Introducción

El contenido fitoquímico de Annona muricata L. (A. muricata) está relacionado con su evaluación farmacológica y toxicológica; por lo tanto, la medición de las propiedades antioxidante, antibacterial, antifúngica, y tóxicas de la pulpa nos indica, su potencial como alimento funcional, nutracéutico o toxicológico. Se han realizado varios análisis antioxidantes con extractos crudos a partir de pulpa, hoja y semilla de A. muricata. ^{Coria-Téllez et al. (2018)} compilaron estudios sobre la actividad antioxidante de A. muricata y concluyeron que sus antioxidantes han ganado interés debido a su efecto protector contra los radicales libres derivados del oxígeno que participan en el desarrollo de muchas enfermedades.

Por otro lado, ha sido reportado que los extractos crudos a partir de hojas, cáscara, semilla y tallo de A. muricata, tienen actividad antibacteriana contra bacterias gram-positivas y gram-negativas. Diferentes tipos de bacterias como: B. subtilis, E. coli, S. aureus, M. tuberculosis, S. Thyphimurium y K. pneumonia han sido inhibidas por extractos de A. muricata (^{Solomon-Wisdom et al., 2014}; ^{Radji et al., 2015}; ^{Roger et al., 2015}; ^{Coria-Téllez et al., 2018}). La bioactividad antimicrobiana de los extractos de A. muricata es atribuído a los flavonoides, esteroides y alcaloides. El mecanismo de acción probablemente se deba a la sinergia de estos compuestos (^{Radji et al., 2015}). Las infecciones microbianas producen aproximadamente 15 millones de muertes por año en todo el mundo, con el 70 % de las muertes causadas por infecciones bacterianas (^{Essama et al., 2016}). Desafortunadamente, algunas bacterias han desarrollado resistencia a antibióticos (resistencia extrínseca) (^{Sanchez-Maldonado et al., 2017}). Por lo tanto, el estudio de los nuevos agentes antimicrobianos puede ser dirigidos a las amenazas mundiales para la salud pública debido a la alta resistencia de los patógenos a los antimicrobianos y a la falta de desarrollo de nuevos antimicrobianos (^{Reis et al., 2015}). Del mismo modo, las infecciones por hongos han aumentado en los últimos años, debido a la resistencia de los fitopatógenos a los fungicidas, el cual tiene un impacto significativo en la economía debido a las pérdidas postcosecha causadas por varios hongos (^{Yang & Jiang, 2015}). En la última década, hay un gran interés en el estudio de los compuestos naturales como sustitutos de fungicidas sintéticos y un gran número de estudios in vitro ha demostrado que los efectos antifúngicos de los extractos de plantas reducen la incidencia de patógenos postcosecha (^{Ramos-Guerrero et al., 2018}). Los estudios científicos sobre el efecto antifúngico de extractos de A. muricata son escasos; sin embargo, ^{Bautista-Baños et al. (2000a}, ^2000b, ²⁰⁰²) reportaron que los extractos crudos de hojas y tallo de A. cherimola, A. muricata y A. reticulata, tuvieron actividad antifúngica in vitro contra Colletotrichum gloeosporioides y Rhizopus stolonifer. Los autores concluyeron que los compuestos bioactivos presentes en los extractos crudos de Annonaceae tenían un potencial fungicida.

Ha sido reportado que los extractos acuosos y acetogeninas aisladas de las hojas o la pulpa de guanábana causaron neurodegeneración o parkinsonismo atípico (^{Potts et al., 2012}). Sin embargo, ^{Arthur et al. (2011)} reportó que dosis más altas de 5 mg/g de extracto acuoso podrían causar daño renal, a diferencia de la dosis de 1 mg/g que mostraba propiedades de hipoglucemia e hiperlipidemia. Los extractos más tóxicos que se han reportado son extractos metanólicos de pericarpio, pulpa de fruta o semilla (^{Boyom et al., 2011}). Por lo tanto, se requieren más estudios sobre el efecto tóxico en la pulpa de guanábana.

