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Revista Chapingo serie ciencias forestales y del ambiente
On-line version ISSN 2007-4018Print version ISSN 2007-3828
Rev. Chapingo ser. cienc. for. ambient vol.29 n.1 Chapingo Jan./Apr. 2023 Epub June 23, 2024
https://doi.org/10.5154/r.rchscfa.2022.08.057
Artículos científicos
Protocolos de extracción de ARN total a partir del tejido embrionario de nuez pecanera (Carya illinoinensis [Wangenh.] K. Koch)
1Universidad Autónoma Chapingo, Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas. km 40 Carretera Torreón-Chihuahua. C. P. 35230. Bermejillo, Durango, México.
2Universidad Juárez del Estado de Durango, Facultad de Ciencias Biológicas. Fracc. Universidad, Filadelfia. C. P. 35010. Gómez Palacio, Durango, México.
3Universidad Autónoma Chapingo, División de Ciencias Forestales. Carretera México-Texcoco km 38.5. C. P. 56230. Texcoco, Estado de México, México.
Introducción:
Los estudios de expresión génica requieren protocolos de extracción que permitan la obtención de ARN de alta calidad, especialmente cuando se trabaja con tejidos ricos en polisacáridos, lípidos y polifenoles como el tejido embrionario de nuez pecanera (Carya illinoinensis [Wangenh.] K. Koch).
Objetivo:
Evaluar la eficiencia de ocho métodos de extracción de ARN total a partir de tejido embrionario de nuez pecanera.
Materiales y métodos:
Se evaluaron ocho protocolos de extracción de ARN total basados en el reactivo TRI Reagent®, buffer CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y un kit comercial. El rendimiento y calidad de ARN total se determinaron por espectrofotometría (UV/visible). La viabilidad e integridad del ARN se analizó mediante RT-PCR utilizando actina como gen de referencia.
Resultados y discusión:
Los protocolos de extracción basados en el reactivo TRI Reagent® permitieron la obtención de concentraciones altas de ARN total, pero con grado elevado de contaminación. Mediante el uso del kit comercial fue posible la extracción de ARN total, pero sin la pureza óptima esperada. Finalmente, los protocolos basados en el buffer CTAB consiguieron rendimientos de ARN total de calidad óptima.
Conclusiones:
La calidad del ARN total varía de acuerdo con la eficiencia del método utilizado. El protocolo CTAB 4 representa una alternativa eficaz para el aislamiento de ARN de tejidos embrionarios de C. illinoinensis.
Palabras clave: nogal pecanero; ácido ribonucleico; bromuro de cetiltrimetilamonio; polifenoles; PCR de transcripción inversa
Introduction:
Gene expression studies require extraction protocols that allow obtaining high quality RNA, especially when working with tissues rich in polysaccharides, lipids and polyphenols such as pecan nut (Carya illinoinensis [Wangenh.] K. Koch) embryo tissue.
Objective:
To evaluate the efficiency of eight methods of total RNA extraction from pecan nut embryo tissue.
Materials and methods:
Eight total RNA extraction protocols based on TRI Reagent®, CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) buffer and a commercial kit were evaluated. Total RNA yield and quality were determined by spectrophotometry (UV/visible). RNA viability and integrity were analyzed by RT-PCR using actin as a reference gene.
Results and discussion:
Extraction protocols based on TRI Reagent® provided high concentrations of total RNA, but with a high degree of contamination. The commercial kit was used to extract total RNA, but without the expected optimal purity. Finally, protocols based on CTAB buffer achieved total RNA yields of optimal quality.
Conclusions:
The quality of total RNA varies according to the efficiency of the method used. The CTAB 4 protocol represents an efficient alternative for the isolation of RNA from embryonic tissues of C. illinoinensis.
Keywords: pecan nut; ribonucleic acid; cetyltrimethylammonium bromide; polyphenols; reverse transcription PCR
Ideas destacadas:
La presencia de polifenoles y polisacáridos dificultan la extracción de ARN total de nuez pecanera.
Se evaluaron protocolos de extracción de ARN basados en TRI Reagent®, buffer CTAB y un kit comercial.
La calidad del ARN total varió de acuerdo con la eficiencia del método utilizado.
El reactivo TRI Reagent® permitió concentraciones altas de ARN total, pero contaminado.
El buffer CTAB garantizó la obtención y calidad de ARN total del tejido embrionario de nuez pecanera.
