Muestras y reactivos

Se colectaron cuatro muestras superficiales (10 cm de profundidad) de Tecnosoles (^{International Union of Soil Sciences [IUSS], 2015}) de una mina abandonada de extracción de plomo, localizada a 2 km al sur del municipio de San Felipe de Jesús, Sonora, México (29° 50' 58.43" N, 110° 14' 48.85" O). Las muestras se depositaron en contenedores estériles y se transportaron a laboratorio para su análisis posterior. Como fuente de cadmio (Cd²⁺), cromo (Cr⁶⁺), mercurio (Hg²⁺) y plomo (Pb²⁺) se utilizaron las sales metálicas CdCl₂, K₂Cr₂O₇, HgCl₂ y (CH₃COO)₂ Pb(3H₂O, respectivamente. Como medio de cultivo se usó agar papa dextrosa (PDA, Difco™).

La composición de metales en las muestras de suelo se determinó por espectrometría de energía dispersiva (Energy Dispersive Spectroscopy, EDS por sus siglas en inglés) a través de microscopía de transmisión electrónica (Transmission Electron Microscopy, TEM por sus siglas en inglés).

Aislamiento de la cepa fúngica

Muestras de 1 g de suelo se depositaron en 100 mL de agua destilada esterilizada. La mezcla se agitó durante 20 min a temperatura ambiente y se prepararon diluciones seriadas (10^-1 a 10^-4). Después se tomaron alícuotas de 100 μL de cada dilución, se colocaron en las placas Petri con PDA y se incubaron a 28 °C por 7 días. Se seleccionaron las colonias al azar y el procedimiento de siembra se repitió hasta lograr el aislamiento y la purificación de la cepa fúngica.

Preparación e inoculación de la suspensión de esporas

La cepa purificada se inoculó en un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenía 50 mL de PDA y se incubó a 28 °C por 7 días. Se agregaron 100 mL de agua destilada y se colocó en un agitador magnético durante 5 min a temperatura ambiente. La concentración de esporas en la suspensión se estimó con una cámara Neubauer. Se preparó una suspensión de alrededor de 10⁸ esporas∙mL^-1 para la inoculación del medio de cultivo suplementado con los metales tóxicos. A las placas Petri con PDA solidificado y los metales se les hizo un orificio en el centro, donde se depositó la suspensión de esporas para obtener colonias de forma circular.

Identificación de la cepa fúngica aislada

El hongo se identificó con base en las principales características morfológicas macro y microscópicas en un cultivo de siete días. Las características macroscópicas consideradas fueron color, forma y tipo de colonia. Como características microscópicas se consideró la morfología y tamaño de las esporas, conidióforo e hifas, las cuales se documentaron por microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés). Para la microscopía óptica, las estructuras se tiñeron con azul de lactofenol. En el caso de la microscopía electrónica se utilizaron muestras de micelio libres de humedad.

Índice de tolerancia

El índice de tolerancia de la cepa aislada se evaluó con los metales cadmio, mercurio y plomo de manera individual en concentraciones de 50, 100, 250, 350 y 500 ppm. El As y dichos metales son considerados como los más tóxicos por la ^{ATSDR (2019)}; sin embargo, no se contó con alguna fuente de As por lo que no fue posible incluirlo en el estudio. También se evaluó un sistema multimetal (mezcla de metales) de cadmio, cromo, mercurio y plomo en concentraciones de 4, 8, 16, 64, 80, 120, 200 y 400 ppm; la proporción de cada metal fue equitativa. En ambos sistemas (individual y multimetal), las placas Petri con PDA suplementadas con los metales se inocularon con las esporas fúngicas y se incubaron a 28 °C por 7 días; cada 24 h se midió el radio de las colonias desarrolladas. El PDA inoculado con la cepa fúngica, pero sin metales, se consideró como control. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. El índice de tolerancia se calculó como el cociente del radio de la colonia con metal entre el radio de la colonia control.

Concentración mínima inhibitoria

La concentración mínima inhibitoria (CMI) es la concentración más baja a la cual una sustancia inhibe el crecimiento de un microorganismo (^{Ezzouhri, Castro, Moya, Espinola, & Lairini, 2009}). En este estudio, la CMI se obtuvo a partir de los experimentos de índice de tolerancia.

