemolymph

 

Renata Albuquerque-Costa^1*, Rayza Lima-Araújo¹, Regine Helena Silva dos Fernandes-Vieira^1,2

 

¹ Fisheries Engineering Department, Federal University of Ceará, Fortaleza, Brazil.

² Sea Sciences Institute, Federal University of Ceará, 60165-081, Fortaleza, Brazil.

 

* Corresponding author.
E-mail: renata.albuq@gmail.com

 

Received September 2012
Received in revised form February 2013
Accepted February 2013

 

RESUMEN

Se realizó la caracterización fenotípica de 100 cepas de Vibrio aisladas de la hemolinfa de camarones Litopenaeus vannamei cultivados. Este proceso permitió la identificación de 10 especies: V. navarrensis (n = 53), V. brasiliensis (n = 15), V. parahaemolyticus (n = 10), V. xuii (n = 8), V. cholerae (n = 5), V. coralliilyticus (n = 4), V. neptunis (n = 2), V. alginolyticus (n = 1), V. diazotrophicus (n = 1) y V. vulnificus B3 (n = 1). Los resultados sugieren que la hemolinfa de los peneidos puede ser colonizada por vibrios sin comprometer la salud animal.

Palabras clave: Vibrio, caracterización fenotípica, hemolinfa.

 

ABSTRACT

The phenotypic characterization of 100 Vibrio strains isolated from the hemolymph of cultured Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, was performed. This process allowed the identification of 10 species: V. navarrensis (n = 53), V. brasiliensis (n = 15), V. parahaemolyticus (n = 10), V xuii (n = 8), V. cholerae (n = 5), V. coralliilyticus (n = 4), V. neptunis (n = 2), V. alginolyticus (n = 1), V. diazotrophicus (n = 1), and V. vulnificus B3 (n = 1). These results suggest that penaeid hemolymph may be colonized by vibrios with no imposition or necessity of pathological compromising.

Key words: Vibrio, phenotypic characterization, hemolymph.

 

INTRODUCCIÓN

Los organismos acuáticos saludables, incluyendo los camarones, son colonizados naturalmente por bacterias; sin embargo, no existe consenso sobre la presencia de microorganismos en el líquido del aparato circulatorio—la hemolinfa—de estos animales. Según Fagutao et al. (2009), la hemolinfa de invertebrados saludables puede ser colonizada por especies bacterianas. Estudios de la hemolinfa del ostión Crassostrea gigas y los mejillones Modiolus modiolus (Olafsen et al. 1993) y Anodonta cygnea (Antunes et al. 2010) han sugerido que las bacterias del género Vibrio forman parte de la microbiota autóctona de la hemolinfa de organismos acuáticos.

Según Gómez-Gil et al. (1998), aunque existen reportes del aislamiento de cepas de Vibrio de la hemolinfa de camarones sin deterioro patológico, aún falta conocer bien su significación clínica. Por otro lado, la amenaza que representan estos microorganismos para el cultivo de camarón es bien conocido (Mohney et al. 1994, Alapide-Tendencia y Dureza 1997, Costa et al. 1998, Rengpipat et al. 2003, Walling et al. 2010).

Dada la importancia de estudiar la microbiota autóctona de moluscos y crustáceos para el consumo humano, el objetivo de este trabajo fue realizar la caracterización fenotípica de cepas de Vibrio de la hemolinfa de camarones Litopenaeus vannamei cultivados.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se recolectaron 50 camarones (L. vannamei) adultos saludables de un tanque del Centro de Estudios de Acuicultura Costera (Universidad Federal de Ceará [UFC], Brasil), y se transportaron vivos en contenedores de 50 L al Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Peces (UFC). El tiempo transcurrido desde la recolección hasta el inicio de los procedimientos para el análisis bacteriológico no excedió las 2 h. Todos los especímenes fueron desinfectados con alcohol (70° GL) y sometidos a choque térmico por inmersión en agua helada a una razón de 0.6:1. Se determinaron los parámetros morfométricos de los camarones peneidos con una balanza semianalítica (BG Quimis 2000) y un vernier digital (Digimess). La hemolinfa fue recolectada de la región ventral con una jeringa esterilizada de 1 mL que contenía 0.2 mL de citrato de sodio al 10%. Se obtuvieron 10 muestras de hemolinfa, cada una (1 mL) compuesta del líquido tomado de cinco camarones. Las diluciones decimales seriadas de 10^-1 a 10^-4 se obtuvieron mediante la dilución de las muestras en solución salina al 1% a una razón de 1:9.