Introducción
El nogal pecanero (Carya illinoinensis [Wangenh.] K. Koch), por su extensa adaptación climática y alta rentabilidad, es una especie cultivada ampliamente en el norte de México (Cruz-Álvarez et al., 2020; Orona Castillo, Sangerman-Jarquín, Fortis Hernández, Vázquez Vázquez, & Gallegos Robles, 2013). Las regiones con poblaciones del género Carya poseen condiciones extremas de temperaturas elevadas y precipitación baja, particularmente en otoño, situación que, en combinación con la humedad elevada, propicia la viviparidad de la nuez en árboles criollos que crecen en poblaciones espontáneas (Sparks, 2005), así como en huertas comerciales (Rodríguez-González et al., 2022). Debido a la importancia comercial de C. illinoinensis, la viviparidad ha sido objeto de estudio y varias investigaciones reportan el control de este fenómeno (Barrera, Guillen, Tamargo, Rangel, & Murrieta, 2017; García-Moreno, Báez-Sañudo, Mercado-Ruiz, García-Robles, & Núñez-Moreno, 2020; Wood, 2015); sin embargo, el mecanismo molecular de la expresión de genes relacionados con la viviparidad se encuentra poco documentado, por lo que resulta importante el estudio de estos. Los análisis de expresión génica se han utilizado ampliamente en la investigación biológica y han contribuido en avances significativos para la comprensión de los mecanismos moleculares de problemas fisiológicos complejos como la germinación prematura de la semilla, aun cuando todavía está unida a la planta.
Los avances en biología molecular proveen las herramientas necesarias para el estudio de las plantas a nivel molecular. Algunas técnicas son útiles en la caracterización del germoplasma, identificación a nivel genómico y expresión de genes contribuyendo a un mejor entendimiento de la genética y la regulación transcripcional (Liu et al., 2012). No obstante, estos estudios no serían posibles sin el aislamiento de ARN total (ácido ribonucleico) de calidad, ya que constituye el primer paso para el desarrollo de otras técnicas moleculares y asegura los resultados de procedimientos downstream (posteriores a la etapa de extracción de ARN) (Sandoval-Pineda, Ochoa-Corona, & Torres-Rojas, 2017).
La obtención de ARN de calidad a partir de tejidos de plantas leñosas y perennes es desafiante debido a las concentraciones altas de polisacáridos, polifenoles y otros metabolitos secundarios (Gambino, Perrone, & Gribaudo, 2008). En el caso particular del tejido embrionario de la nuez pecanera, la obtención de ARN de baja calidad es frecuente debido a la presencia de compuestos fenólicos totales, flavonoides y proantocianidinas o taninos condensados que pueden ser fácilmente oxidados, además de ácidos grasos como tocoferoles y fitoesteroles (Flores-Cordova, Muñoz-Márquez, Ojeda-Barrios, Soto-Parra, & Preciado-Rangel, 2017; Reyes, 2016). Debido a la interferencia de estos compuestos secundarios, los protocolos de extracción estándar requieren modificaciones para el aislamiento de ácidos nucleicos de alta calidad y con buen rendimiento. A la fecha, se ha reportado el uso de algunos protocolos para la extracción de ARN y ADN de raíz, tallo, hoja y fruto del género Carya (Mattison et al., 2017; Qiu et al., 2016; Zheng et al., 2010). Dichos protocolos usan fenol, trizol, dodecil sulfato de sodio (SDS), cloruro de litio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB). También se han utilizado kits comerciales de extracción debido a su alta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, como el mini kit RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD, EUA) y el mirVana miRNA isolation kit (Ambion/Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) para la extracción de ARN de brotes florales de Carya cathayensis Sarg. (Tongqiang, Qixiang, Yuanyuan, Wang, & Huang, 2020; Wang, Huang, Sun, & Zheng, 2015); sin embargo, la calidad y rendimiento de ARN total varía entre las metodologías y el tejido vegetal utilizado. Esto debido a que varios compuestos secundarios coprecipitan con el ARN exponiéndolo a degradación por ARNasas (George, 2018). En el presente estudio se evaluó la eficiencia de extracción de ARN total de alta calidad para ser utilizado en ensayos posteriores de expresión génica, a partir de tejido embrionario de nuez pecanera de nogales criollos (C. illinoinensis) de una población espontánea.
