Notas de investigación

 

Influencia del tratamiento alcalino en el agar de Gracilariopsis longissima y Gracilaria vermiculophylla del Golfo de California, México

 

Influence of alkali treatment on agar from Gracilariopsis longissima and Gracilaria vermiculophylla from the Gulf of California, Mexico

 

J Orduña-Rojas^1*, R Suárez-Castro¹, ES López-Álvarez¹, R Ríosmena-Rodríguez², I Pacheco-Ruiz³, JA Zertuche-González³, AE Meling-López⁴

 

¹ Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Blvd. Juan de Dios Bátiz Paredes # 250, Guasave CP 81101, Sinaloa, México. * E-mail: jorduna@ipn.mx

² Programa de Investigación en Botánica Marina, Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz CP 23080, BCS, México.

³ Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California, Apartado postal 453, Ensenada, CP 22800, Baja California, México.

⁴ Departamento de Investigación Científica y Tecnológica de la Universidad de Sonora, Rosales y Niños Héroes s/n, Hermosillo, CP 83000, Sonora, México.

 

Recibido en febrero de 2008.
Aceptado en septiembre de 2008.

 

Resumen

Se estudió el efecto del tratamiento alcalino en el rendimiento de agar, contenido de sulfatos y contenido de 3,6 anhidrogalactosa en dos especies productoras de agar (Gracilariopsis longissima y Gracilaria vermiculophylla). Además, se midió la fuerza de gel, la temperatura de gelificación y temperatura de fusión de cada agar extraído. El agar se extrajo después de tratar el alga con diferentes concentraciones de NaOH (3%, 5%, 7% y 9%). El tratamiento alcalino redujo significativamente el rendimiento de agar en G. longissima de 13.2% para el agar no tratado (agar nativo) a 5.4% para el agar tratado con NaOH al 5%, mientras que en G. vermiculophylla el rendimiento se redujo de 25.2% a 9.6% con el tratamiento con NaOH al 9%. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el rendimiento entre el agar nativo y el posterior a todos los tratamientos alcalinos de G. longissima, mientras que para G. vermiculophylla sólo se encontraron diferencias significativas entre el agar nativo y los tratamientos más alcalinos (NaOH al 7% y 9 %, P < 0.05). El contenido de sulfatos en G. longissima disminuyó gradualmente conforme se incrementó el contenido de NaOH de 3.9% en el agar nativo hasta 3.1% en el tratamiento con 7% de NaOH, y estuvo negativamente correlacionado con la fuerza de gel (r = -0.92). El contenido de sulfatos en el agar nativo de G. vermiculophylla fue el doble (7.8%) del observado en G. longissima, y no se observaron diferencias estadísticas significativas con los tratamientos de baja alcalinidad, pero si las hubo con los tratamientos muy alcalinos. Los contenidos más altos de 3,6 anhidrogalactosa se encontraron con el tratamiento con 9% de NaOH tanto en G. longissima (40.9%) como en G. vermiculophylla (43%), y estuvieron positivamente correlacionados con la fuerza de gel (r = 0.89 y r = 0.91, respectivamente).

Palabras clave: agar, Golfo de California, Gracilaria, Gracilariopsis, tratamiento alcalino.

 

Abstract

The effect of alkali treatment on agar yield, sulfate content, and 3,6 anhydrogalactose content from two agarophyte species (Gracilariopsis longissima and Gracilaria vermiculophylla) was analyzed. In addition, gel strength was measured in each agar extract as well as gelling and melting temperatures. Agar was extracted after pretreatment with different concentrations of NaOH (3%, 5%, 7%, and 9%). Pretreatment with alkali significantly reduced agar yield from G. longissima from 13.2% in non-treated agar (native agar) to 5.4% in 5% NaOH, whereas in G. vermiculophylla it diminished from 25.2% to 9.6% in 9% NaOH treatment. Statistically significant differences were observed for native and all alkali treatments in G. longissima, whereas in G. vermiculophylla significant differences were only found among native and high alkali treatments (7% and 9% NaOH, P < 0.05). Sulfate content from G. longissima diminished gradually with increasing alkali concentration, from high (3.9%) in native agar to low (3.1%) in 7% alkali treatment, and was negatively correlated with gel strength (r = -0.92). Sulfate content in G. vermiculophylla native agar was twice as high as that found in G. longissima (7.8%) and did not show statistically significant differences with low alkali treatments, but it did with high NaOH treatments. Higher contents of 3,6 anhydrogalactose were found with 9% NaOH treatment in G. longissima (40.9%) and G. vermiculophylla (43%), and they were significantly correlated with gel strength (r = 0.89 and r = 0.91, respectively).