Se determinó el número más probable (NMP) de Vibrio mediante la técnica de tubos múltiples (Elliot et al. 2001). Para las pruebas presuntivas y confirmatorias se utilizaron agua de peptona alcalina (pH 8.5) con NaCl al 1% y agar tiosulfato citrato bilis sacarosa, respectivamente.

Se seleccionaron aleatoriamente 10 colonias de Vibrio de cada muestra de hemolinfa y se aislaron en medio de agar triptona soya con NaCl al 1%. Las cepas endogámicas fueron sometidas a la tinción de Gram y una prueba de movilidad para su identificación morfológica. La identificación fenotípica se realizó con base en la hidrólisis de la arginina, descarboxilación de la ornitina y lisina, producción de oxidasa, producción de indol, Voges-Proskauer, citrato, gelatinasa, fermentación de carbohidratos (sacarosa, arabinosa, manitol, D-glucosamina y melibiosa), crecimiento a 40 °C y 4 °C, evidencia de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG), capacidad de crecer en una concentración de NaCl (0%, 3%, 8% y 10%), producción de ureasa y susceptibilidad a O/129 (Noguerola y Blanch 2008).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El NMP mL^-1 de Vibrio varió de 30 a 460 (tabla 1). Considerando las variables morfométricas analizadas, la variación del conteo de bacterias parece estar relacionada con el peso (r = 0.7157) y tamaño promedio (r = 0.6609) de los camarones. Soto-Rodriguez et al. (2010) analizaron la relación entre el peso de camarones y el número de bacterias en su hemolinfa; sin embargo, a diferencia del presente estudio, estos autores sólo examinaron la densidad de Vibrio en muestras de camarones (L. vannamei) muertos y encontraron mayores tasas de Vibrio (8.81 x 10³ unidades formadoras de colonias [UFC] mL^-1) en ejemplares de menor peso (0.26 a 4.0 g, n = 1753) (Soto-Rodriguez et al. 2010).

Gomez-Gil et al. (1998), en un estudio de la microbiota de Vibrio asociada con la hemolinfa de juveniles saludables de L. vannamei, observaron vibrios en sólo 14.3% de las muestras de hemolinfa examinadas y el índice de UFC mL^-1 varió de 2 x 10² a 3 x 10³. Estos datos no pueden compararse con los del presente trabajo ya que el método seleccionado para cuantificar las 10 muestras de hemolinfa fue el índice del NMP. Según Swanson et al. (2001), el índice del NMP no proporciona un conteo directo de bacterias, sino determina la población de microorganismos viables en la muestra y, por lo tanto, es adecuado para muestras con una concentración esperada de menos de 10 UFC g^-1.

Con respecto a la presencia de Vibrio en la hemolinfa de camarones peneidos, Gopal et al. (2005) documentaron que la hemolinfa de individuos saludables puede considerarse estéril. Por otro lado, estos mismos autores realizaron una cuantificación de Vibrio en muestras de la hemolinfa de camarones muertos y obtuvieron una variación de 1.52 x 10³ a 4.36 x 10⁴ UFC mL^-1. Costa et al. (1998) obtuvieron datos similares al identificar bacterias de la familia Vibrionaceae sólo en muestras de la hemolinfa de camarones no saludables.

Se aislaron 100 cepas de Vibrio de 10 muestras de hemolinfa analizadas. La identificación fenotípica de 10 especies se resume en la tabla 1.

La especie V. navarrensis fue detectada en todas las muestras de hemolinfa (tabla 1) y representa el 53% del total de aislados. Urdaci et al. (1991) fueron los primeros en describir esta especie, aislada de muestras de agua contaminada de la región de Navarra en España. Utilizaron las siguientes características para diferenciar V. navarrensis de las otras especies de Vibrio descritas previamente: cepas negativas para arginina dihidrolasa, ornitina y lisina descarboxilasas; incapacidad para producir acetoína en la prueba de Voges-Proskauer; falta de uso de la putrescina, gluconato, glucuronato e histidina; capacidad para producir ácido a partir de la sacarosa; y crecimiento a 40 °C. Además, el grupo de linajes utilizado para describir la especie puede ser diferenciado de otros Vibrio por el contenido de ácidos grasos (presencia del ácido graso C17) y la razón G + C del ADN (45 a 47 mol%) (Urdaci et al. 1991).