Materiales y métodos
Material vegetal y condiciones del cultivo
Las muestras de nuez pecanera se obtuvieron de nogales criollos adultos pertenecientes a una población espontánea de más de 50 años. El criterio de selección de los árboles fue una altura aproximada de 15 m y circunferencia de 90 cm (medida a 60 cm a partir del suelo). Las nueces se colectaron de 10 árboles durante la etapa de maduración (septiembre) en el 2020, con dos características: nuez madura normal y nuez madura con embrión germinado. Para el análisis, las nueces se envolvieron en papel aluminio, se pusieron en hielo inmediatamente y luego se almacenaron a -20 °C hasta su procesamiento.
La población de árboles criollos está situada en el municipio de Nazas estado de Durango, México, con coordenadas geográficas 25° 13´ 34´´ LN y 104° 06´ 39´´ LO y elevación de 1 250 m. El clima es seco (BWhw(w)(e)) con lluvias en verano, precipitación anual de 330.8 mm y evaporación media anual de 2 259.3 mm. La temperatura media anual es 20.2 °C (Servicio Meteorológico Nacional [SMN], 2020).
Extracción de ARN total
El proceso de extracción de ARN se realizó en el Laboratorio de Ecología Microbiana y Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Juárez del Estado de Durango.
Los protocolos se desarrollaron en un área descontaminada y libre de nucleasas para evitar la degradación del ARN. Los buffers de extracción y soluciones se esterilizaron mediante filtros de 0.22 µm. Los insumos se esterilizaron por calor y presión en una autoclave. Las cámaras de electroforesis y fotodocumentador se trataron con agua DEPC (dietilpirocarbonato).
Para el proceso de extracción de ARN total se inició con 100 mg de tejido embrionario de nuez previamente homogeneizado mediante maceración con nitrógeno líquido. Se evaluaron ocho protocolos que han sido documentados por su efectividad para la extracción de ARN de muestras vegetales con contenidos altos de lípidos, fenoles y polisacáridos. Dichos protocolos se describen a continuación.
TRIzol 1 (TRI Reagent®; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA): El ARN total se obtuvo de acuerdo con el protocolo reportado por Li, Zhang, Liao, y Liu (2014). Las soluciones de extracción utilizadas fueron TRI Reagent®, β-mercaptoetanol, acetato de potasio 2.5 M (pH 5.2) y cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). El ARN total se precipitó con isopropanol durante 30 min a -20 °C, seguido de dos lavados con etanol al 70 %. El pellet se secó a temperatura ambiente y rehidrató en agua DEPC.
TRIzol 2 (TRI Reagent®; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA): El ARN total se extrajo de acuerdo con el protocolo proporcionado por el proveedor. La solución de extracción es una mezcla de tiocianato de guanidina y fenol. El ARN total se precipitó con isopropanol durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de un lavado con etanol al 70 %. El pellet se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en agua DEPC.
TRIzol 3 (TRI Reagent®; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA): La extracción de ARN total se realizó mediante el procedimiento reportado por Ortega-González et al. (2018). El ARN total se precipitó en una mezcla de isopropanol y acetato de sodio 3 M durante toda la noche a -20 °C, seguido de dos lavados con etanol al 70 % y nuevamente se precipitó por 30 min a -20 °C. El pellet se secó a temperatura ambiente y se disolvió en agua DEPC.
Kit RNeasy® Power Plant® (QIAGEN, Germantown, MD, EUA): El ARN total se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El método utiliza la solución BML (sales de guanidina) como buffer de lisis, β-mercaptoetanol y una solución de separación fenólica (PSS). El ARN se purificó mediante centrifugación en columnas con membrana de sílice; para su elución se añadieron 50 μL de agua libre de ARNasas, se incubó 1 min a temperatura ambiente y centrifugó 1 min a 14 000 rpm para su almacenamiento posterior.
CTAB 1: El ARN total se aisló mediante el protocolo descrito por Rubio-Piña y Zapata-Pérez (2011). La extracción se llevó a cabo mediante el buffer de extracción 1 basado en el detergente iónico CTAB (CTAB 2 %, Tris-HCl 100 mM [pH 8], NaCl 1.4 M, EDTA 20 mM [pH 8], PVP 2 %) y β-mercaptoetanol (adicionado justo antes de su uso), seguido de dos extracciones más con fenol:cloroformo (1:1) y cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). La precipitación del ARN total fue con LiCl (8 M) durante 4 h a -20 °C, seguido de un primer lavado con etanol al 96 % y un segundo lavado con etanol al 70 %. El pellet se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en agua DEPC.