Análisis estadístico

Después de evaluar la normalidad de los datos (Shapiro-Wilk), las diferencias de los valores medios de índices de tolerancia entre las concentraciones de los metales se estimaron mediante ANOVA de una vía con los días como bloques. Las diferencias significativas se estudiaron utilizando la prueba de Tukey (P < 0.05). Todas las pruebas se realizaron utilizando el software GenStat v. 20 (^{VSN International, 2019}).

Composición elemental del suelo

La composición elemental, obtenida por TEM-EDS, indica la presencia de 15 elementos (O, Si, Al, Mg, S, Ca, P, Fe, Cl, Ni, K, Zn, Pb, As y Mn) en la muestra de suelo, a partir de la cual se aisló la cepa estudiada. Resalta la presencia de Al, Pb y As por su toxicidad potencial a una gran diversidad de organismos vivos, desde microorganismos hasta el hombre; según el análisis TEM-EDS, dichos elementos se encuentran en proporción de 0.1, 0.11 y 0.14 %, respectivamente (Cuadro 1). La ^{ATSDR (2019)} clasifica al As como la sustancia más tóxica, seguida por el Pb.

En general, la diversidad de microorganismos es baja en ambientes de estrés causado por la presencia de sustancias tóxicas. Algunos microorganismos, al igual que las plantas y los animales, han desarrollado estrategias que les permiten sobrevivir con éxito y mantenerse en las comunidades estresadas, donde otros organismos no pueden proliferar; por ejemplo, Aspergillus y Penicillium producen cantidades abundantes de esporas que resisten la dispersión y logran sobrevivir periodos largos de inactividad (^{Atlas & Bartha, 2001}). Lo anterior coincide con lo encontrado en este estudio, ya que la cepa aislada corresponde al género Aspergillus. Los límites de tolerancia a los factores estresantes son los que determinan en gran medida a los habitantes en los ambientes con estrés (compuestos tóxicos, niveles altos de radiación solar y escasez de agua) (Atlas & Bartha, 2001).

Identificación de la cepa fúngica

Por su morfología, el hongo microscópico aislado en este estudio se identificó como Aspergillus terreus Thom 1918. El hongo presentó colonias de crecimiento rápido a 28 °C en PDA, de color blanco a amarillo claro durante los primeros dos días de cultivo, cambiando a café al tercer día; las colonias al reverso también fueron color café. El micelio se observó ramificado con hifas hialinas de diámetro mayor de 1 μm. Aspergillus terreus produjo abundantes esporas con diámetro de 1.5 μm (Figura 1a), vesículas periformes de 10 a 15 μm (Figura 1b) y conidióforos de 150 μm de largo (Figura 1c). Estas características morfológicas coinciden con las reportadas para A. terreus por ^{Klich (2002}) y ^{Atiqah y Zakaria (2017}).

Figura 1 Características microscópicas de Aspergillus terreus por microscopía electrónica de barrido (JEOL JSM-5410 LV): a) esporas, la barra indica 10 µm; b) conidióforo, la barra indica 10 µm; c) hifas, conidióforo y esporas, la barra indica 80 µm. 

La comunidad microbiana del suelo suele ser muy diversa, en especial la de los hongos microscópicos encontrados entre 10 y 30 cm de profundidad. Los hongos microscópicos aislados fueron principalmente del género Fusarium, Penicillium, Trichoderma, Aspergillus y Geotrichum, los cuales presentan distribución cosmopolita (^{Jiang, Wang, Xue, Cao, & Zhang, 2016}; ^{Mohammadian, Ahari, Arzanlou, Oustan, & Khazaei, 2017}; ^{Oladipo, Awotoye, Olayinka, Bezuidenhout, & Maboeta, 2018}). No obstante, la diversidad micológica en ambientes estresantes, debido a la presencia de sustancias tóxicas como los metales, suele ser más baja comparada con un ambiente sano (^{Dixit et al., 2015}). La presencia del género Aspergillus en ambientes contaminados con metales tóxicos se ha reportado en diversos estudios (^{Awasthi, Pandey, & Khan, 2017}; ^{Rose & Devi, 2018}; ^{Villalba-Villalba, Cruz-Campas, & Azuara-Gómez, 2018}; ^{Zafar et al., 2007}).

Índice de tolerancia

El índice de tolerancia se usó para evaluar el comportamiento del crecimiento de A. terreus a varias concentraciones de metales tóxicos. Los resultados de ANOVA indicaron que los días no son significativos en los cuatro tratamientos (Pb, Hg, Cd y mezcla de metales), pero sí reveló diferencias significativas en el índice de tolerancia en respuesta a las concentraciones de metales, tal como se muestra en el Cuadro 2. De acuerdo con ^{Oladipo et al. (2018}), el índice de tolerancia a metales por los hongos puede clasificarse de la manera siguiente: >1 muy alto, 0.8 - 0.99 alto, 0.6 - 0.79 moderado, 0.4 - 0.59 bajo y 0.0 - 0.39 muy bajo.