Jores et al. (2007) fueron los primeros en registrar la presencia de V. navarrensis en muestras de agua de mar (Alemania). Según estos autores, las cepas utilizadas en su trabajo comparten características similares con V. vulnificus, es decir, la capacidad de usar la lactosa como única fuente de carbono y de existir en agua a temperatura ambiente superior a 20 °C. Por otro lado, las cepas presentaron suficiente diferenciación fenotípica y genotípica para clasificarlas como V. navarrensis biotipo pommerensis. Entre estas diferencias, la más prominente es la capacidad para producir hemólisis en sangre de carnero, reconocida como un marcador de virulencia de interés para la salud pública (Takeda 2011) y el cultivo de organismos acuáticos (Austin et al. 2005).

En cuanto a los otros vibrios observados en el presente estudio, las especies V. brasiliensis, V. xuii y V. neptunius fueron aisladas por primera vez de sistemas de cultivo de organismos marinos y acuáticos y descritas en 2003. Inicialmente se relacionaron filogenéticamente con V. tubiashii; sin embargo, estos Vibrio pueden ser diferenciados por medio de sus características fenotípicas, como su composición de ácidos grasos, actividad enzimática y el uso de diferentes fuentes de carbono (Thompson et al. 2003).

La presencia de V. parahaemolyticus en la hemolinfa de camarones en el presente estudio coincide con los resultados obtenidos por Rojlorsakul et al. (1998). La detección de cinco cepas de V. cholerae puede estar relacionada con su presencia en ambientes acuáticos, incluyendo los usados para propósitos de cultivo. Según Worden et al. (2006), esta especie prevalece en ambientes acuáticos; sin embargo, aún no se conoce bien su proliferación y dinámica en ambientes marinos.

Las demás especies identificadas en nuestro trabajo han sido progresivamente aisladas de ambientes marinos y eventualmente podrían asociarse con la acuicultura (Alday-Sanz et al. 2002, Cavallo et al. 2002, Kesarcodi-Watson et al. 2009).

La detección de Vibrio en todas las muestras de hemolinfa analizadas apoya la afirmación, aún escasamente discutida en la literatura científica, que la hemolinfa de camarones peneidos cultivados puede ser colonizada por bacterias sin comprometer la salud de los animales.

 

AGRADECIMIENTOS

La primera autora recibió una beca de la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Los autores agradecen a Jorge L Adeodato Júnior la traducción al inglés.

 

REFERENCIAS

Alapide-Tendencia EV, Dureza LA. 1997. Isolation of Vibrio spp. from Penaeus monodon Fabricius with red disease syndrome. Aquaculture 154: 107-114.         [ Links ]

Alday-Sanz V, Roque A, Turnbull JF. 2002. Clearing mechanisms of Vibrio vulnificus biotype I in the black tiger shrimp Penaeus monodon. Dis. Aquat. Organ. 48: 91-99.         [ Links ]

Antunes F, Hinzmann M, Lopes-Lima M, Machado J, Martins da Costa P. 2010. Association between environmental microbiota and indigenous bacteria found in hemolymph, extrapallial fluid and mucus of Anodonta cygnea (Linnaeus 1758). Microb. Ecol. 60: 304-309. http://dx.doi.org/10.1007/s00248-010-9649-y        [ Links ]

Austin B, Austin D, Sutherland R, Thompson FL, Swings J. 2005. Pathogenicity of vibrios to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) and Artemia nauplii. Environ. Microbiol. 7:1488-1495.         [ Links ]

Cavallo RA, Stabili L. 2002. Presence of vibrios in seawater and Mytilus galloprovincialis (Lam.) from the Mar Piccolo of Taranto (Ionian Sea). Water Res. 36: 3719-3726.         [ Links ]

Costa R, Mermoud I, Koblavi S, Morlet B, Haffner P, Berthe F, Legroumellec M, Grimont P. 1998. Isolation and characterization of bacteria associated with a Penaeus stylirostris disease (Syndrome 93) in New Caledonia. Aquaculture 164: 297-309.         [ Links ]

Elliot EL, Kaysner CA, Jackson L, Tamplin ML. 2001. Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus and other Vibrio spp. In: Food and Drug Administration (FDA), Bacteriological Analytical Manual. FDA, Center for Food Safety and Applied Nutrition, CFSAN.         [ Links ]

Fagutao FF, Koyama T, Kaizu A, Saito-Taki T, Kondo H, Aoki T, Hirono I. 2009. Increased bacterial load in shrimp hemolymph in the absence of prophenoloxidase. FEBS J. 276: 5298-5306. http://dx.doi.org/10.1111/j.1742-4658.2009.07225.x        [ Links ]