Key words: agar, alkali treatment, Gracilaria, Gracilariopsis, Gulf of California.

 

Introducción

El agar es un ficocoloide de valor comercial extraído de las algas rojas de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pterocladia y Gelidiella (Armisen y Galatas 1987). Entre éstos, las especies de Gelidium y Gracilaria son las principales algas utilizadas en la industria del agar en el mundo. Aproximadamente 55,000 toneladas de algas en peso seco son utilizadas anualmente para producir 7,500 t de agar, con un valor de 132 millones de dólares de los EUA (McHugh 2002), de las cuales 65% son obtenidas a partir de especies del género Gracilaria.

El agar es un polisacárido que consiste de subunidades alternadas de D y L galactosa unidas por enlaces β-1,3 y α-1,4, respectivamente (Araki 1966), cuyas propiedades gelificantes son altamente dependientes de la cantidad y posición de los grupos sulfato, así como de la cantidad de 3,6 anhidrogalactosa presente en el ficocoloide (Duckworth y Yaphe 1971).

Se sabe que las especies de Gracilaria producen agares débiles que contienen grandes cantidades de sulfatos en comparación con agares obtenidos de especies de Gelidium y Pterocladia (Armisen y Galatas 1987). Ya se ha demostrado la influencia que tiene el tratamiento con hidróxido de sodio en las propiedades físicas y químicas del agar (agar tratado) de especies de Gracilaria y Gracilariopsis (Craigie y Wen 1984, Bird y Hinson 1992, de Castro 1996, Rebello et al. 1997, Freile-Pelegrín y Robledo 1997). Este tratamiento, también conocido como hidrólisis alcalina de sulfatos, es aplicado a las especies de Gracilaria para obtener la mayor desulfatación posible. La fuerza de gel de un agar puede ser incrementada mediante un tratamiento alcalino del alga en tanto los residuos de sulfato se encuentren en una posición lábil; mientras mayor sea la cantidad de grupos sulfatos en posición no lábil, menor será la fuerza de gel obtenida (Craigie y Wen 1984). De acuerdo con Armisen (1995) el tratamiento de Gracilaria con hidróxido de sodio (NaOH) reduce el alto contenido de sulfatos en el agar de estas especies principalmente al inducir la hidrólisis de la l-galactosa-6-sulfato para producir 3-6 anhidro-l-galactosa. Como consecuencia de este tratamiento se ha observado la reducción del rendimiento en el agar y un incremento en la fuerza de gel, así como aumento de su temperatura de gelificación y fusión (de Castro 1996, Freile-Pelegrín y Robledo 1997, Rebello et al. 1997, Wilson y Critchley 1998). Debido a que las diferentes especies de Gracilaria poseen agar con diferente concentración de sulfatos, el rendimiento y las características del agar de una especie en particular dependerán de la concentración de álcali utilizada, así como de la temperatura y tiempo de duración del proceso de extracción (Hurtado-Ponce 1992, Villanueva et al. 1997).

A pesar del gran número de estudios florísticos realizados con macroalgas del Golfo de California, sólo unos pocos se han enfocado en el análisis del agar de las especies de Gracilaria de esta área. En este trabajo se estudió el efecto del tratamiento alcalino sobre las propiedades físicas y químicas del agar obtenido de Gracilariopsis longissima (SG Gmelin) M Steentoft, LM Irvine y WF Farnham y Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenfuss, dos especies de macroal-gas potencialmente explotables comercialmente del Golfo de California, a fin de determinar su posible utilización en la industria del agar.