La Figura 2 indica que A. terreus fue muy tolerante al plomo en todas las concentraciones evaluadas, siendo a 100 ppm donde en promedio se registró la menor tolerancia con significancia estadística (P < 0.05). No obstante, el índice de tolerancia siempre fue mayor de 0.9, incluso al día 7 de crecimiento. Resultados similares fueron reportados por ^{Sanyal, Rautaray, Bansal, Ahmad, y Sastry (2005}), quienes encontraron que el plomo no fue tóxico para el hongo Fusarium oxysporum Schltdl. 1824, el cual creció sin problema después de la exposición a concentraciones similares a las del presente estudio. ^{Maini et al. (2019}) observaron tolerancia alta al plomo en especies de Penicillium y Taloromyces; sin embargo, las concentraciones que evaluaron fueron menores (0.5, 1 y 3 ppm) que las del presente estudio. Se ha reportado que diversas especies de Aspergillus exhiben tolerancia alta a metales tóxicos (^{Mungasavalli, Viraraghavan, & Jin, 2007}; ^{Thippeswamy, Shivakumar, & Krishnappa, 2014}); tal es el caso de A. niger Tieghem 1867 con capacidad para crecer a 5 000 ppm de plomo (^{Iskandar, Zainudin, & Tan, 2011}). La tolerancia alta de A. terreus al plomo puede deberse a la exposición constante a este metal en su entorno local; es decir, en el suelo a partir del cual se aisló el hongo. Para ciertas especies fúngicas, la exposición a sustancias tóxicas en su hábitat puede desencadernar cambios adaptativos que les permiten mantenerse viables en esas condiciones de estrés (^{Valix, Tang, & Malik 2001}). Por tanto, la tolerancia elevada de este hongo al plomo puede estar relacionado con los mecanismos desarrollados para manejar la afluencia de dicho metal; además, en el presente estudio no se observó un efecto de retraso de la fase lag (fase de adaptación) de A. terreus a causa del plomo.

Figura 2 Índice de tolerancia de Aspergillus terreus a cinco concentraciones de (CH₃COO)₂ Pb(3H₂O como fuente de plomo. Letras diferentes indican diferencias significativas del índice de tolerancia entre concentraciones de acuerdo con la prueba de Tukey (P < 0.05). La barra muestra la desviación estándar de la media. 

Por otro lado, en la Figura 3, se observa que A. terreus presenta buen desempeño de crecimiento por exposición al mercurio, ya que los índices de tolerancia variaron entre 0.7 a 1.0 en casi la totalidad de los experimentos. Con las concentraciones de 350 ppm y 500 ppm hubo un efecto de alargamiento en la fase lag del hongo; a pesar de ello, el hongo fue capaz de adaptarse a la presencia del metal tóxico y alcanzar la fase exponencial. ^{Kurniati, Arfarita, e Imai (2014}) reportaron que A. flavus Link 1809 presenta un índice de tolerancia de 0.8 a 25 ppm de mercurio, mientras que ^{Khan et al. (2019}) observaron que A. niger y A. terreus, aislados de efluentes contaminados con metales tóxicos, fueron capaces de crecer en 26.66 ppm de mercurio y remover más de 90 % de este metal.

Figura 3 Índice de tolerancia de Aspergillus terreus a cinco concentraciones de HgCl₂ como fuente de mercurio. Letras diferentes indican diferencias significativas del índice de tolerancia entre concentraciones de acuerdo con la prueba de Tukey (P < 0.05). La barra muestra la desviación estándar de la media. 

En cadmio fue el más tóxico para A. terreus, dado que todas las concentraciones tuvieron efecto significativo sobre su índice de tolerancia, tal como se observa en la Figura 4. El hongo presentó baja tolerancia a 50 ppm (0.56 ± 0.9) al séptimo día de crecimiento y muy baja tolerancia a 100 ppm en los días 6 (0.17 ± 0.019) y 7 (0.20 ± 0.018). A esta última concentración, el crecimiento se observó hasta el día 6; es decir, hubo un efecto marcado de alargamiento de la fase lag del hongo por la presencia del cadmio. En las concentraciones de 250 ppm, 350 ppm y 500 ppm, A. terreus no presentó crecimiento. Esta alta toxicidad del cadmio hacia un hongo también se ha documentado en otras investigaciones (^{Joo & Hussein, 2012}; ^{Oladipo et al., 2018}). Similar al presente estudio, ^{Dey et al. (2016}) no observaron crecimiento de A. terreus a 500 ppm de cadmio.

