Materiales y métodos

Características de las huertas. En noviembre del 2019, se muestrearon cinco huertas de aguacate ubicadas en el municipio de Zitácuaro, Michoacán. Todas las huertas se encuentran en un clima A(C)(w₁)(w), semicálido subhúmedo con abundantes lluvias en verano, lluvia invernal menor a 5 %, humedad intermedia, de acuerdo con el sistema climático Köppen modificado por ^{García (1981}) y tienen establecida la variedad ‘Hass’, además tienen suelos pesados, ricos en arcilla. Otras características de las huertas se indican en el Cuadro 1.

Colecta de muestras y aislamiento. Se colectaron muestras de raíces y suelo de la rizósfera, una muestra por árbol y cinco árboles por huerta, con síntomas de amarillamiento, defoliación y muerte descendente. Las muestras se colocaron en bolsas de plástico etiquetadas en una hielera y se transportaron al laboratorio de Patología Vegetal del Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (IIAF), de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (UMSNH). Con la finalidad de obtener un mayor porcentaje de aislados a partir de raíces, se modificaron los protocolos de ^{Erwin y Ribeiro (1996}) y ^{Rodríguez-Padrón et al. (2018}). Se seleccionaron raíces laterales parcialmente necrosadas, se lavaron con agua corriente y se secaron con toallas de papel estériles. Cortes de tejido de aproximadamente 2 cm, con una parte sana y una necrosada se colocaron en cassettes de inclusión, los cuales se sumergieron en cloro comercial al 2% (v/v) durante 45 s y se enjuagaron con agua destilada estéril tres veces. Se retiró el exceso de agua de los cortes de tejido con tollas de papel, estériles y se colocaron en cajas Petri con medio selectivo NARPH-V8 (Natamicina 0.02 g L^-1, PCNB (Pentacloronitrobenceno) 0.10 g L^-1, Ampicilina 0.27 g L^-1, Rifampicina 0.01 g L^-1, Himexazol 0.075 g L^-1). Las cajas se incubaron a 25 °C en oscuridad de 24 a 48 h, hasta que se observó el crecimiento de micelio cenocítico y con hinchamientos característico de P. cinnamomi. Las colonias se purificaron por cultivo sucesivo de punta de hifa en medio de cultivo harina de maíz agar (HMA, Fluka^®).

Tipo de compatibilidad. La compatibilidad de los aislados obtenidos se determinó usando los aislados de referencia de P. cinnamomi A1(aislado de camelia) y A2 (aislado de aguacate) que fueron donados por la Universidad de California de Riverside al Laboratorio de Patología Vegetal (IIAF). En una caja Petri con medio scV8 agar (900 mL de agua destilada, 100 mL de jugo V8 Campbell’s, 1 g CaCO₃), se colocó un disco de micelio de un aislado con tipo de compatibilidad A1 y en otra caja el tipo A2. Asimismo, en cada una de las cajas se colocó un disco de micelio del aislado de interés aproximadamente a un centímetro de distancia. Las cajas se incubaron a 25 °C en obscuridad durante 10 días. A los aislados que formaron oosporas se les asignó el tipo de compatibilidad complementario en la cruza.

Caracterización morfológica. Los cultivos puros se cultivaron en medio HMA y medio cV8 agar (10 g de CaCO₃, 1 L de jugo V8, centrifugado a 4,000 rpm por 20 min) (^{Fernández-Pavía et al., 2020}). Se caracterizó la forma de la colonia y la apariencia del micelio. Para la producción de esporangios se modificó el protocolo de ^{Hwang et al. (1975}); tres discos de micelio de 5 mm de cada aislado se cultivaron por triplicado en cajas Petri 60 x15 mm con 10 mL de medio scV8 agar, sobre papel celofán transparente y expuestos a luz por 24 h. El papel celofán con el micelio se transfirió a una caja Petri, se le agregaron 10 mL de medio líquido scV8 (900 mL de agua destilada, 100 mL jugo-V8, 1 g CaCO₃), se incubaron durante 24 h a 18 ℃ en oscuridad, se decantó el medio líquido, se enjuagaron tres veces y se inundaron con una solución de sales de acuerdo con el protocolo de ^{Chen y Zentmyer, (1970}) (se disolvieron en un litro de agua destilada: 1.64 g de Ca (NO₃)₂, 0.05 g de KNO₃ y 0.48 g de MgSO4, la solución se esterilizó 20 min a 15 lb de presión); a continuación se expusieron a luz blanca a 25 ℃, cada 24 h, se enjuagaron tres veces con la solución salina, por dos días consecutivos y se registraron las estructuras reproductivas observadas (^{Erwin y Ribeiro, 1996}; ^{Abad et al., 2019}).

