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Revista Chapingo. Serie horticultura
On-line version ISSN 2007-4034Print version ISSN 1027-152X
Rev. Chapingo Ser.Hortic vol.25 n.3 Chapingo Sep./Dec. 2019 Epub May 29, 2020
https://doi.org/10.5154/r.rchsh.2019.02.002
Artículo científico
Interacción polen-pistilo en olivo (Olea europaea L.) ‘Manzanilla de Sevilla’ bajo autopolinización, polinización libre y cruzada
1Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Coordinación de Alimentos de Origen Vegetal. Carretera a La Victoria km 0.6, Hermosillo, Sonora, C. P. 8300, MÉXICO.
2Universidad de Almería, Departamento de Agronomía, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentaria (ceiA3). La Cañada de San Urbano s/n, Almería, C. P. 04120, ESPAÑA.
El cultivar de olivo (Olea europaea L.) ʻManzanilla de Sevillaʼ sufre a menudo déficit de polinización que dificultan la consecución de una productividad alta. Esta variedad ha sido señalada como completamente autoincompatible por algunos autores, mientras que otros la etiquetan como parcialmente autoincompatible. El objetivo del presente estudio fue determinar el grado de autoincompatibilidad e identificar el obstáculo a la autofecundación en ‘Manzanilla de Sevillaʼ. Para ello, en un huerto multivarietal en El Ejido-Almería, España (36° 50ʼ latitud norte y 2° 24ʼ longitud oeste) se estableció un experimento completamente al azar con cuatro tratamientos de polinización (autopolinización, polinización libre, y polinización cruzada con polen de ʻPicualʼ y de ʻGordal Sevillanaʼ), y se evaluó la adhesión y germinación del polen, el crecimiento del tubo polínico y la fecundación cada tres días después de la polinización. Los análisis mostraron ausencia de diferencias entre tratamientos en cuanto a la adhesión del polen. El efecto de la polinización sobre la germinación del polen fue errático, pues, aunque la polinización libre mostró mayor germinación que la autopolinización al inicio, las diferencias desaparecieron a los nueve días. La reacción de autoincompatibilidad más clara se detectó en el crecimiento del tubo polínico, apreciándose un crecimiento escaso y tardío del tubo polínico bajo autopolinización. La tasa de fecundación más baja se observó con la autopolinización, y la más alta con polinización libre.
Palabras clave autocompatibilidad polen-pistilo; adhesión del polen; germinación del polen; crecimiento del tubo polínico; fecundación
ʻManzanillo’ olive (Olea europaea L.) cultivar suffers from pollination deficits that make it difficult for growers to achieve high productivity. This variety has been designated as completely self-incompatible by some authors, while others label it as partially self-incompatible. The aim of this study was to determine the degree of self-incompatibility and identify obstacles to self-fertilization in ‘Manzanillo’. For this, in a multivarietal orchard in El Ejido-Almería, Spain (36° 50ʼ NL, 2° 24ʼ WL), a completely randomized experiment was established with four pollination treatments (self-pollination, free-pollination, and cross-pollination with pollen from ʻPicualʼ and ʻSevillanoʼ). Pollen adhesion and germination, pollen tube growth and fertilization every three days after pollination were evaluated. Analyses showed no differences among treatments in pollen adhesion. The effect of pollination on pollen germination was erratic, because although free-pollination showed more germination than self-pollination at the beginning, the differences disappeared at nine days after anthesis. The clearest self-incompatibility reaction was detected in the growth of the pollen tube, with little and late growth of the pollen tube under self-pollination. The lowest fertilization rate was observed with self-pollination, and the highest with free-pollination.
Keywords pollen-pistil self-compatibility; pollen adhesion; pollen germination; pollen tube growth; fertilization
Introducción
El olivo (Olea europaea L.) es un cultivo preferentemente alógamo que responde positivamente a la polinización cruzada, lo que produce un incremento del amarre de frutos (Cuevas & Polito, 1997; Lavee & Datt, 1978; Sibbett, Freeman, Ferguson, & Polito, 1992). El sistema que domina las relaciones de autoincompatibilidad en el olivo es complejo (Franklin-Tong & Franklin, 2003; Seifi, Guerin, Kaiser, & Sedgley, 2011), lo cual genera que su estudio sea de gran importancia por su trascendencia en la fecundación de las flores y amarre de frutos, y por ende en los diseños de polinización (selección, número y ubicación de pies polinizadores) en las parcelas.
