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Introducción
En los mamíferos la inmunidad innata es de suma importancia para detectar la presencia de patógenos invasores y su activación apropiada es fundamental para la generación de una adecuada respuesta inmunitaria adquirida (Adams, 1979). Por otro lado, los lactobacilos son bacterias gram-positivas, no esporuladas y anaeróbicas que normalmente habitan la cavidad oral y el tracto digestivo de humanos (Pelletier et al., 1997). Recientemente se ha demostrado que la bacteria ácido-láctica Lactobacillus casei incrementa la resistencia innata de animales contra parásitos (Bautista-Garfias et al., 2005). En este sentido, se ha demostrado que L. casei estimula el sistema inmunitario innato por medio de la activación de los receptores tipo Toll presentes en células como los macrófagos y células dendríticas (Maldonado y Perdigón 2006; Kim et al.,2006; Plantinga et al., 2011). En apoyo a lo anterior, se ha señalado que ciertas moléculas y componentes microbianos, pueden mejorar la cantidad y calidad de respuestas de células T antígeno-específicas (Bautista-Garfias y Mosqueda-Gualito 2005, Kwissa et al., 2007; Wille- Reece et al., 2006). En bovinos, la bacteria inmunoestimulante L. casei aplicada junto con la vacuna mixta contra Babesiosis bovina, incrementa la eficiencia de la vacuna (Bautista-Garfias etI al., 2012). Poco se sabe sobre la estimulación de los mecanismos inmunitarios innatos de los bovinos, como aquellos desempeñados por los monocitos y los macrófagos. En este sentido, el presente estudio se realizó para determinar si los monocitos de sangre periférica de los bovinos (que forman parte de la primera línea de defensa del sistema inmunitario) son activados por L. casei in vitro mediante la evaluación morfológica de dichas células, información de la que no se tienen antecedentes.
Método
Animales experimentales
Cuatro bovinos sanos de raza Holstein de 12 meses de edad, machos, con un peso promedio de 260 Kg, libres de brucelosis, tuberculosis, anaplasmosis y babesiosis, se utilizaron como donadores de sangre periférica para la obtención células mononucleares (monocitos). Para el cultivo in vitro, los animales se mantuvieron en corrales adecuados y se les proporcionó una alimentación consistente en paja de avena, alfalfa achicalada, concentrado comercial y agua ad libitum. Es importante precisar que los animales provenían de Amecameca, Estado de México y no tenían antecedentes de ningún tipo de vacunación.
Diseño experimental.
Con los monocitos de cada uno de los cuatro bovinos se etablecieron tres réplicas para cada tratamiento (Lactobacillus casei y testigo) y fecha de evaluación (48 y 72 horas) como se indica.
Obtención de monocitos a partir de sangre periférica.
De cada bovino donador se tomó una muestra de 10 a 25 mL de sangre periférica por punción de la vena yugular en tubos Vacutainer con heparina como anticoagulante, previa asepsia con torundas de algodón y benzal al 70%.
Se utilizó el procedimiento descrito por Birminham y Jesk (1980) modificado por este equipo de trabajo. La sangre obtenida se centrifugó a 450 X g durante 15 minutos, en condiciones de esterilidad se retiró la capa flogística y se suspendió en solución balanceada de Hanks' (HBSS) en una proporción 1:1; posteriormente se preparó un gradiente de densidad (tres volúmenes del gradiente y cuatro volúmenes de la suspensión de los glóbulos blancos en la solución HBSS). La fracción de células obtenidas fue suspendida en medio de cultivo (medio F12 con 30 mM N-Tris (hydroxymethil)-methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) y 26 mM NaHCO3). De la población de células obtenidas se determinó el rendimiento y la viabilidad celular utilizando una tinción con azul de tripán y conteo en la cámara de Neubauer.
Cultivo de células.