Las actividades biológicas reportadas en A. muricata son utilizando extractos crudos de hojas, tallos, cáscaras y semillas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos antioxidantes, bactericidas, fungicidas y tóxicos de extractos fraccionados obtenidos de pulpa de guanábana fresca y pulpa almacenada en diferentes condiciones de almacenamiento.

Material y Métodos

Resultados y Discusión

La actividad bactericida de las fracciones de pulpa fresca, almacenadas a -20ºC y la pulpa tratada térmicamente se muestra en la Tabla 1. Hubo un efecto significativo (p<0.05) de los tratamientos en la actividad bactericida. Aunque, el control positivo tuvo la mayor actividad antibacteriana, se observó una actividad antibacteriana significativa de las fracciones. E. aerogenes fue mayormente inhibido por las fracciones PF-F3 y PC6-F3, con el mayor halo inhibitorio de 17.55 a 20.25 mm, seguido de las fracciones de PC6-F1 y PTF1 (17.50 y 18.25 mm). Por otro lado, S. Typhimurium se inhibió principalmente con el PT-F3 con un halo inhibitorio de 20 mm. Además, B. subtillis y E. faecalis tratados con cualquiera de las fracciones tuvieron un halo inhibitorio entre 10.75 y 14.25 mm, sin diferencias significativas (p>0.05) entre los tratamientos.

Probablemente, los compuestos extraídos en las fracciones F1 fueron principalmente alcaloides, acetogeninas, ácidos grasos y terpenoides debido a su naturaleza apolar (^{Coria-Téllez et al., 2018}). Sin embargo, en las fracciones F2 y F3, además de los compuestos mencionados anteriormente, los polifenoles y otros antioxidantes como la vitamina C pueden ser extraídos cuando la polaridad aumenta con el metanol (^{Park et al., 2010}; ^{Sulaiman et al., 2011}); por lo tanto, las fracciones F3 tuvieron la mas alta actividad antibacteriana, pero esto fue de acuerdo con cada bacteria. Las bacterias gram negativas fueron afectadas principalmente con fracciones F3 debido a que las bacterias gram-negativas tienen dos membranas lipídicas y una pared celular delgada de peptidoglicano, mientras que las bacterias gram-positivas tienen solo una membrana lipídica, pero la pared de peptidoglicano más gruesa, además cuenta con presencia de ácidos teicoicos, que causan una resistencia intrínseca (^{Chopra et al., 2001}).

Los compuestos bioactivos con actividad microbicida en extractos de guanábana son acetogeninas, alcaloides, terpenos, saponinas, flavonoides y otros antioxidantes (^{Vieira et al., 2010}; ^{Raybaudi et al., 2015}; ^{Coria-Téllez et al., 2018}). Aunque, no hay estudios sobre el efecto de los extractos de guanábana sobre E. aerogenes y E. faecalis; saponinas, esteroides y triterpenes, de otros extractos orgánicos de plantas son responsables de inhibir a E. aerogenes (^{Reis et al., 2015}). Por otra parte, ^{Solomon-Winsdom et al. (2014)} y ^{Roger et al. (2015)}, informaron que extractos de guanábana a base de metanol y etanol, pueden inhibir las bacterias S. thyphimurim y Bacillus subtilis.

El mecanismo antibacterial puede estar relacionado con los alcaloides, estos compuestos tienen la capacidad de unirse con el DNA de los microorganismos e inhibir la síntesis de RNA (^{Roger et al., 2015}). Los alcaloides han mostrado actividad antimicrobiana por inhibición de la glicosidasa (^{Mohanty et al., 2008}). Por otro lado, ha sido reportado que los flavonoides actúan inhibiendo tanto la función de la membrana citoplasmática como la síntesis de DNA, tal como la quercetina que se une a las subunidades de DNA e inhibe la actividad de la enzima ATPasa. Fue reportado que el fenilfenol se une a proteinas membranales, o hidrógenos de proteínas vitales como las enzimas microbianas, para inhibir y cambiar sus funciones (^{Radji et al., 2015}). De manera similar, el mecanismo de acción de las acetogeninas es la inhibición de la cadena respiratoria celular (^{Lannuzel et al., 2003}).