Pruebas de patogenicidad. Para realizar las pruebas de patogenicidad se seleccionaron cuatro aislados que se inocularon en frutos de aguacate con madurez fisiológica, se lavaron con jabón y agua corriente y se asperjaron con alcohol al 75% para desinfestarlos. Dos discos de micelio de 6 mm de diámetro de los aislados ZITR-1-3, ZITR-2-5, ZITR-3-4 y ZITR-5-3, de cuatro días de crecimiento desarrollados en medio harina de maíz, se colocaron en los costados de los frutos, los discos se cubrieron con cinta masking tape Janel™, se usaron tres frutos por aislado, una vez inoculados se colocaron en cámara húmeda y se incubaron a 25 °C. Como testigos tres frutos fueron inoculados con discos de medio harina de maíz.

Sensibilidad a fungicidas. Se evaluó la sensibilidad de 15 aislados a fosfito de potasio (Fp) (Nutriphite plus magnum 40 % Gowan^®) a concentraciones finales de 0, 5, 10, 25, 50, 100, 300 y 600 µg mL^-1 de i.a. y a metalaxil-M (Mtx) (Ridomil Gold^® 480SL) 0, 0.5, 1, 3 y 5 µg mL^-1 de i.a. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial, con tres réplicas. La concentración efectiva a la cual se inhibió el 50% del crecimiento micelial (valor de CE₅₀) se calculó utilizando el método tradicional de dilución en agar (^{Gray et al., 2018}). El fungicida se agregó en medio cV8-A al 10% para obtener las concentraciones finales. Discos de 6 mm de micelio de los aislados de cuatro días de crecimiento cultivados en HMA, se colocaron en el centro de las cajas Petri que contenían las diferentes concentraciones. Después de tres días de incubación en oscuridad a 22 °C, se midió el crecimiento de la colonia en dos direcciones perpendiculares, se restó la medida del disco de inóculo y se obtuvo el promedio. El crecimiento se calculó dividiendo el diámetro de la colonia en las cajas Petri con fungicida, entre el promedio de crecimiento de las cajas testigo y se expresó como porcentaje (^{Hu et al., 2010}).

Efecto de la temperatura y medio de cultivo en el crecimiento del micelio. Se seleccionaron seis aislados con base en el porcentaje de inhibición a Fp; tres aislados con bajo porcentaje de inhibición y tres con alto porcentaje de inhibición (se agregó una A (alto) y una B (bajo) al final del código de identificación de cada aislado usado en esta prueba), para determinar si existía o no una relación entre velocidad de crecimiento y sensibilidad. La tasa de crecimiento (mm por día) se determinó a 22 y 25 °C en los medios de cV8 agar y HMA, siguiendo la metodología descrita por ^{Belisle et al. (2019b}). Se cortaron discos de agar de 7 mm de diámetro del margen de las colonias de 4 días desarrolladas en medio HMA, se transfirieron a las cajas con los medios correspondientes y se incubaron en la oscuridad durante cuatro días a las dos temperaturas. El diámetro de la colonia se midió diariamente.

Para calcular los valores de la CE₅₀ se estimó el porcentaje promedio de inhibición de las dos repeticiones para cada concentración de los fungicidas en función del porcentaje observado en el grupo testigo, utilizando la siguiente formula ICR (%) = (CRT-CRF)/CRT) x100, donde ICR es el porcentaje de inhibición del crecimiento radial, CRT es el crecimiento radial del testigo y CRF es el crecimiento radial en cada una de las concentraciones. Para obtener la CE₅₀ se incluyó el logaritmo natural de cada una de las concentraciones examinadas; se hizo el análisis probit para cada aislado asociado con el 50% de su inhibición (^{Adaskaveg et al., 2015}). Los experimentos se hicieron por duplicado.