 

Materiales y métodos

En mayo de 2004 se recolectaron a mano plantas de Gracilariopsis longissima y Gracilaria vermiculophylla de poblaciones naturales que se encuentran en la Bahía de Navachiste, en la costa suroeste del Golfo de California (fig. 1). Las poblaciones de G. longissima se desarrollan bien en áreas lodosas de poca profundidad (1 a 1.5 m de profundidad) en la parte interior de la bahía. Las plantas crecen parcialmente enterradas en el sustrato, fijas a rocas pequeñas o fragmentos de conchas de moluscos. La mayor parte de las plantas recolectadas sobrepasaron 1 m de longitud y su diámetro no fue mayor a los 3 mm. Las algas presentaban abundantes prolongaciones cortas y su coloración era verde oscuro. En contraste, las poblaciones de G. vermiculophylla crecen fijas a las rocas que se encuentran alrededor de las islas localizadas al interior de la bahía desde la zona intermareal baja hasta una profundidad de aproximadamente 3 m. Las plantas con abundantes ramificaciones son de consistencia cartilaginosa, de 0.3 a 0.5 m de longitud y color verde a púrpura. Las macroalgas recolectadas fueron colocadas dentro de bolsas de plástico con agua de mar y fueron transportadas de inmediato en hieleras de plástico al laboratorio. A su llegada al laboratorio las plantas fueron enjuagadas con agua de mar para eliminar partículas de sedimento y epífitas, y luego se enjuagaron con agua dulce; posteriormente se sumergieron en una solución de formaldehído al 10% por 24 h para prevenir la hidrólisis enzimática del agar (Freile-Pelegrín y Robledo 1997), se enjuagaron con agua de la llave, se secaron al sol por 8 h y posteriormente se colocaron en un horno a 70°C para su secado hasta obtener peso constante. Entonces, las algas se colocaron en bolsas de plástico selladas herméticamente y se mantuvieron a temperatura ambiente en el laboratorio hasta el inicio de la extracción.

Los especimenes recolectados fueron identificados con base en los trabajos de Norris (1985), Bellorin et al. (2004) y Gurgel et al. (2003). El material prensado se encuentra depositado en el Herbario Ficológico de la Universidad Autónoma de Baja California Sur (FBCS).

Tratamiento alcalino y extracción del agar

Se colocaron muestras de alga de 20 g peso seco (n = 3) en frascos Erlenmeyer de 2 L de capacidad con 400 mL de solución de NaOH (3%, 5%, 7%, o 9% p/v) toda una noche a temperatura ambiente. Después las muestras se calentaron en baño María a 85°C durante 3 h, se enjuagaron con agua de la llave por 1 h para eliminar el exceso de NaOH y se drenaron. Para evaluar la posible pérdida de agar por difusión en la solución de NaOH, ésta fue drenada, neutralizada a pH 7 con ácido sulfúrico, y dejada a gelificar toda la noche. En ninguno de los tratamientos se observó difusión del agar. Después del tratamiento alcalino y antes de la extracción del agar, las muestras de alga se colocaron en 400 mL de agua destilada y el pH de la solución se ajustó a 6.2-6.5 con una solución de ácido fosfórico 0.5 M. El proceso de extracción se llevó a cabo calentando las algas en una placa a 95°C por 1.5 h. Después las algas se molieron utilizando una licuadora manual y el molido se pasó por un filtro a presión de acero inoxidable de 1.5 L de capacidad. El filtrado fue recolectado en charolas de plástico y se dejó gelificar a temperatura ambiente. El gel obtenido se congeló toda la noche a -20°C para posteriormente descongelarlo a temperatura ambiente dejando escurrir el agua. Finalmente, para su secado, el gel se colocó en un horno a 70°C por 36 h. El agar obtenido se dejó enfriar dentro de un desecador y posteriormente se pesó en una balanza analítica. El rendimiento de agar fue calculado como porcentaje de la materia seca utilizada. La extracción del agar nativo se realizó de modo similar al descrito anteriormente utilizando agua destilada en vez de solución de NaOH (0%). Las muestras de agar secas se molieron utilizando un molino Thomas Wiley y el polvo de agar fue tamizado a través de una malla número 40 (425 μm) para favorecer su solubilidad en las pruebas físicas realizadas.