Algunos autores afirman que el olivo presenta una autoincompatibilidad de tipo esporofítico (Breton, Farinnelli, & Shafiq, 2014; Collani et al., 2012), mientras que otros, atribuyen al olivo una autoincompatibilidad de tipo gametofítico (Ateyyeh, Stosser, & Qrunfleh, 2000; Cuevas & Polito, 1997; Serrano & Olmedilla, 2012). Esta última se caracteriza, aunque con excepciones, por la inhibición del crecimiento del tubo polínico, lo que evita (o dificulta) la autofecundación (de Nettancourt, 1977).
Se han desarrollado diferentes métodos para estudiar el nivel de autocompatibilidad de las plantas cultivadas y silvestres. Uno de los métodos más aceptados es el análisis bajo microscopía de fluorescencia de los procesos que conducen al amarre de frutos (Heslop-Harrison & Heslop-Harrison, 1970), en el cual se analizan los niveles de adhesión y germinación del polen sobre el estigma, el crecimiento del tubo polínico a través del estilo y los niveles de fecundación (Vuletin-Selak, Cuevas, Goreta-Ban, & Perica, 2018). Estos análisis permiten identificar la reacción de autoincompatibilidad de una manera clara cuando se comparan muestras de flores sometidas a tratamientos de autopolinización contra polinización libre o cruzada, con polen de otros cultivares seleccionados previamente. Dada la controversia existente al respecto y la trascendencia de la respuesta autoincompatible del olivo, se planteó como objetivo de este trabajo determinar el grado de autoincompatibilidad e identificar el obstáculo a la autofecundación en ‘Manzanilla de Sevillaʼ.
Materiales y métodos
Material vegetativo y localización de la huerta
El experimento se llevó a cabo en un huerto multivarietal con árboles de diferentes variedades de olivo (ʽPicualʼ, ʻManzanilla de Sevillaʼ, ʻGordal Sevillana’, ʽArbequinaʼ, ʽFrantoioʼ, ʽBlanqueta’ y ʽHojiblancaʼ), localizado en la Estación Experimental de Cajamar, paraje Las Palmerillas, El Ejido, Almería, España, ubicado a los 36° 50ʼ de latitud norte, 2° 24ʼ de longitud oeste y a 84 msnm. Para los experimentos se utilizaron cuatro árboles adultos de 18 años de edad del cultivar ʻManzanilla de Sevillaʼ conducidos en vaso, con marcos de plantación de 6 x 8 m. El manejo del huerto incluía riego por goteo y mantenimiento del suelo mediante no laboreo y eliminación de malezas en forma química y física.
Diseño experimental y tratamientos
El diseño experimental fue completamente al azar con cuatro tratamientos de polinización como fuente de variación, los cuales fueron: autopolinización (AP), polinización libre (PL), y polinización cruzada utilizando polen de ʽGordal Sevillanaʼ (XS) y de ʻPicualʼ (XP).
La AP se logró cubriendo los ramos fructíferos previo a la antesis con bolsas de papel seda. La deposición del polen propio sobre los estigmas se favoreció agitando los ramos continuamente. Por su parte, los ramos sometidos a PL se dejaron sin cubrir recibiendo, sin restricción, el polen dispersado por el viento de los árboles cercanos: ʽPicualʼ, ʻManzanilla de Sevillaʼ, ʻGordal Sevillana’, ʽArbequinaʼ, ʽFrantoioʼ, ʻBlanqueta’ y ʻHojiblanca’ (distancias entre 8 y 30 m). Para los tratamientos de polinización cruzada se aplicó manualmente, con un pincel fino, polen fresco (XS y XP) a los estigmas de las flores abiertas. En todos los casos, la polinización se realizó al inicio de la floración y se repitió cada dos días en dos ocasiones más.
El polen utilizado para la polinización cruzada se recolectó previamente de árboles de ʻGordal Sevillanaʼ y ʻPicualʼ del mismo huerto, siguiendo el procedimiento descrito por Cuevas y Polito (2004). La viabilidad del polen se determinó antes de su uso mediante la prueba de tinción fluorocromática propuesta por Heslop-Harrison y Heslop-Harrison (1970) y ligeramente modificada por Pinillos y Cuevas (2008). La viabilidad del polen fue de 87.1 y 86.7 % para 'Gordal Sevillana' y 'Picual', respectivamente. Las flores con polinización cruzada permanecieron embolsadas antes y después de cada polinización manual.