Gomez-Gil B, Tron-Mayén L, Roque A, Turnbull JF, Inglis V, Guerra-Flores AL. 1998. Species of Vibrio isolated from hepatopancreas, haemolymph and digestive tract of a population of healthy juvenile Penaeus vannamei. Aquaculture 163: 1-9.         [ Links ]

Gopal S, Otta SK, Kumar S, Karunasagar I, Nishibuchi M, Karunasagar I. 2005. The occurrence of Vibrio species in tropical shrimp culture environments; implications for food safety. Int. J. Food Microbiol. 102: 151-159.         [ Links ]

Jores J, Appel B, Lewin A. 2007. Vibrio navarrensis biotype pommerensis: a new biotype of V. navarrensis isolated in the German Baltic Sea. Syst Appl Microbiol 30, 27-30.         [ Links ]

Kesarcodi-Watson A, Kaspar H, Lategan MJ, Gibson L. 2009. Two pathogens of Greenshell mussel larvae, Perna canaliculus: Vibrio splendidus and a V. coralliilyticus/neptunius-like isolate. J. Fish Dis. 32(6): 499-507. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2761.2009.01006.x        [ Links ]

Mohney LL, Lightner DV, Bell TA. 1994. An epizootic of vibriosis in Ecuadorian pond-reared Penaeus vannamei Boone (Crustacea: Decapoda). J. World Aquacult. Soc. 25: 116-125.         [ Links ]

Noguerola I, Blanch AR. 2008. Identification of Vibrio spp. with a set of dichotomous keys. J. Appl. Microbiol. 105: 175-185. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2672.2008.03730.x        [ Links ]

Olafsen JA, Mikkelsen HV, Giaever HH, Hevik HG. 1993. Indigenous bacteria in hemolymph and tissues of marine bivalves at low temperatures. Appl. Environ. Microbiol. 59: 1848-1854.         [ Links ]

Rengpipat S, Tunyanun A, Fast AW, Piyatiratitivorakul S, Menasveta P. 2003. Enhanced growth and resistance to Vibrio challenge in pond-reared black tiger shrimp Penaeus monodon fed a Bacillus probiotic. Dis. Aquat. Organ. 55: 169-173.         [ Links ]

Rojlorsakul P, Boonsaeng V, Panbangred W, Suthienkul O, Pasharawipas T, Flegel TW. 1998. Detection of Vibrio parahaemolyticus in shrimp haemolymph by DNA hybridization and PCR amplification. In: Flegel TW (ed.), Advances in Shrimp Biotechnology. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Bangkok.         [ Links ]

Soto-Rodriguez SA, Gomez-Gil B, Lozano R, Roque A. 2010. Density of vibrios in hemolymph and hepatopancreas of diseased pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, from Northwestern Mexico. J. World Aquacult. Soc. 41: 76-83. http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-7345.2009.00335.x        [ Links ]

Swanson KMJ, Petran RL, Hanlin JH. 2001. Culture methods for enumeration of microorganisms. In: Downes FP, Ito K (eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. American Public Health Association, pp. 53-62.         [ Links ]

Takeda Y. 2011. Vibrio parahaemolyticus, enterotoxigenic Escherichia coli, enterohemorrhagic Escherichia coli and Vibrio cholerae. Proc. Jap. Acad. Ser. B Phys. Biol. Sci. 87: 1-12.         [ Links ]

Thompson FL, Li Y, Gomez-Gil B, Thompson CC, Hoste B, Vandemeulebroecke K, Rupp GS, Pereira A, De Bem MM, Sorgeloos P, Swings J. 2003. Vibrio neptunius sp. nov., Vibrio brasiliensis sp. nov. and Vibrio xuii sp. nov., isolated from the marine aquaculture environment (bivalves, fish, rotifers and shrimps). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 245-252.         [ Links ]

Urdaci MC, Marchand M, Ageron E, Arcos JM, Sesma B, Grimont PAD. 1991. Vibrio navarrensis sp. nov., a species from sewage. Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 290-294.         [ Links ]

Walling E, Vourey E, Ansquer D, Beliaeff B, Goarant C. 2010. Vibrio nigripulchritudo monitoring and strain dynamics in shrimp pond sediments. J. Appl. Microbiol. 108: 2003-2011. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2672.2009.04601.x        [ Links ]

Worden AZ, Seidel M, Smriga S, Wick A, Malfatti F, Bartlett D, Azam F. 2006. Trophic regulation of Vibrio cholerae in coastal marine waters. Environ. Microbiol. 8: 21-29.         [ Links ]

 

Nota

Traducido al español por Christine Harris.