El almacenamiento de pulpa a -20 ºC no degradó los compuestos con actividad antibacteriana, porque las fracciones de las muestras PC tuvieron una actividad bactericida igual que las muestras PF. La inhibición de S. Typhimurium aumentó con el tratamiento térmico de la pulpa de guanábana. Los compuestos bioactivos más termoestables son acetogeninas, alcaloides y saponinas (^{Biesalski et al., 2007}; ^{García-Aguirre et al., 2008}). Es posible que estos compuestos fueorn concentrados durante el proceso térmico de la pulpa de guanábana.

La Tabla 2 muestra que solo las fracciones F3 causaron la inhibición del crecimiento micelial de R. stolonifer y fue mayor que el efecto causado por las fracciones PC. La mayor inhibición del crecimiento micelial se observó con el tratamiento con PF-F3 (36.54 %). El tiempo de almacenamiento a -20 ºC y el tratamiento térmico de la pulpa de guanábana provocaron una disminución en el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial en PC3-F3, PC6-F3, PC12-F3 y PT-F3 (27.50, 10.63, 10.0 y 1.19 %, respectivamente). Por otra parte, la inhibición del crecimiento micelial de C. gloeosporiodes se observó en todas las fracciones y, de la misma manera, el tiempo de almacenamiento a -20 ºC y la pulpa tratada térmicamente disminuyó la actividad antifúngica de las fracciones, ya que las fracciones de PC12 y PT tuvieron la inhibición más baja del crecimiento micelial en este patógeno. Por el contrario, la fracción de PF-F3 mostró la mayor inhibición del crecimiento del micelio (59.90 %).

No existe literatura disponible que reporte la actividad antifúngica en la inhibición de R. stolonifer y C. gloeosporioides utilizando extractos de pulpa de guanábana. Sin embargo, se encontraron estudios sobre el efecto de extractos foliares y de tallo de anonáceas. ^{Bautista-Baños et al. (2000a} y ^2000b), demostraron que los extractos de hojas de Annona reticulata y Annona cherimola tuvieron un efecto inhibitorio sobre el crecimiento del micelio de Rhizopus; no obstante, la esporulación fue completamente disuadida. ^{Bautista-Baños et al. (2002)} encontraron que los extractos de hojas y tallos causaron una inhibición parcial del crecimiento micelial, de la esporulación y la germinación de C. gloeosporioides. De la misma manera, se reportó que el efecto de tres extractos (etanólicos, acéticos y acuosos) de pulpa de Annona squamosa sobre Aspergillus niger tuvo un halo inhibitorio de 21, 15 y 17 mm, respectivamente (^{Vijayalakshmi & Nithiya, 2015}).

El efecto fungistático o fungicida de los extractos de anonáceas está relacionado con la presencia de alcaloides, saponinas, polipéptidos, terpenos, aceites esenciales y polifenoles (^{Deressa et al., 2015}; ^{Perumal et al., 2016}) y tienen un amplio espectro de acción (^{Coria-Téllez et al., 2018}). Por lo tanto, es altamente probable que contenga polifenoles, alcaloides y acetogeninas en las fracciones debido a los solventes utilizados. ^{Yang & Jiang (2015)} reportaron que existe una dosis dependiente de la concentración polifenólica para inhibir el crecimiento micelial y la germinación de esporas de R. stolonifer. Los polifenoles causaron cambios morfológicos en las hifas, como una apariencia hinchada irregular, aumento de la ramificación, arrugamiento, entrelazamientos, colapso y rotura, mientras que en las esporas tratadas con polifenoles del té, se observó hinchazón de las puntas del tubo germinal, exfoliación de la capa superficial y desorganización de orgánulos celulares. Los autores concluyeron que el mecanismo de acción de los polifenoles podría atribuirse al daño directo del micelio y la inducción indirecta de esporas de actividades de enzimas defensivas. El mecanismo de acción de las acetogeninas es la inhibición de enzimas como la NADH-ubiquinona óxido reductasa y NADHubiquinona oxidasa (^{Morré et al., 1994}). Los hongos y las levaduras son organismos con enzimas NADH-ubiquinona6-oxidorreductasa tipo II, o NADH deshidrogenasas. Se evaluó el efecto de las acetogeninas sobre Saccharomyses cerervisae, éstas causaron una morfogénesis alterada que afectó las vías relacionadas con la biosíntesis de quitina (^{Seo et al., 2000}; ^{Domínguez-Martínez et al., 2011}). Por lo que, es probable que estos compuestos también causen la síntesis de enzimas defensivas y/o la inhibición de las enzimas respiratorias.