Para determinar el efecto de la temperatura y del medio en los aislados, se tomó en consideración el crecimiento final; se obtuvo el promedio y con estos valores se procedió a realizar un análisis de varianza y comparación múltiple de medias (Tukey, 0.05) para un experimento factorial 2x2. Con la información del promedio de crecimiento final se construyeron gráficos de interacción para observar el efecto del factor sobre la variable. Los análisis y gráficos se realizaron con R versión 4.0.1 (2020-06-06).

Caracterización molecular. Los aislados ZITR-1-3 y ZITR-5-3 se crecieron en medio de ejote (papilla de ejote y calabacita: Gerber Nestlé^®, 339 g, agar 15 g y agua 646 mL) por cinco días. El micelio se colectó, deshidrató a 39 ºC durante 24 h, almacenó a -20 °C por 24 h, molió y se extrajó el ADN genómico siguiendo un protocolo de extracción con base en CTAB (^{Fernández-Pavía et al., 2020}). El ADN se cuantificó en un espectrofotómetro (Varioskan Flash Thermo Scientific NanoDrop 2000^®) y diluyó para obtener una concentración de 12 ng µL^-1. El ADN se amplificó por PCR utilizando oligonucleótidos para la región del espaciador interno transcrito (ITS). Las reacciones contenían 6.25 μL de GoTaq^® Hot Start Master Mix (Promega, Madison, WI, EE. UU.), 0.0675 μL de cada uno de los oligonucleótidos ITS4 (TCCTCCgCTTATTgATATgC) e ITS6 (gAAgAAggTgAAgTCgTAACAAgg) (100 pmol μL^-1), 3 μL de ADN genómico (30 ng) y agua destilada ultrapura hasta tener un volumen final de 13 μL. Las reacciones de amplificación se hicieron en las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial durante 2 min a 94 °C, 35 ciclos de desnaturalización durante 1 min a 94 °C, alineación durante 1 min a 53 °C, extensión durante 1 min a 72 °C, y una extensión final durante 10 min a 72 °C. Los productos de la PCR se secuenciaron (Macrogen, Seúl, Corea del Sur) y las secuencias fueron editadas usando los programas PreGap y Gap (http://staden.sourceforge.net). Las secuencias consenso obtenidas se analizaron con el programa Blast de NCBI [National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] para comparar con otras secuencias de Oomicetes de esta base de datos.

Resultados

Aislados obtenidos. Se hizo una siembra por cada muestra de raíces de un total de 25 muestras. Se obtuvieron 15 aislados (Cuadro 2) con características morfológicas de P. cinnamomi, en el resto de las cajas se observó crecimiento bacteriano, por lo que se descartaron.

Tipo de compatibilidad. Las cruzas de los aislados con una cepa de tipo de compatibilidad A1 de P. cinnamomi, produjeron oosporas pléroticas con anteridios anfíginos. Las cruzas de los aislados con una cepa de tipo de compatibilidad A2 solamente produjeron clamidosporas globosas (Figura 1D). Los resultados indican que los aislados corresponden al tipo de compatibilidad A2.

Caracterización morfológica y molecular. Los aislados desarrollaron colonias de forma rosácea y bordes ondulados, con micelio abundante, algodonoso, coraloide, hifas cenocíticas con hinchamientos, con clamidosporas globosas, en medio de cultivo HMA, en medio sV8-A las colonias presentaron forma estrellada (Figuras 1F-G). Los aislados produjeron esporangios sin papila, ovoides, elipsoides, con proliferación interna y persistentes, en los cultivos inundados con una solución de sales (Figura 1A-E). Las características observadas concuerdan con las reportadas para P. cinnamomi (^{Erwin y Ribeiro 1996}; ^{Hardham, 2005}; ^{Abad et al., 2019}). Las secuencias analizadas de la región ITS de los aislados seleccionados para la identificación molecular ZITR-1-3 y ZITR-5-3, coinciden con las reportadas para P. cinnamomi.