Los monocitos aislados de la sangre periférica tuvieron una viabilidad mayor al 95% y fueron incubados durante 120 minutos a 37°C en una atmósfera de CO2 en cajas de Petri (6 cm de diámetro) de polietireno, estériles (1 x 106 monocitos/caja de Petri). Para el ensayo de inmunoestimulación en todas las placas se realizó un lavado con solución de Vega y Murguía -VYM- (Vega et al., 1985), con el fin de retirar las células no adherentes de tal forma que solamente los monocitos adheridos fueran incubados (Birminham y Jesk, 1980) en el medio de MF12 en presencia de L. casei (1x108 ufc/placa), obtenido de acuerdo con Bautista-Garfias et al., (2001) y del tratamiento testigo (solución salina fisiológica -SSF). Cada tratamiento se realizó por triplicado, manteniendo los cultivos in vitro dentro de una incubadora a 37°C con una atmósfera CO2 por 72 horas, realizando cambios de medio cada 24 horas y la evaluación de la morfología a las 48 y 72 horas. Dicha morfología no se evaluó a las 24 horas porque en observaciones preliminares por este mismo equipo de trabajo no se observaron cambios significativos entre las células tratadas o no. Finalmente, las placas fueron lavadas con solución VYM, luego fueron fijadas con metanol y teñidas con colorante de Giemsa para ser evaluadas por medio de microscopia óptica (objetivo de inmersión 100X). La extensión de la circunferencia de la membrana citoplasmàtica (CMP) y la máxima longitud del citoplasma (MLC) en um se determinaron utilizando el programa Leica Application Suite V4.0 con un microscopio LEICA DM5000B (Figura 1). Similarmente los parámetros obtenidos (imágenes) se registraron con la cámara fotogràfica DFC310FX-577514511. Los datos obtenidos se analizaron (bloques al azar) con el paquete de diseños experimentales de la FAUNL, v.2.5 (Olivares, 1994). Las diferencias se consideraron significativas cuando los valores de P fueron < 0.05.
Figura 1 Ejemplo de la determinación de la circunferencia (líneas curvas rojas) y la longitud (líneas rectas rojas) enLadotiaailkis' casei después de 48 horas en cultivo.
Resultados: Los promedios obtenidos(± EEM) de la CMP y MLC para las células testigo (T) y tratadas con L. casei (LC), fueron para CMP: 41.54 (+ 2.08) μm para T y 61.53 (+ 2.30) μm para LC a las 48 horas (P<0.05) y de 35.80 (+ 1.49) μm para T y 68.90 (+ 8.8) μm para LC a las 72 horas (P<0.05). Los valores promedios de la MLC obtenidos fueron de 13.08 (+ 1.05) μm para T y 19.34 (+ 0.86) μu para LC a las 48 horas (P<0.05) y de 11.46 (+ 0.67) μm para T y 21.55 (+ 3.3) μm para LC a las 72 horas (P<0.05) (Figuras 2 y 3).
Figura 2 Circunferencia del citoplasma en pm de monocitos de sangre periférica de bovino a las 48 y 72 horas post-exposición o no a Lactobacillus casei. Cada punto representa el promedio en mm + EEM de las células de cuatro bovinos adultos (20 células/bovino, 12 repeticiones por tratamiento).
Discusión
Las medidas de las células, tratadas o no, fueron evaluadas a las 48 y 72 horas porque a las 24 horas de cultivo in vitro no se observaron diferencias. Los resultados indican que la extensión de la circunferencia de la membrana citoplasmàtica y la máxima longitud promedio del citoplasma fueron significativamente más grandes (P <0.05) en las células con L. casei que en las células que recibieron el tratamiento testigo, lo cual indica activación de las primeras que mostraron una morfología compatible con la de los macrófagos en tan solo 72 horas, tiempo significativamente más corto al requerido en otros estudios para obtener macrófagos in vitro a partir de monocitos de sangre periférica, que es de 120 a 192 horas (Jungi et al., 1996; Saldarriaga et al., 2003, Werlinget al, 2004) . En este sentido, los resultados obtenidos sugieren que las bacterias inmunoestimulantes (L. casei) utilizadas activan a los monocitos a través de la estimulación de receptores tipo Toll en su superficie y posterior desencadenamiento de vías de señalización para que se transformen más rápidamente en macrófagos y desempeñen funciones protectoras contra agentes patógenos. En este contexto, se sabe que los monocitos normalmente desempeñan funciones similares a las de los macrófagos, pero en menor escala (Ross y Auger, 2002). Con B base en los cambios morfológicos observados, se concluye que los monocitos de bovino expuestos in vitro a L. casei se activan y se tranforman rápidamente en macrófagos. En este sentido, los resultados obtenidos con la metodología utilizada permitirán llevar a cabo más estudios para determinar la producción de citocinas y otros productos (óxido nítrico) en monocitos de bovino estimulados con L. casei.