CTAB 2: La extracción de ARN total se realizó mediante el protocolo descrito por Rubio-Piña y Zapata-Pérez (2011) con modificaciones. El ARN total se obtuvo con el buffer de extracción 1 CTAB (CTAB 2 %, Tris-HCl 100 mM [pH 8], NaCl 1.4 M, EDTA 20 mM [pH 8], PVP 2 %) y β-mercaptoetanol (adicionado justo antes de su uso). La variante respecto al protocolo anterior fue la realización de dos extracciones más con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). El ARN se precipitó en LiCl (8 M) durante 4 h a -20 °C, seguido de un primer lavado con etanol al 96 % y un segundo lavado con etanol al 70 %. El pellet se secó a temperatura ambiente y se disolvió en agua DEPC.
CTAB 3: Para la obtención de ARN total se siguió el proceso reportado por Salinas et al. (2019), modificando los volúmenes manejados. Se añadieron 600 μL del buffer de extracción 2 basado en CTAB (CTAB 2 %, PVP 2 %, Tris-HCl 100 mM [pH 8], NaCl 2 M, EDTA 25 mM, espermidina 0.05 %) y 100 μL de β-mercaptoetanol justo antes de su uso. La muestra se incubó 10 minutos a 65 °C. Posteriormente se agregaron 500 μL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se mezcló en vortex. La muestra se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante (color amarillo) se transfirió a un tubo nuevo y se reservó en hielo. Al precipitado se realizó una segunda extracción con un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Los sobrenadantes se combinaron y el ARN total se precipitó en LiCl 10 M durante toda la noche a 4 °C. Seguido de un lavado con etanol al 75 %. La muestra se centrifugó a 10 000 rpm durante 20 min a 4 °C y el pellet se secó a temperatura ambiente y rehidrató en agua DEPC.
CTAB 4: El ARN total se obtuvo con base en el método descrito por Chang, Puryear, y Cairney (1993) con algunas modificaciones. Los volúmenes utilizados fueron menores que los reportados y se eliminó la incubación a 65 °C del buffer de extracción. Para la extracción se añadieron 600 µL del buffer de extracción 2 (CTAB 2 %, PVP 2 %, Tris-HCl 100 mM [pH 8], NaCl 2 M, EDTA 25 mM, espermidina 0.05 %) y 100 µL de β-mercaptoetanol justo antes de su uso. El volumen se mezcló en vortex y se añadieron 600 µL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). La muestra se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min a 4 °C, seguido de una segunda extracción con 600 µL fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), se mezcló en vortex y centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min a 4 °C; en el protocolo original reportaron el uso de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). El ARN total se precipitó en 175 µL de LiCl 8 M (en el protocolo original reportaron el uso de LiCl 10 M), durante toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, el ARN se centrifugó 20 min a 10 000 rpm. El precipitado fue disuelto en 500 µL de buffer SSTE (NaCl 1 M, SDS 0.5 % y Tris-HCl 10mM [pH 8]) y se realizó una nueva extracción con 500 µL fenol:cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1); en el protocolo original reportaron el uso de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Adicionalmente, el ARN total se lavó con 800 µL de etanol al 70 % y se precipitó durante 2 h a -20 °C. El pellet se secó a temperatura ambiente y se disolvió en agua DEPC.
Evaluación de la integridad y calidad del ARN
La extracción de ARN total se evaluó mediante la cantidad, pureza e integridad, a través de espectrofotometría (NanoDrop 2000, UV/Vis, Thermo Scientific) y por electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1 %.
La concentración del ARN total se midió mediante la densidad óptica a 260 nm y la pureza se confirmó por la relación de los índices de absorbancia a 260 y 280 nm (A260/280), así como a 260 y 230 nm (A260/230) para evaluar la presencia de proteínas o compuestos fenólicos. Una relación A260/230 entre 1.8 y 2.0 indica ARN de buena calidad mientras que por debajo de 1.8 sugiere ARN contaminado y <1.5 ARN altamente contaminado con compuestos fenólicos, carbohidratos, EDTA y otros contaminantes con absorción UV a 230 nm. Mientras que la relación A260/280 debe estar entre 2.0 y 2.2 para considerar una pureza óptima y >1.7 para una pureza aceptable. Si la proporción es menor de 1.7 indica contaminación con proteínas u otros contaminantes con absorción UV a 280 nm (Silveira de Campos et al., 2017).
La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa-MOPS-formaldehído, a 50 V durante 45 min, utilizando MOPS 1X como tampón de electroforesis. Se utilizó Gel Red® (Biotium, Hayward, CA, EUA) para tinción del ARN. Los geles se visualizaron con luz ultravioleta en un fotodocumentador UVP® MultiDoc It Imaging System.