Pruebas de patogenicidad. Las pruebas en frutos de aguacate resultaron positivas, a las 72 h posinoculación (hpi) se observaron lesiones oscuras, circulares, con bordes irregulares en la epidermis. A las 96 hpi las lesiones tenían entre 3 y 6 cm de diámetro. Los frutos testigos no presentaron daños y todos los aislados fueron reaislados de los frutos inoculados, demostrándose así la patogenicidad al completarse los postulados de Koch (Figura 1H).

Figura 1 Características morfológicas y patogenicidad de P. cinnamomi. A) Micelio coraloide; B-C) Esporangios sin papilas ovoides-elipsoides; D) Clamidosporas globosas en grupos; E) Proliferación interna de esporangios; F) Colonia en forma estrellada, algodonosa en medio cV8A; G) Colonia rosácea en medio HM; H) Patogenicidad en frutos de los aislados (de arriba hacia abajo) ZITR-2-5, ZITR-3-4, ZITR-5-3, ZITR-1-3 y testigo. 

Sensibilidad a fungicidas. El efecto de los fungicidas Fp y Mtx en el crecimiento de la colonia y porcentaje de inhibición de los aislados entre tratamientos resultó significativo (P>0.001). No se detectaron aislados resistentes a los fungicidas. Con Fp no se observaron diferencias estadísticas entre aislados para crecimiento (P>0.63) ni para inhibición (P>0.982) del micelio, caso contrario fue entre las diferentes concentraciones donde si hubo significancia. Además, algo particular que se observó fue la promoción del crecimiento de ocho aislados (ZITR-1-3, ZITR-1-5, ZITR-2-1, ZITR-2-4, ZITR-3-2, ZITR-3-4, ZITR-5-1, ZITR-5-3) por Fp a 5 μg mL^-1 (1.15-18.61%) (Figura 2). En la comparación de medias se formaron seis grupos, no se observó diferencia significativa de crecimiento entre el control (16.76 mm) y la primera concentración (16.02 mm); el crecimiento fue mayormente inhibido a 100, 300 y 600 μg mL^-1, resultando estas concentraciones estadísticamente iguales, tanto para crecimiento como para inhibición (Cuadro 2). Los valores del efecto de Fp en la inhibición del crecimiento oscilaron entre 54.7 y 74.2 % con respecto al testigo y para la CE₅₀ entre 11.8 y 37.7 μg mL^-1 con una media de 24.62 μg mL^-1 de fosfito de potasio. Para Mtx, se observó menor variación entre los tratamientos con respecto a Fp, a concentraciones de 3 y 5 μg mL^-1 el micelio fue mayormente inhibido, el porcentaje de inhibición osciló entre 80.4 y 100% y los valores de CE₅₀ oscilaron entre 0.08 y 0. 34 μg mL^-1 con una media de 0. 215 μg mL^-1 de metalaxil-M. Entre los aislados no hubo significancia en el crecimiento (P> 0.996) ni en la inhibición (P>1.0) del micelio (Cuadro 3).

Figura 2 Inhibición del crecimiento micelial de aislados de P. cinnamomi colectados en Zitácuaro, Michoacán ante fosfito de potasio. 

Efecto de la temperatura y medio de cultivo en el crecimiento del micelio. Los análisis mostraron un efecto significativo (P>0.001) en la tasa de crecimiento del micelio a las dos temperaturas y en los dos medios nutritivos y sus interacciones; en la prueba de comparación de medias se formaron seis grupos, los aislados con mayor inhibición (%) a Fp presentaron una mayor velocidad de crecimiento que los de menor inhibición; sin embargo, en el aislado ZITRA-3-3 con mayor inhibición (%) se observó la menor tasa de crecimiento (11.25 mm) y ZITRB-1-5 con menor inhibición (%) una mayor (21.75 mm), aunque éste último también presentó mayor variación en los datos (Figura 3). El crecimiento de los aislados ZITRA-1-4, ZITRA-5-5, ZITRB-3-4 y ZITRB-2-4 osciló entre 18.66 y 15.91 mm. Se observó una tasa de crecimiento mayor de las colonias a 25 ºC y en medio de cultivo cV8-A, a excepción del aislado ZITRB-1-5, que presentó mayor crecimiento a 22 ºC (Figura 4). La morfología de la colonia varió de acuerdo con medio de cultivo, los aislados en cV8-A, presentaron colonias de forma estrellada y en HMA de forma rosácea.