No se observó un efecto significativo de las fracciones (p>0.05) sobre el porcentaje de inhibición de los radicales DPPH (Figura 1A). El radical DPPH se neutraliza principalmente mediante la donación de hidrógeno de los antioxidantes (^{Floegel et al., 2011}). El alto secuestro del radical DPPH se asocia principalmente con la concentración de compuestos hidrófilos (^{Pérez-Jiménez et al., 2008}). Debido al tipo y la polaridad de los disolventes utilizados durante el fraccionamiento de la pulpa de guanábana, los compuestos extraídos fueron principalmente hidrófobos; por lo tanto, las diferencias de AOX con el ensayo DPPH no se observaron entre los tratamientos. ^{León-Fernández et al. (2017a}, ^2017b) encontraron un bajo contenido de polifenoles y una alta presencia cualitativa de acetogeninas en extractos crudos de cloroformo y una fracción de pulpa de guanábana; así como un bajo AOX con el ensayo DPPH. El bajo AOX mediante el ensayo DPPH (45-65 % de inhibición) fue reportada en la fracción de cloroformo y acetogeninas aisladas del extracto de semilla de Annona cornifolia (^{Lima et al., 2010}).

Figura 1 Actividad antioxidante (% de inhibición) mediante el ensayo DPPH (A) y ABTS (B) de las fracciones de la pulpa almacenada para 3 (PC3-F1, PC3-F2, PC3-F3), 6 (PC6-F1, PC6- F2, PC6-F3) y 12 meses (PC12-F1, PC12-F2, PC12-F3) a -20 ºC y pulpa tratada térmicamente (PT-F1, PT-F2, PT-F3). Los datos son medias ± desviación estándar de tres determinaciones por triplicado (n=9). Las diferentes letras en cada barra indican diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (α = 0.05). 

Con respecto al ensayo ABTS (Figura 1B), las fracciones PF-F1 y PC3-F1 tuvieron la AOX más alta (40.9-43 %) que las otras fracciones F1. En las fracciones F2, se observó un resultado similar con un 22.96 a 38.22 % de AOX; mientras que en PF-F3 se registró un 79.58 %, seguido de PC3-F3 (61.27 %), PC6-F3 (47.09 %), PC12-F3 (46.73 %) y PT-F3 (37.47 %). Las fracciones de la pulpa fresca pueden tener un mayor contenido de antioxidantes que las fracciones de la pulpa almacenada a -20 ºC o tratadas térmicamente. La AOX más alta de las fracciones de F3 probablemente fue causado por la relación 85:15 (v/v) de cloroformo: metanol; considerando que en las fracciones F3 podrían existir compuestos hidrófilos e hidrófobos, por lo tanto, hubo un mayor AOX (^{Lima et al., 2010}).

