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Respuestas al problema bioquímico. Determinación del ciclo umbral y la eficiencia para la PCR cuantitativa en tiempo real

David R. de Alba Aguayo y Angelica Rueda

Correo E: arueda@cinvestav.mx

1) Graficando los valores de fluorescencia (eje Y: unidades arbitrarias, ua) vs el número de ciclo (eje X) para cada gen en ambas condiciones (control, Ctl; y experimental, Exp) obtenemos la siguiente gráfica.

2) La Tabla II contiene los valores del promedio de fluorescencia de los primeros ciclos y la desviación estándar, para cada gen en ambas condiciones experimentales que sirven para calcular la fluorescencia umbral (Ct_f) que nos permite determinar el ciclo umbral (Ct) con la Ecuación 4.

3) La Tabla III contiene los datos calculados para la eficiencia de la reacción (E) mediante el uso de la Ecuación 1, para el gen de interés (GOI) y el gen de referencia (Ref) en ambas condiciones experimentales (control y experimental, CTL y Exp, respectivamente).

4) Utilizando la Ecuación 2 obtenemos que la expresión relativa del gen de interés es de 181 veces más en la condición experimental con respecto a la condición control.

5) Por otra parte utilizando la Ecuación 3 obtenemos que la expresión relativa del gen de interés es de 81.5 veces más en la condición experimental con respecto a la condición control. Entonces, el cambio en la eficiencia si afecta las veces de expresión calculadas, de ahí la importancia de calcular la eficiencia real de la amplificación para no sobreestimar o subestimar las expresiones relativas de los genes de interés.