Análisis físicos y químicos

La fuerza de gel, y las temperatura de fusión y de gelificación se determinaron siguiendo la metodología descrita por Freile-Pelegrín y Robledo (1997), utilizando soluciones de agar al 1.5% (p/v). Los contenidos de sulfatos y de 3,6 anhidro-galactosa (3,6 AG) se determinaron por el método turbidimétrico descrito por Jackson y McCandless (1978) y el método calorimétrico de Matsuhiro y Zanlungo (1983), respectivamente. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Para evaluar la existencia de diferencias estadísticas entre tratamientos se emplearon un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba de diferencias significativas mínimas (P < 0.05) de Fisher (prueba LSD), así como análisis de correlación. Los supuestos de la prueba de ANOVA fueron verificados previamente.

 

Resultados

El rendimiento de agar en G. longissima varió de 13.2% en el agar nativo (0% NaOH) a 5.4% en el tratamiento con 5% de NaOH. Se observaron diferencias significativas (prueba de ANOVA) entre el agar nativo y todos los tratamientos alcalinos. No se observó un efecto significativo en el rendimiento (prueba LSD) entre los diferentes tratamientos alcalinos (fig. 2a).

El rendimiento de agar en G. vermiculophylla fue mayor que el observado en G. longissima y disminuyó gradualmente de 25.2% para el agar nativo hasta 9.6% para el tratamiento con 9% de NaOH. A diferencia de G. longissima, el rendimiento de agar en G. vermiculophylla no mostró diferencias significativas entre el agar nativo y los tratamientos alcalinos de menor concentración (3% y 5%). La prueba de LSD mostró diferencias significativas entre los tratamientos alcalinos de concentración alta (7% y 9%), el agar nativo y los tratamientos de concentración baja (P < 0.05).

El contenido de sulfatos en G. longissima decreció al incrementarse la concentración de NaOH. El contenido de sulfatos varió de 3.9% para el agar nativo a 3.1% para el agar tratado con 7% de NaOH (fig. 2b). El contenido de sulfatos en el agar nativo de G. vermiculophylla fue el doble (7.8 %) del observado en G. longissima y disminuyó hasta 5.8% con el tratamiento con mayor concentración de NaOH. Se observaron diferencias estadísticamente significativas (prueba LSD) entre el agar nativo y los agares modificados por el tratamiento alcalino con alta concentración de NaOH (P < 0.05).

Los menores contenidos de 3,6 AG en G. longissima y G. vermiculophylla se obtuvieron de sus agares nativos (10.9% y 6.7 %, respectivamente), en tanto que las muestras tratadas con NaOH mostraron los contenidos más altos (40.9% y 43.0%, respectivamente). A mayor concentración de NaOH en el tratamiento alcalino, mayor el incremento en el contenido de 3,6 AG (fig. 2c).

Las mayores fuerza de gel, y temperaturas de fusión y de gelificación se obtuvieron en el agar obtenido de los tratamientos con mayor concentración de álcali, en tanto que los valores más bajos de esos parámetros se registraron en los agares nativos (tabla 1). No fue posible determinar la fuerza de gel para los agares nativos de ambas especies ni para el agar obtenido de G. longissima tratada con 3% de NaOH. El contenido de sulfatos mostró una correlación negativa con la fuerza de gel en G. longissima (r = -0.92), en tanto que el contenido de 3,6 AG se correlacionó positivamente con la fuerza de gel en G. longissima (r = 0.89) y G. vermiculophylla (r = 0.91).

 

Discusión

Las variaciones en la concentración del álcali utilizado para eliminar los residuos de sulfato del agar nativo y así mejorar sus propiedades físicas tienen una gran influencia en las propiedades de los agares de G. longissima y G. vermiculophylla. Se ha demostrado que, en otras especies de Gracilaria, el rendimiento del agar disminuye después de aplicarles un tratamiento alcalino (Aponte-Díaz y Lemus-Castro 1989, de Castro 1996, Wakibia et al. 2001). Según lo esperado el rendimiento del agar extraído de G. longissima y G. vermiculophylla disminuyó después de aplicar el tratamiento alcalino pero de modo distinto en cada especie. El rendimiento de agar de G. longissima se redujo significativamente con el tratamiento con NaOH al 3%, comparado con el rendimiento obtenido en el agar nativo (13.3% a 5.8%), pero no se registraron diferencias significativas en el rendimiento con ningún otro de los tratamientos. Esto podría indicar que bajo las condiciones experimentales utilizadas no existe un efecto adicional de las concentraciones más altas de NaOH en el rendimiento de agar en esta especie. Además, los rendimientos de agar obtenidos de los tratamientos alcalinos en G. longissima fueron siempre menores al 8%, el cual es el porcentaje mínimo requerido por la industria (Armisen 1995), lo que resulta de importante consideración en caso de una eventual explotación comercial de esta especie.