Interacción polen-pistilo
La interacción polen-pistilo se evaluó en 20 flores de cada tratamiento a los 3, 6 y 9 días después de la polinización (ddp) (60 flores en total por tratamiento). La polinización se realizó el día de antesis, la cual se aseguró eliminando las flores abiertas en un día determinado y las flores cerradas al día siguiente, por lo que todas las flores restantes abrieron entre un día determinado y el siguiente. Los tratamientos se aplicaron como se explicó anteriormente.
Las flores colectadas se fijaron con FAE (formalina, ácido acético glacial y etanol al 70 %, en una proporción 1:2:17 v/v) hasta observación. Las flores fijadas se procesaron de acuerdo con lo expuesto por Cuevas, Rallo, y Rapoport (1994). La tinción se realizó con azul de anilina para realizar las observaciones bajo microscopía de fluorescencia, según lo propuesto por Martin (1958), en un microscopio de epifluorescencia (Nikon Labophot, Tokio, Japón). En cada flor muestreada se cuantificó la adhesión del polen al estigma, la germinación del polen, el crecimiento del tubo polínico y los niveles de fecundación de acuerdo con la fecha de la misma. Los resultados de las 20 flores se promediaron para cada tratamiento y fecha de polinización.
El número de granos de polen adheridos a los estigmas de las flores se estimó contando el número de granos de polen en tres áreas pequeñas del estigma, y luego se calculó a nivel de flor teniendo en cuenta el tamaño promedio del estigma de ‘Manzanilla de Sevilla’ reportado por Griggs, Hartmann, Bradley, Iwakiri, y Whisler (1975). La germinación del polen se expresó en porcentaje, como la relación entre los granos de polen adheridos y los germinados. Un grano de polen se consideró germinado cuando presentó un tubo polínico de al menos una longitud igual al diámetro del polen. El crecimiento del tubo polínico en el estilo de cada flor se evaluó tomando en cuenta los siguientes rangos: nulo (no se observaron tubos polínicos), escaso (menos de cinco tubos polínicos), moderado (de 5 a 25 tubos polínicos) o masivo (más de 25 tubos polínicos), y se expresó en porcentaje de flores encontradas por cada rango de tubos polínicos. Finalmente, una flor se consideró fecundada cuando había un tubo polínico en el micrópilo o un óvulo se había convertido en una semilla en desarrollo, condición comprobada con el tamaño del óvulo (más de tres veces de su tamaño inicial), y los otros tres óvulos se tornaban senescentes (Cuevas et al., 1994; Seifi et al., 2011).
Los valores de adhesión y germinación se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía en un diseño completamente al azar y una comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05). Los datos porcentuales se sometieron a una transformación angular previo a su análisis. Los resultados de fecundación se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado (X 2 ) (P ≤ 0.05). Para los análisis se utilizó el programa Infostat versión 2017e (Universidad de Córdoba, Córdoba, Argentina).
Resultados y discusión
El análisis de la interacción polen-pistilo no mostró diferencias entre tratamientos en la adhesión de los granos de polen (P > 0.05). Se apreció un ligero aumento en el número de granos adheridos en las flores de mayor edad, lo que indica que la receptividad del estigma se mantuvo hasta 9 ddp. Los tratamientos de PL y XS presentaron cerca de 1,900 granos de polen por flor, mientras que con XP y AP se contaron unos 2,000 y 2,200 granos de polen por flor, respectivamente, a los 3 ddp. A los 6 ddp, las diferencias fueron escasas y no significativas (2,700 granos de polen por flor para AP y PL, y 2,800 granos de polen por flor para XS y XP). Las flores de mayor edad (9 ddp) mostraron el mayor número de granos de polen, alcanzando los 3,000 granos en todos los tratamientos, con excepción de XP que obtuvo en promedio 5,500 granos de polen en el estigma (Figura 1a).
![](/img/revistas/rcsh/v25n3//2007-4034-rcsh-25-03-141-gf4.jpg)
Figura 1 Análisis de la varianza de la adhesión (a) y germinación del polen (b) en flores de olivo ‘Manzanilla de Sevilla’ bajo condiciones de autopolinización (AP), polinización libre (PL), y polinización cruzada con polen de ʻGordal Sevillanaʼ (XS) y polen de ‘Picualʼ (XP). Las barras representan la media de 20 observaciones (flores) y su error estándar. Los datos porcentuales fueron sometidos a transformación angular previo a su análisis. zMedias con la misma letra en cada día de muestreo no difieren significativamente (Tukey, P ≤ 0.05).