Figura 4 Índice de tolerancia de Aspergillus terreus a cinco concentraciones de CdCl₂ como fuente de cadmio. Letras diferentes indican diferencias significativas del índice de tolerancia entre concentraciones de acuerdo con la prueba de Tukey (P < 0.05). La barra muestra la desviación estándar de la media. 

En general, en este estudio, la tolerancia de A. terreus se observó en el orden de plomo > mercurio > cadmio, lo cual indica alta toxicidad del cadmio. Varios estudios confirman que diversos hongos aislados de la misma fuente de sitios contaminados con metales han demostrado niveles distintos de resistencia (Chakraborty, Mukherjee, & Das, 2012; ^{Gururajan & Belur, 2018}; Kumar et al., 2018; ^{Zafar et al., 2007}).

En el sistema multimetal (mezcla de cadmio, cromo, mercurio y plomo) se observó un efecto de alargamiento de la fase lag en comparación con el control. Esto podría atribuirse a la toxicidad inducida por la mezcla de metales en el perfil de crecimiento de los hongos. Después de la fase de adaptación al ambiente tóxico, el hongo reanudó su crecimiento exponencial. Con base en la Figura 5, el índice de tolerancia a la mezcla de metales fue muy alto a 4 ppm (0.9 ± 0.08), 8 ppm (1.0 ± 0.03), 16 ppm (1.2 ± 0.08) y 64 ppm (0.9 ± 0.16) en los siete días de cultivo; moderado a 80 ppm (0.7 ± 0.06), 120 ppm (0.7 ± 0.06) y 200 ppm (0.6 ± 0.08); y bajo a 400 ppm (0.5 ± 0.01). ^{Dey et al. (2016}) estudiaron un sistema multimetal similar al de este estudio, el cual consistía en una mezcla de Cd, Cr, Cu, Ni, Pb y Zn en concentraciones de 6, 12, 18 y 30 mg∙L^-1. Estos investigadores observaron que Aspergillus fumigatus Fresenius 1863 mostró buena adaptabilidad al medio, así como un efecto en la fase lag con duración de 6 a 7 h en el control sin metales y de 17 a 18 h en el sistema multimetal.

Figura 5 Índice de tolerancia de Aspergillus terreus a varias concentraciones (4, 8, 16, 64, 80, 120, 200 y 400 ppm) de la mezcla de cadmio (CdCl₂), cromo (K₂Cr₂O₇), mercurio (HgCl₂) y plomo [(CH₃COO)₂Pb(3H₂O] en proporción equitativa de cada metal. Letras diferentes indican diferencias significativas del índice de tolerancia entre concentraciones de acuerdo con la prueba de Tukey (P < 0.05). La barra muestra la desviación estándar de la media. 

Concentración mínima inhibitoria

En todos los tratamientos con plomo y mercurio individuales, así como en el sistema multimetal, el hongo mostró crecimiento incluso en las concentraciones más altas (500 ppm tratamiento individual y 400 ppm sistema multimetal). Por tal razón, la CMI solo se pudo determinar en la evaluación individual con cadmio, encontrando que A. terreus ya no creció a partir de la suplementación del medio con 100 ppm (Cuadro 3).

^{Gururajan y Belur (2018}) aislaron cepas fúngicas de muestras de suelo de un vertedero de chatarra contaminado con metales y evaluaron la CMI; las cepas fueron reportadas como “aislados”, ya que no mencionan nombres de género y especie. Dichos autores encontraron CMI de 50 ppm de mercurio, 100 ppm de cadmio y 400 ppm de plomo. Se han reportado varios estudios de CMI para hongos microscópicos, pero la mayoría son para exposición a metales en forma individual. Para Bauveria bassiana Vuill. 1912, se encontró una CMI de 100 ppm para Cu II, Ni II y Cd VI de manera individual, 200 ppm para Cd II y 250 ppm para Zn II (^{Gola et al., 2016}). ^{Mishra y Malik (2012}) observaron que Aspergillus lentulus Balajee & K. A. Marr 2005 tiene CMI >12 000 ppm para Cr III, 5 000 ppm para Pb II, 850 ppm para Cu II, 550 ppm para Cr VI y 300 ppm para Ni II. Las variaciones en las tasas de supervivencia y los patrones de índices de tolerancia refuerzan los estudios que plantean que la tolerancia a las sustancias tóxicas depende de las características innatas de cada especie fúngica (^{Iskandar et al., 2011}; ^{Say, Yilmaz, & Denizli, 2003}); además, la exposición constante de hongos a los metales tóxicos también puede estar implicada en la capacidad de desarrollo de mecanismos de tolerancia (^{Gorbushina & Krumbein, 2000}).