Síntesis de ADNc por RT-PCR
La calidad de ARN extraído con cada protocolo se evaluó mediante reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). Todas las muestras de ARN total se trataron con DNasa I (libre de ARNasa) (Invitrogen, Waltham, MA, EUA) según las especificaciones del fabricante y luego se retrotranscribieron a ADNc de primera cadena mediante el uso de un cebador Oligo-(dT) y Transcriptasa Reversa M-MLV RT (Promega, Fitchburg, WI, EUA) siguiendo las indicaciones del proveedor. El ADNc se amplificó utilizando la enzima Taq polimerasa (Jena Bioscience, Dortmund, Alemania) con las especificaciones del fabricante. Se utilizaron oligonucleótidos del gen constitutivo actina de C. illinoinensis: F 5´CGATGCCCTGAGGTTCTATTC 3´ y R 5´GATCCTCCAATCCAGACACTATAC 3´para amplificar un producto de 266 pb. Dichos iniciadores se diseñaron a través de la plataforma en línea IDT (Integrated DNA Technologies) con base en la secuencia del genoma completo de C. illinoinensis cultivar 87MX3-2.11 (CM028997.1) (Platts et al., 2021), obtenida a través del GenBank del Centro de Información Biotecnológica (NCBI). Para una reacción estándar de RT-PCR de 25 µL, se utilizaron 40 ng∙µL-1 de ARN total. El programa de amplificación por PCR incluyó una desnaturalización inicial de 2 min a 92 °C; posteriormente, 35 ciclos que comprenden las etapas siguientes: desnaturalización a 95 °C durante 15 s, alineamiento 55 °C durante 15 s y extensión 72 °C durante 1 min 30 s; y una extensión final de 2 min a 72 °C. Los productos amplificados se separaron en un gel de agarosa al 2 %, teñidos con Gel Red® (Biotium, Hayward, CA, EUA), a 75 V durante 45 min y se visualizaron con luz ultravioleta en un fotodocumentador UVP® MultiDoc It Imaging System.
Análisis estadístico
Las diferencias entre las absorbancias y concentraciones obtenidas, para cada uno de los protocolos, se determinaron con un modelo de análisis de varianza (ANOVA) con tres repeticiones y una prueba de medias de Tukey (P < 0.05). Para ello se usó el programa SAS versión 9.4 (SAS Institute, 2017).
Resultados
Los protocolos de extracción de ARN generalmente se evalúan en términos de cantidad, calidad e integridad para RT-PCR, qPCR, construcción de bibliotecas de ADNc y análisis de expresión de genes (Zhihui et al., 2015).
En cuanto a los protocolos de extracción basados en el reactivo TRI Reagent®, la concentración de ARN total (Cuadro 1) fue mayor con el método TRIzol 3, tanto en nuez madura como en germinada, con valores promedio de 2 298.9 ng∙µL-1 y 1 456.6 ng∙µL-1, respectivamente. Asimismo, con el protocolo TRIzol 1 se obtuvo un promedio de 1 333.4 ng∙µL-1 en nuez madura y 537.6 ng∙µL-1 en nuez germinada. El rendimiento promedio de ARN obtenido con TRIzol 2 fue de 240.2 ng∙µL-1 en nuez madura y 359.4 ng∙µL-1 en nuez germinada. En cuanto a la calidad, las muestras presentaron una relación A260/230 < 1.5 y A260/280 < 1.7 (Cuadro 2), valores por debajo del rango de pureza aceptable, lo que indica alta contaminación por proteínas y compuestos fenólicos.
La extracción de ARN mediante RNeasy® Power Plant® Kit produjo muestras con concentraciones promedio de 663.3 ng∙µL-1 para el tejido de nuez madura y 60.1 ng∙µL-1 para muestras de nuez germinada (Cuadro 1). Para nuez madura se obtuvieron valores de pureza aceptable (A260/280 > 1.7) aunque con posible contaminación con proteínas y fenoles (A260/230 < 1.5). En el caso de nuez germinada, los valores de absorbancia indicaron ARN altamente contaminado (A260/230 < 1.5 y A260/280 < 1.7) (Cuadro 2).