Por otro lado, el rendimiento de agar de G. vermiculophylla disminuyó ligeramente conforme se incrementó la concentración de álcali en los tratamientos, y sólo se observó una reducción significativa en el rendimiento (en comparación con el agar nativo) en los tratamientos con mayor concentración de NaOH. Asimismo, el rendimiento obtenido para el agar nativo y con tratamiento alcalino de G. vermiculophylla fue similar al reportado para Gracilaria cervicornis, Gracilaria domingensis y G. verrucosa, las cuales presentaron rendimientos de agar cercanos a 15% (Aponte-Díaz y Lemus-Castro 1989), a los de Gracilariopsis lemaneiformis y seis especies de Gracilaria con rendimientos entre 13.4% y 39.5% (Rebello et al. 1997), los de Gracilariopsis sp. y Gracilaria gracilis de 15% a 27% (Wakibia et al. 2001), y los obtenidos de G. crassissima de 13.1% y G. blodgettii de 26.2% (Freile-Pelegrín y Murano 2005). En este sentido, el agar de G. longissima parece ser más sensible al tratamiento alcalino que el de G. vermiculophylla.

El contenido de sulfatos en G. longissima (3.1-3.6%) y G. vermiculophylla (5.8-8.2%) obtenido en este trabajo fue mayor al reportado en otras especies de Gracilaria, como Gracilaria heteroclada (1.4%-2.29%, de Castro 1996), Gracilaria cornea (1.54%-1.9%, Freile-Pelegrín y Robledo 1997), y seis especies de Gracilaria (1.1 a 2.8%) reportadas por Rebello et al. (1997). Se ha señalado que las plantas que crecen a mayor temperatura rinden agar con más más sulfatos y menos 3,6 AG que el agar producido por plantas que se desarrollan a temperaturas bajas (Craigie y Wen 1984, Macchiavello et al. 1999). Estos últimos señalamientos coinciden con los resultados encontrados en este trabajo y reflejan la naturaleza tropical de las plantas de la costa suroeste del Golfo de California.

Por otra parte, se ha sugerido que el pretratamiento de las algas con soluciones alcalinas puede mejorar la fuerza de gel del agar obtenido por la acción que éste tiene en la eliminación de los residuos de sulfato de la molécula de agar. No obstante, no todos los residuos de sulfato pudieran ser residuos lábiles; por tanto, mientras mayor sea la cantidad de residuos no lábiles al tratamiento alcalino, menor será la fuerza de gel del agar resultante (Craigie y Wen 1984). En este trabajo se observó que el contenido de sulfatos en G. vermiculophylla pudo ser reducido sólo en los tratamientos con mayor contenido alcalino (7% y 9% de NaOH); a pesar de ello, la cantidad remanente de sulfatos presente en el agar extraído fue demasiado alta para mejorar sustancialmente la fuerza de gel, como ocurre en otras especies de Gracilaria. Por el contrario, para G. longissima se observó una reducción significativa en el contenido de sulfatos en el agar obtenido del tratamiento con 5% de NaOH, y no se observó ninguna disminución significativa (prueba LSD) al aumentar la concentración de álcali. Esto sugiere que los residuos de sulfato que persisten en el agar de esta especie son menos susceptibles de ser eliminados aun por los tratamientos alcalinos de mayor concentración debido probablemente a su posición no lábil.