El porcentaje de granos de polen germinados a los 3 ddp fue de 11.7 % en flores AP, 29.9 % bajo PL, y de 17.1 % en XS y XP. Un notable incremento en la germinación del polen se observó a los 6 ddp para AP, PL y XP, alcanzando valores de 30.6, 44.3 y 22.1 %, respectivamente. El menor nivel de germinación se observó en el tratamiento XS a los 6 ddp, el cual mostró una disminución anómala en los valores (Figura 1b), que se revirtió a los 9 ddp. En esta última fecha, no hubo diferencias significativas entre tratamientos (P > 0.05) (Figura 1b).
La dinámica del crecimiento del tubo polínico en el estilo varió mucho dependiendo del tratamiento de polinización. En este sentido, se observó mayor porcentaje de flores con más tubos polínicos en flores sometidas a los tratamientos de PL, XS y XP. El porcentaje de flores que mostró más tubos polínicos en el estilo fue mucho mayor en condiciones de PL y polinización cruzada (tanto XS como XP), que con AP. Estas diferencias fueron especialmente notables a los 6 y 9 ddp. Con el tratamiento de PL no sólo se observó un número mayor de flores que presentaban tubos polínicos creciendo, sino que, además, fue común ver un número mayor de tubos polínicos por flor. Esto último también se observó en polinización cruzada (XS y XP), situación que rara vez ocurrió con la AP, donde la mayoría de las flores no mostraron ningún tubo polínico en el estilo debido a su detención temprana en el estigma (Figuras 2a y 2b). Como se esperaba, la cantidad de tubos polínicos observados en el tejido de transmisión del estilo fue mayor en las flores más viejas (Cuadro 1), como consecuencia del crecimiento progresivo de tubos polínicos. Este efecto fue más acentuado en los tratamientos de PL y XP, lo que indica la ausencia de rechazo al polen y el crecimiento del tubo polínico sin obstáculos en estos tratamientos.
![](/img/revistas/rcsh/v25n3//2007-4034-rcsh-25-03-141-gf5.jpg)
Figura 2 Crecimiento del tubo polínico en el estilo de ʽManzanilla de Sevillaʼ bajo condiciones de (a) autopolinización y (b) polinización cruzada con polen de ʽGordal Sevillanaʼ a los 9 días después de polinización.
Cuadro 1 Número de tubos polínicos en flores de ʽManzanilla de Sevillaʼ bajo condiciones de autopolinización (AP), polinización libre (PL), polinización cruzada con polen de ʻGordal Sevillanaʼ (XS) y polinización cruzada con polen de ‘Picual’ (XP).
Tratamiento de polinización | ddp1 | Número de tubos polínicos crecidos en el estilo | |||
---|---|---|---|---|---|
0 | 1-5 | 5-25 | > 25 | ||
Porcentaje de flores | |||||
AP | 3 | 100 | 0 | 0 | 0 |
6 | 75 | 25 | 0 | 0 | |
9 | 65 | 35 | 0 | 0 | |
PL | 3 | 100 | 0 | 0 | 0 |
6 | 45 | 50 | 5 | 0 | |
9 | 0 | 30 | 60 | 10 | |
XS | 3 | 95 | 5 | 0 | 0 |
6 | 85 | 15 | 0 | 0 | |
9 | 45 | 65 | 0 | 0 | |
XP | 3 | 95 | 5 | 0 | 0 |
6 | 60 | 30 | 10 | 0 | |
9 | 25 | 75 | 0 | 0 |
1ddp = días después de polinización.
Debido al diferente crecimiento del tubo polínico entre tratamientos de polinización, los niveles de fecundación fueron más altos en flores de PL, XS (Figura 3) y XP, que en las AP, especialmente a los 9 ddp. Con la PL, más de la mitad (65 %) de las flores muestreadas estaban fecundadas a los 9 ddp, mientras que los porcentajes fueron más bajos con XS y XP, con valores de 20 y 15 %, respectivamente. Por su parte, con AP los niveles de fecundación fueron aún más bajos (5 % de las flores) en el mismo periodo muestreado (Cuadro 2). Una prueba de chi-cuadrado señala que a los 9 ddp la tabla de contingencia muestra alejamiento del patrón esperado, lo que indica que los tratamientos de polinización produjeron diferentes niveles de fecundación. Los resultados no fueron significativamente diferentes en las fechas previas, en donde los porcentajes de flores fecundadas fueron superiores con la PL a los 6 ddp (Cuadro 2).