La concentración promedio de ARN total con el método CTAB 1 y el uso de fenol:cloroformo (1:1) y cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) en el proceso de extracción, fue de 600 a 700 ng∙µL-1 con un rango de calidad aceptable (A260/280 > 1.7), aunque con presencia de compuestos contaminantes (A260/230 < 1.5). En el caso del protocolo CTAB 2 y la adición de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) se obtuvieron hasta 739.4 ng∙µL-1 de ARN total de nuez madura y 372.9 ng∙µL-1 de ARN total de nuez germinada, sin diferencias en calidad con referencia al protocolo CTAB 1. Asimismo, con el protocolo CTAB 3, las concentraciones de ARN total fueron similares a las obtenidas con CTAB 1 y CTAB 2 (400-600 ng∙µL-1) con valores de absorbancia aceptables (A260/280 > 1.7) y presencia de contaminantes (A260/230 < 1.5).
Finalmente, el protocolo CTAB 4 permitió la obtención de concentraciones de ARN total de 400 ng∙µL-1 y el incremento de la pureza tanto en nuez madura (A260/230 = 1.89 y A260/280 = 2.07) como en nuez germinada (A260/230 = 1.87 y A260/280 = 1.86), disminuyendo la presencia de lípidos y compuestos fenólicos en comparación con los siete protocolos antes citados. Por tanto, la extracción de ARN en menor volumen y el uso de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) representan una alternativa eficaz para el aislamiento de ARN de los tejidos embrionarios de la nuez pecanera, ya que dicho protocolo permite la obtención de ARN total de buena calidad para análisis de qPCR posteriores.
Cuadro 1 Lecturas espectrofotométricas usadas para evaluar la cantidad del ARN total de tejidos embrionarios de nuez madura normal y nuez madura con embrión germinado de Carya illinoinensis.
| Protocolo | Nuez madura (ng∙µL-1) | Nuez germinada (ng∙µL-1) |
|---|---|---|
| TRIzol 1 | 1 333.4 ab | 537.6 b |
| TRIzol 2 | 240.2 b | 359.4 b |
| Kit | 663.3 b | 60.1 c |
| TRIzol 3 | 2 298.9 a | 1 456.6 a |
| CTAB 1 | 685.2 b | 712.2 ab |
| CTAB 2 | 739.4 ab | 372.9 b |
| CTAB 3 | 611.7 b | 485.3 b |
| CTAB 4 | 421.6 b | 425.1 b |
Concentraciones medias (n = 3) con las mismas letras dentro de una misma columna son estadísticamente iguales de acuerdo con la prueba de Tukey (P > 0.05).
Cuadro 2 Lecturas espectrofotométricas usadas para evaluar la calidad del ARN de tejidos embrionarios de nuez madura normal y nuez madura con embrión germinado de Carya illinoinensis.
| Protocolo | Nuez madura | Nuez germinada | ||
|---|---|---|---|---|
| A260/230 | A260/280 | A260/230 | A260/280 | |
| TRIzol 1 | 0.41 d | 1.66 b | 0.62 c | 1.13 b |
| TRIzol 2 | 0.48 d | 1.20 c | 0.41 d | 1.63 b |
| Kit | 1.30 b | 1.97 b | 0.32 d | 1.25 b |
| TRIzol 3 | 0.39 d | 1.06 c | 0.45 d | 1.07 b |
| CTAB 1 | 1.16 b | 1.87 b | 1.25 b | 1.80 a |
| CTAB 2 | 1.11 b | 1.79 b | 1.07 c | 1.77 a |
| CTAB 3 | 0.86 c | 1.70 b | 1.29 b | 1.84 a |
| CTAB 4 | 1.89 a | 2.07 a | 1.87 a | 1.86 a |
Valores medios (n = 3) de pureza con las mismas letras dentro de una misma columna son estadísticamente iguales de acuerdo con la prueba de Tukey (P > 0.05).
Evaluación de la integridad y calidad del ARN obtenido
En cuanto a la integridad del ARN total, en la mayoría de los protocolos se visualizaron dos bandas consecutivas claras, características del ácido ribonucleico, confirmando su pureza. La integridad fue nula en los métodos TRIzol 1 y TRIzol 3, indicando la degradación del ARN, mientras que en los cuatro protocolos basados en CTAB se conservó. De igual forma, en las muestras de ARN obtenidas con el kit se logró confirmar su integridad, aunque con remanentes de ciertos compuestos que interfirieron en su calidad (Figura 1).
Síntesis de ADNc y RT-PCR
Con el fin de evaluar la efectividad de los protocolos de extracción de ARN se diseñó un par de iniciadores de referencia para la detección del gen actina de C. illinoinensis. La electroforesis mostró alta especificidad y demostró la presencia de este gen en el tejido embrionario de nuez pecanera.