Discusión

Este es el primer estudio de aislados de P. cinnamomi asociados con la marchitez del aguacate en la región oriente de Michoacán, que incluye el municipio de Zitácuaro. Otros estudios sobre esta enfermedad han reportado la presencia de P. cinnamomi en otras áreas del estado (^{Ochoa-Fuentes et al., 2007}; ^{Ochoa-Fuentes et al., 2018}; ^{Hernández-Pérez et al., 2019}). La superficie cultivada de aguacate en Zitácuaro se ha incrementado en los últimos años y potencialmente podría ser un área importante de producción en el futuro; sin embargo, la presencia del patógeno P. cinnamomi representa una amenaza para el cultivo. Esta zona presenta ciertas características agroclimáticas, como es la presencia de suelos de tipo Acrisol, que favorecen el desarrollo de esta enfermedad (^{Zentmyer, 1980}; ^{Guillén-Andrade et al., 2007}). Los árboles muestreados fueron adultos, establecidos en huertos con suelos con alto contenido de arcilla y poco drenaje, factores que contribuyeron a la presencia de la enfermedad (Zentmyer, 1980; ^{Erwin y Ribeiro 1996}; ^{Hardham, 2005}). Aun cuando en este trabajo se recuperaron solamente aislados con características morfológicas de P. cinnamomi en árboles con pudrición de raíces, no se descarta la presencia de otros oomicetes.

Figura 3 Efecto de temperatura y medio de cultivo en el crecimiento micelial de seis aislados de P. cinnamomi obtenidos de raíces de aguacate con pudrición 

Figura 4 Efecto de las temperaturas 22 y 25 ºC en seis aislados de P. cinnamomi aislados de raíces de aguacate con pudrición 

Todos los aislados correspondieron al tipo de compatibilidad A2, lo que es indicativo de que el oomiceto se está reproduciendo de manera asexual. Aunque en Michoacán, ^{Ochoa-Fuentes et al. (2005}) reportaron los dos tipos de compatibilidad mediante marcadores moleculares, no lo demostraron mediante cruzas, como se hizo en el presente estudio, que se considera la forma más precisa para determinarlos. Las características morfológicas observadas en los aislados concuerdan con las descritas para P. cinnamomi de acuerdo a ^{Abad et al. (2019}), identidad que se corroboró, con la amplificación de la región ITS en aislados seleccionados y cuya patogenicidad se demostró en frutos de aguacate. P. cinnamomi se encuentra entre los 10 principales oomicetos patógenos de plantas, que infecta más de 5000 especies (^{Hardham, 2005}) y su patogenicidad ha sido demostrada (^{Linde et al., 1999}; ^{Rodríguez-Padrón et al., 2018}; ^{Belisle et al., 2019b}).

Desde hace años, los fosfitos se han utilizado para el control de la pudrición de raíz, los productores de aguacate utilizan con mayor frecuencia el fosfito de potasio que el metalaxil-M, debido a que es eficaz y de menor costo que otros (^{Adaskaveg et al., 2015}; ^{Belisle et al., 2019b}). Nuestros resultados demuestran que no hay aislados resistentes a los fungicidas evaluados en Zitácuaro Mich; sin embargo, por lo que respecta a fosfito de potasio se observó menor sensibilidad de los aislados con respecto a metalaxil-M. Los valores obtenidos de CE₅₀ oscilaron entre 11.8 y 37.7 μg mL^-1 de fosfito de potasio y para la inhibición del crecimiento entre 54.7 y 74.2 % comparado con el testigo, los cuales resultan similares a los obtenidos por ^{Wilkinson et al. (2001}), quienes obtuvieron valores de inhibición que oscilaron entre 59 y 100 %. En ocho de los aislados se observó una promoción de crecimiento cuando fueron expuestos a la concentración de 5 μg mL^-1 de i.a de fosfito de potasio, resultados que concuerdan con los de Wilkinson et al. (2001) y ^{Hunter et al. (2018}). Lo anterior podría deberse a que, a bajas concentraciones de fosfito de potasio, en medio rico en nutrientes cV8, sea más fácil para P. cinnamomi alterar el crecimiento como una estrategia de supervivencia, además que por su efecto fungistático no afecta el crecimiento micelial (^{Guest y Grant, 1991}; ^{Hunter et al., 2018}). Otra razón es la pérdida de sensibilidad de los aislados debido a la posible exposición frecuente al fungicida ya que son sometidos a una presión de selección, situación que eventualmente podría generar el desarrollo de resistencia, incluso aunque no exista recombinación sexual (^{Dobrowolski et al., 2008}; ^{Hunter et al., 2018}). Además de P. cinnamomi, se ha reportado la sensibilidad a fosfito de potasio de P. syringae, P. citrophthora, sin embargo, la inhibición del crecimiento de las especies in vitro, no es indicativo de que en campo el control de la enfermedad sea efectivo (^{Hao et al., 2021}).