El radical ABTS por compuestos hidrófilos e hidrófobos se puede neutralizar (^{Floegel et al., 2011}). ^{León-Fernández et al. (2017b)} informaron una mayor actividad antioxidante mediante el ensayo ABTS en un extracto crudo de cloroformo y fracción de pulpa de guanábana. La actividad antioxidante en muestras orgánicas se debe probablemente a la presencia de flavonoides con baja polaridad, que pueden extraerse con cloroformo, diclorometano, dietil éter o acetato de etilo (^{Sulaiman et al., 2011}). Se ha demostrado que los polifenoles pueden actuar a través de múltiples mecanismos de actividad de atrapamiento de radicales, como la quelación de metales, la transferencia de electrones o la donación de iones de hidrógeno. Los fenólicos de alto peso molecular (taninos) tienen más capacidad para quelar los radicales libres, como ABTS • + y DPPH • (^{Paz et al., 2015}; ^{Pérez-González et al., 2012}); mientras que, la AOX a través de las acetogeninas puede estar relacionado con el anillo lactónico α, ß-insaturado, similar al mecanismo de acción in vitro del ácido ascórbico, en el que participan hidrógenos alílicos. Las acetogeninas podrían actuar de la misma manera, ya que también poseen hidrógenos alílicos, así como la estabilización a través de la deslocalización de electrones en el resto del anillo de lactonico α-β-insaturado. Una evidencia para respaldar estas observaciones es el ascorbato, que ocurre naturalmente en las plantas y contiene grupos hidroxilo unidos a un anillo de lactona saturada. Este compuesto exhibió muy poca actividad de captación de radicales libres (^{Lima et al., 2010}).

En la Tabla 3 se observa que las fracciones PF-F1, PC3-F1, PF-F2 y PC-F2 tuvieron la menor CL₅₀ (2.60-3.18 μg/mL), seguidas de PC6-F1, PC12-F1, PT-F1, PC6-F2, PC12-F2 y PT-F2 (4.57-7.04 μg/mL). Las fracción F3 de pulpa fresca mostró la mayor CL₅₀ (32.76 μg/mL), seguida de PC3-F3 (17.45 μg/mL), PC6, PC12 y PT (13.38-14.13 μg/mL) sin diferencias significativas entre ellas (p>0.05). El almacenamiento a -20 ºC y el tratamiento térmico de la pulpa de guanábana pueden afectar la estructura química de algunos compuestos bioactivos, lo que podría causar una disminución de la toxicidad.

Se ha reportado la toxicidad de extractos crudos acuosos y etanólicos de hojas y tallos de Annonaceae. Los extractos acuosos de la hoja y el tallo tuvieron un CL₅₀ de 1000 y 865 μg/mL, respectivamente; mientras que los extractos etanólicos de hojas y tallos mostraron un CL₅₀ de 831 y 200 μg/mL, respectivamente (^{González-Esquinca et al., 2012}). ^{Vila-Nova et al. (2013)}, determinaron la toxicidad de acetogeninas aisladas de hojas de guanábano (annonancinona y corosolona) sobre Artemia salina en etapas tempranas de crecimiento; Ellos reportaron altas actividades de 7.09 y 17.05 μg/mL, concluyendo que las acetogeninas aisladas poseen mayor actividad citotóxica que los extractos. La toxicidad de las fracciones podría estar relacionada con la presencia de acetogeninas debido a los solventes de extracción (^{León-Fernández et al., 2017a}).

Conclusión

El presente estudio demostró que algunas fracciones de la pulpa de guanábana mostraron actividad antibacteriana y actividad antifúngica. Además, se registró la actividad antioxidante y la toxicidad de todas las fracciones, aunque los resultados dependieron de cada tratamiento. Los datos soportan que el uso de extractos de pulpa de guanábana puede considerarse para el desarrollo de productos en medicina herbal como un tratamiento previo en el control biológico de enfermedades postcosecha. Sin embargo, es necesario realizar más estudios, ya sea para aislar los compuestos en la búsqueda de nuevos antimicrobianos o antifúngicos o para evaluar la seguridad y eficacia de las fracciones de la pulpa de guanábana para un posible uso farmacéutico.