El contenido de 3,6 AG se incrementó de 6.7% a 43% y de 10.9% a 40.9% después del tratamiento alcalino al 9% en G. vermiculophylla y G. longissima, respectivamente. Los datos obtenidos tras los tratamientos con concentraciones altas de NaOH se asemejan a los reportados por Wakibia et al. (2001), Freile-Pelegrín y Robledo (1997) y Bird y Hinson (1992) para otras especies de agarofitas tratadas con álcali (28-42%). Por otra parte, los tratamientos con concentraciones bajas de NaOH produjeron porcentajes bajos de 3,6 AG, lo cual aunado a la baja fuerza de gel derivada de estos tratamientos pudiera explicare el alto porcentaje de sulfatos encontrado.

La fuerza de gel en G. longissima y G. vermiculophylla se incrementó sólo ligeramente después de aplicar los tratamientos alcalinos de mayor concentración (0 a 280 g cm^-2 y 0 a 177.5 g cm^-2, respectivamente) en comparación con los resultados obtenidos por Bird y Hinson (1992) con Gracilariopsis lemaneiformis, Gracilaria tikvahiae y G. blodgettii (ca. 1063, 426 y 1176 g cm^-2, respectivamente), por Rebello et al. (1996) con Gracilaria gracilis (860 g cm^-2), de Castro (1996) con G. heteroclada (274-662 g cm^-2), Freile-Pelegrín y Robledo (1997) con Gracilaria cornea (974-1758 g cm^-2), Wakibia et al. (2001) en G. gracilis y Gracilariopsis sp. (612 g cm^-2), y por Espinoza-Avalos et al. (2003) en G. cornea y Gracilaria crassissima (1020 y 1266 g cm^-2).

Se ha mencionado que la presencia de residuos estables al tratamiento alcalino de D-galactosa-6-sulfato, y parcialmente de 4-0-metil-a-L-galactosa, fue la responsables de la extremadamente pobre capacidad de gelificación y baja fuerza de gel (< 50 g cm^-2) en el agar nativo y agar tratado de Gracilaria cervicornis (Freile-Pelegrín y Murano 2005). Además, la presencia de esteres de sulfato estables al tratamiento con álcali y la de acetal piruvatos disminuyen la fuerza de gel (Wilson y Critchley 1998). De modo similar se ha mencionado que el tratamiento alcalino puede causar un rompimiento de la cadena de agar, dando como resultado una fuerza de gel baja (Murano et al. 1992). Esto podría indicar que la baja fuerza de gel observada en el agar extraído de las plantas del Golfo de California podría ser debida a un alto contenido de residuos de sulfato estables al tratamiento alcalino aún después de aplicar soluciones con alto contenido de NaOH, lo que también sugiere un posible rompimiento del agar después del tratamiento con alta concentración alcalina.

De acuerdo con Macchiavello et al. (1999) las especies de Gracilaria que habitan en aguas cálidas tienen un agar con menor contenido de 3,6 AG y un mayor contenido de sulfatos que las especies de aguas templadas, lo cual las hace fuentes de un agar de menor valor comercial. Esto concuerda con los resultados de este trabajo. Las altas temperaturas que se presentan en las aguas del Gofo de California pudieran ser responsables del alto contenido de sulfatos y la baja fuerza de gel observada en el agar extraído de estas algas. Aun cuando el tratamiento alcalino aplicado a las algas tuvo como resultado un incremento en el contenido de 3,6 AG, una reducción parcial de la cantidad de sulfatos y un incremento en la fuerza de gel, éstos no fueron suficientes para mejorar la calidad del agar obtenido de manera que se satisfagan los estándares requeridos por el mercado internacional para el agar alimenticio que establece, para un gel al 1.5% de concentración, una fuerza de gel > 750 g cm^-2 y una contenido de sulfates <4% (Armisen 1995). De aquí que estos agares deberían ser clasificados como agaroides (Craigie 1990), los cuales no son convenientes para ser utilizados como fuente de agar de grado bacteriológico. No obstante, el agar nativo y el agar tratado de G. vermiculophylla y G. longissima podrían ser utilizados en mezclas con otros agares.

 

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado económicamente por la CGPI proyecto 2004 0268 y el CECyT-Sinaloa. J. O-R agradece el apoyo económico otorgado por la COFAA y la SIP-IPN.

 

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