En particular, la extracción mediante los protocolos basados en el reactivo TRI Reagent® presentó concentración alta de ARN; sin embargo, al estar contaminado con compuestos fenólicos y ser usado en la reacción de RT-PCR, produjo bajos rendimientos en los productos amplificados para las dos condiciones de nuez pecanera (Figura 2). En el caso del ARN obtenido mediante el kit y CTAB 1, la amplificación se logró solo en nuez germinada. La amplificación negativa en nuez madura pudo deberse a la presencia de inhibidores como el buffer de lisis o algunos detergentes que interfirieron en la eficiencia de la reacción RT-PCR (Sandoval-Pineda et al., 2017). Por otra parte, el ARN obtenido con los protocolos CTAB 2, CTAB 3 y CTAB 4 generó una banda clara en comparación con el resto de los protocolos; esto indica que la pureza del ARN está estrechamente relacionada con la eficiencia de amplificación en la reacción de RT-PCR. Estos resultados confirman que, aunque se obtuvieron cantidades de RNA relativamente bajas con los protocolos CTAB, el ARN total fue de buena calidad y puede ser utilizado en estudios downstream de expresión génica.
Figura 2 Evaluación de la eficiencia de la reacción de RT-PCR a partir de ARN obtenido del tejido embrionario de nuez pecanera madura (A) y con embrión germinado (B) de Carya illinoinensis mediante ocho metodologías de extracción y el gen actina (266 pb). El pocillo 1 corresponde al marcador de peso molecular (mpm) de 100 pb (Promega, Fitchburg, WI, EUA).
Discusión
Se ha reportado gran cantidad de protocolos de extracción de ácidos nucleicos de calidad a partir de tejidos vegetales; no obstante, los métodos siguen siendo empíricos, debido a la variabilidad en su composición (Sánchez-Coello et al., 2012).
El reactivo TRI Reagent® se ha utilizado con éxito en la extracción de ARN de especies vegetales, ya que al ser una solución monofásica solubiliza el material biológico y desnaturaliza las proteínas y, cuando es combinado con cloroformo, permite la separación de fases, donde la proteína se extrae a la fase orgánica, el ADN se queda en la interfaz y el ARN permanece en la fase acuosa (Martínez-López, Lesher, & Jiménez-García, 2013; Ma & Li, 2022). En este estudio, los protocolos basados en el reactivo TRI Reagent® mostraron los mayores rendimientos en concentración, pero con mayor grado de contaminación. Es posible que la baja calidad de ARN obtenida en estos protocolos se deba a la contaminación de compuestos fenólicos y lípidos característicos de la nuez pecanera. Algunos autores han reportado que el ARN de Hyptis suaveolens (L.) Poit., Prosopis juliflora (Sw.) DC. y hongos ascomicetes Xylaria sp., extraído mediante TRI Reagent® puede ser de baja calidad debido a la presencia de mucílago, metabolitos secundarios, polisacáridos, fenoles y carbohidratos (Michel-López et al., 2018; Ortega-González et al., 2018; Sandoval-Pineda et al., 2017). Asimismo, algunos autores mencionan que los polifenoles son liberados y mezclados con los ácidos nucleicos durante el proceso de lisis celular y, en consecuencia, la calidad y el rendimiento del ARN disminuyen (Ferriol-Marchena, Luis-Pantoja, Ruiz, Hernández-Rodríguez, & Pérez-Castro, 2015). Lo anterior debido a la actividad catecolasa de los polifenoles que les permite acoplarse a los ácidos nucleicos degradándolos o provocando que precipiten con ellos. Se ha reportado que el uso de acetato de sodio concentrado (3 M) permite una precipitación efectiva de ARN eliminando los polisacáridos y proteínas contaminantes (George, 2018); sin embargo, los resultados en este estudio difieren, ya que, aunque se obtuvieron concentraciones altas no fue posible la viabilidad e integridad del ARN total, lo cual podría deberse al tipo de tejido y la especie utilizada para el procedimiento de extracción.
En el caso del kit comercial, el sistema RNeasy® Power Plant® Kit es recomendado por el fabricante para una extracción efectiva de ARN total de diversos tejidos vegetales con altos contenidos de fenoles y polisacáridos. En este estudio, aunque se logró extraer ARN total de la nuez pecanera no se alcanzó la pureza óptima esperada. Según Sánchez-Rodríguez y colaboradores (2008), cuando se emplean kits de extracción puede existir contaminación por la presencia de azúcares residuales, ya que estos son capaces de establecer interacciones hidrofóbicas con la matriz.