![](/img/revistas/rcsh/v25n3//2007-4034-rcsh-25-03-141-gf6.png)
Figura 3 Fecundación de óvulos procedentes de flores de ʽManzanilla de Sevillaʼ bajo condiciones de polinización cruzada con polen de ʽGordal Sevillanaʼ a los 9 días después de la polinización. Los óvulos se extrajeron del ovario para facilitar su observación.
Cuadro 2 Tabla de contingencia del número de óvulos fecundados en flores bajo autopolinización (AP), polinización libre (PL), polinización cruzada con polen de ʻGordal Sevillanaʼ (XS) y polinización cruzada con polen de ‘Picual’ (XP).
Días después de la polinización | Valor de la prueba (X 2 ) | Tratamientos de polinización | |||
---|---|---|---|---|---|
AP | PL | XS | XP | ||
Número de flores fecundadas | |||||
3 | ------ | 0 | 0 | 0 | 0 |
6 | X 2 (3, N = 20) = 2.5, p = 0.530 | 1 | 3 | 1 | 1 |
9 | X2 (3, N = 20) = 0.06, p = 0.005* | 1 | 13 | 4 | 3 |
*P ≤ 0.05
Los resultados confirman que ʻManzanilla de Sevillaʼ es un genotipo de olivo fuertemente autoincompatible, ya que el tratamiento de AP derivó en niveles muy bajos y significativamente (P ≤ 0.05) menores de fecundación que la PL. La respuesta autoincompatible en ‘Manzanilla de Sevilla’ se caracterizó, sobre todo, por un escaso crecimiento del tubo polínico en el estilo de las flores AP, además de los niveles menores de germinación del polen a los 3 ddp, tal y como lo reportan Vuletin-Selak, Cuevas, Goreta-Ban, y Perica (2014).
Diferentes autores han señalado que en olivo la reacción autoincompatible se caracteriza por la baja capacidad de los tubos polínicos para penetrar más allá de las primeras capas de las células del estigma (lo que pudiera medirse como una menor germinación del polen), así como su incapacidad de crecer en el estilo (Bradley & Griggs, 1963; Cuevas & Polito, 1997), lo que concuerda con lo observado en este trabajo. Este rechazo al polen propio conduce a una reducción severa en el porcentaje de flores fecundadas bajo autopolinización (Shemer et al., 2014; Vuletin-Selak, Perica, Goreta-Ban, & Poljak, 2014). Los análisis de interacción polen-pistilo de este trabajo confirman la respuesta autoincompatible de ʻManzanilla de Sevillaʼ y resaltan el fracaso del grano de polen propio en lograr niveles aceptables de fecundación que permitan una productividad suficiente en las parcelas monovarietales.
La adhesión y la germinación del polen en el estigma no mostraron una respuesta clara, aunque hubo ligeras tendencias de mejora bajo los tratamientos de PL, XS y XP, y en flores de mayor edad. Esta evolución confirma una prolongada receptividad del estigma en olivo (Vuletin-Selak et al., 2014b). La PL en la parcela experimental, dada su condición de huerta multivarietal, alcanzó los mayores niveles de fecundación, por encima de los niveles encontrados bajo polinización cruzada (XB y XS).
Conclusiones
'Manzanilla de Sevilla' es un cultivar fuertemente autoincompatible que necesita de polinización cruzada para alcanzar niveles satisfactorios de fecundación de las flores. Los resultados obtenidos en el análisis de la interacción polen-pistilo indican que el escaso crecimiento del tubo polínico, y por ende los bajos niveles de fecundación, comprometen los niveles de amarre de frutos y la productividad en parcelas estrictamente monovarietales. Esta respuesta sugiere una autoincompatibilidad de tipo gametofítico en ʻManzanilla de Sevillaʼ. La polinización libre en un huerto multivarietal mejora los niveles de fecundación. ʻGordal Sevillanaʼ y ʻPicualʼ aparecen como potenciales polinizadores de ʻManzanilla de Sevillaʼ en España, aunque sus niveles de fecundación quedaron por debajo de los obtenidos con polinización libre.
References
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Recibido: 07 de Diciembre de 2018; Aprobado: 12 de Junio de 2019