Por otro lado, aunque ^{Marin et al. (2021}) reportaron desarrollo de resistencia de especies de Phytophthora a metalaxil-M (mefenoxan), en el presente estudio se observó en promedio un 88.24% de inhibición del crecimiento y un valor de CE₅₀ de 0.08 y 0. 34 μg mL^-1 de metalaxil-M mL^-1 lo que sugiere que las poblaciones de P. cinnamomi obtenidas de aguacate son sensible al fungicida. En un estudio similar, los aislados obtenidos de plantas ornamentales de vivero fueron menos sensibles con valores de CE₅₀ de 0.01-0.08 μg mL^-1 de metalaxil (^{Hu et al., 2010}). Lo anterior puede deberse a que en los viveros las aplicaciones son más controladas y con menor frecuencia que en campo. En Carolina del Norte, en pruebas de sensibilidad de P. cinnamomi aislada de árboles de navidad a metalaxil se obtuvieron porcentajes de inhibición que oscilan entre 89 y 100 %, esto a pesar de que en el lugar se hacen aplicaciones de metalaxil dos o tres veces al año (^{Benson y Grant, 2000}). Lo anterior confirma que P. cinnamomi es sensible a metalaxil-M, además los altos porcentaje de inhibición de crecimiento micelial por metalaxil-M, también se han observado en otras especies como P. nicotianae (73. 5%) y P. × pelgrandis (97.5%) (^{Pánek y Tomšovský et al., 2017}).

Así mismo, ^{González et al. (2014}) indicaron que el medio de cultivo V8 promueve el crecimiento de Phytophthora respecto a otros medios. Estos resultados son consistentes con los obtenidos en este trabajo ya que los aislados con mayor crecimiento fueron los cultivados en V8. Se observó diferencia de crecimiento entre las dos temperaturas, favoreciéndoles la de 25 ºC, la cual se encuentra dentro del rango de temperatura óptima de crecimiento de P. cinnamomi que oscila entre 24 y 28 ºC (^{Erwin y Ribeiro 1996}).

En México, los estudios de sensibilidad de aislados de P. cinnamomi a fungicidas son escasos. Los resultados de este trabajo dan una estimación del rango de sensibilidad a fosfito de potasio y metalaxil-M de aislados de P. cinnamomi causando pudrición de raíz en aguacate en el municipio de Zitácuaro, Michoacán; sin embargo, es necesario hacer más estudios que incluyan un mayor número de aislados provenientes de los principales municipios productores, que nos permita determinar si las poblaciones del patógeno están desarrollando tolerancia a dichos fungicidas.

Conclusiones

Los resultados de este trabajo indican que, en Zitácuaro, Michoacán, P. cinnamomi es el principal oomicete presente en raíces de aguacate con pudrición, de 25 muestras de raíces, se obtuvieron 15 aislados con características morfológicas de P. cinnamomi. Los aislados se inhibieron más del 98% a concentraciones de 300 y 600 μg mL^-1 de fosfito de potasio y arriba de 96% a 3 y 5 μg mL^-1 con metalaxil- M.