Los protocolos que utilizan al CTAB como parte esencial del buffer de extracción son métodos convencionales para el aislamiento de ácidos nucleicos de tejidos vegetales ricos en polisacáridos y polifenoles. Generalmente, el CTAB se usa en interacción con detergentes como el SDS, disolventes orgánicos desnaturalizantes como el fenol y el cloroformo, y agentes reductores como el β-mercaptoetanol (Gambino et al., 2008). En este estudio, los protocolos basados en el buffer CTAB produjeron rendimientos de ARN total aceptables, al incrementar la pureza y disminuir la presencia de contaminantes. Específicamente, el protocolo CTAB 4 mostró los mejores resultados tanto de concentración como de calidad para los dos tipos de nuez, lo cual se confirmó con la amplificación por RT-PCR del fragmento del gen actina de 266 pb. El protocolo de CTAB como buffer en interacción con Tris-HCl, NaCl, EDTA, PVP, espermidina, β-mercaptoetanol y LiCl es un proceso eficiente, ya que consta de la combinación de extracciones con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1); estas logran reducir las pérdidas de ARN total, debido a la formación de complejos insolubles en la interfase, desnaturalización de proteínas y separación correcta de ácidos nucleicos (Djami-Tchatchou & Straker, 2012; Thermo Fisher Scientific, 2021).
Estudios similares han reportado que el uso de agentes como CTAB y LiCl incrementa la pureza de ARN de manera significativa en organismos con contenido alto de contaminantes (Martínez et al., 2013; Sánchez et al., 2008). El CTAB es capaz de formar complejos con los polisacáridos y polifenoles removiéndolos de la solución (Orek, 2018; Zhao et al., 2012), mientras que el LiCl permite una precipitación diferencial del ARN y otras sustancias como DNA, proteínas y carbohidratos (Hernández-Guzmán & Guzmán-Barney, 2013). También se ha estudiado el uso de SDS y EDTA en el buffer de extracción resultando ser buenos inhibidores de ARNasas (George, 2018), ya que disuelven las membranas y desnaturalizan proteínas permitiendo la purificación de los ácidos nucleicos (Rio, Ares, Hannon, & Nilsen, 2010). Asimismo, el PVP y β-mercaptoetanol, compuestos frecuentemente utilizados debido a que mejoran el rendimiento y la calidad del ARN, ayudan a suprimir la oxidación, eliminan las ribonucleasas liberadas durante la lisis celular y desactivan las proteínas, permitiendo la extracción de los ácidos nucleicos de las plantas (George, 2018; Michel-López et al., 2018; Mommaerts, Sanchez, Betsou, & Mathieson, 2015).
La interacción de dichos compuestos permitió la obtención de ARN total de calidad a partir del tejido embrionario de nuez pecanera, siendo CTAB 4 un protocolo eficaz para futuros estudios moleculares en C. illinoinensis. El protocolo CTAB 4 se diseñó tomando como base otros protocolos y para realizarse en formato de microextracción, partiendo de una cantidad mínima de muestra y utilizando un volumen mucho menor de reactivos. Una microextracción tiene especial importancia debido a que se genera una cantidad mínima de residuos tóxicos además de la optimización de los recursos.
Conclusiones
En este estudio fue posible evaluar la eficiencia de ocho protocolos de extracción de ARN total de Carya illinoinensis, obteniendo diferencias significativas respecto a la calidad y cantidad, a partir del tejido embrionario de nuez pecanera madura normal y con embrión germinado. Con los protocolos basados en el reactivo TRIzol y en el kit comercial se obtuvieron concentraciones altas de ARN total; sin embargo, la calidad fue deficiente, lo cual se corroboró con la nula amplificación del gen control actina por RT-PCR. Los protocolos basados en el buffer de extracción CTAB, establecidos para la extracción de ARN, son útiles en aplicaciones downstream. Específicamente, el protocolo CTAB 4 fue más eficiente para la extracción de ARN total de alta calidad a partir de tejidos embrionarios de nuez pecanera, lo cual garantiza la obtención de muestras para análisis de expresión génica en C. illinoinensis.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo otorgado a través de la beca de postgrado número 735324. Este proyecto fue apoyado en conjunto por la Universidad Autónoma Chapingo y la Universidad Juárez del Estado de Durango.
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Recibido: 09 de Agosto de 2022; Aprobado: 05 de Diciembre de 2022
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