Los hongos microscópicos han desarrollado diversas estrategias o mecanismos biológicos de adaptación para tolerar metales tóxicos y evitar el daño celular. Entre tales estrategias se pueden enumerar la quelación y la unión a la pared celular (secuestro extracelular) y el secuestro físico intracelular del metal mediante la unión a proteínas y otros ligandos (^{Pumpel & Paknikar, 2001}). La unión a la pared celular se llama biosorción. Los mecanismos extracelulares están implicados sobre todo en la prevención de la entrada de metales en la célula, mientras que los intracelulares tienen como objetivo reducir la acción de los compuestos tóxicos en el citosol. En el primer caso, la célula fúngica excreta moléculas orgánicas que no pertenecen a la matriz de la pared celular para la quelación de los iones metálicos (^{Gadd, 1993}). La superficie celular de ciertos hongos filamentosos tiene carga negativa, debido a la presencia de estructuras aniónicas, como el glucano y la quitina (^{Gupta, Nayak, & Agarwall, 2015}). Esto les confiere a los microorganismos la capacidad de unir cationes metálicos, mientras que, en el mecanismo intracelular, la tolerancia al metal está determinada, en apariencia, por proteínas de transporte que eliminan iones metálicos tóxicos del citosol fuera de la célula o secuestran metales en la vacuola (^{Bellion et al., 2006}).

También se ha reportado que el estrés por metales tóxicos puede reducirse mediante la síntesis de melanina. En sentido general, la melanina se refiere a los pigmentos oscuros sintetizados por organismos de todos los reinos biológicos, incluidos los hongos (^{Nosanchuk & Casadevall, 2003}b). Se ha sugerido que las melaninas juegan varios papeles en la biología fúngica (^{Cordero & Casadevall, 2017}) y, dadas sus múltiples propiedades, parece probable que estas ayuden a los hongos a sobrevivir a varios tipos de estrés, tanto bióticos como abióticos. Estos últimos incluyen radiación ultravioleta alta, especies reactivas de oxígeno y metales tóxicos. Las melaninas forman gránulos que pueden acumularse en la superficie celular o liberarse en el espacio extracelular (^{Malofe, Solhaug, Minibayera, & Beckett, 2019}) y, gracias a sus grupos funcionales, exhiben una alta afinidad de unión y capacidad de unión para muchos iones metálicos (Cordero & Casadevall, 2017).

Las estrategias que cada especie desarrolle pueden variar en función del lugar de aislamiento, tipo y concentración de metal (^{Rose & Devi, 2018}). Aspergillus tiene capacidad de captar el cobre por medio de un proceso activo, gracias a la síntesis de metalotioneína (^{Kermasha, Pellerin, Rovel, Goetghebeur, & Metche, 1993}). Por otro lado, ^{Chakraborty et al. (2013}) encontraron que Aspergillus foetidus Thom & Raper 1945 convierte el Pb soluble en Pb insoluble y lo podría retener en la superficie del micelio. También se ha reportado que algunas especies de Aspergillus han desarrollado un mecanismo enzimático para reducir la toxicidad del cromo. Este mecanismo está mediado por un sistema de enzimas antioxidantes que involucran peroxidasas, catalasas y ascorbato peroxidasa (^{Srivastava & Thakur, 2006}). ^{Bǔcková, Godočiková, Šimonovičová, y Polek (2005}) encontraron una relación positiva entre el nivel de catalasas totales y el incremento en la tolerancia de metales en cultivos de A. niger aislado de zonas con actividad minera. La producción de catalasas es uno de los mecanismos que las células utilizan para protegerse contra el daño causado por las especies reactivas de oxígeno. Por ello, dichos autores concluyeron que la regulación de la producción de catalasas de A. niger pudo ser una respuesta adaptativa al estrés ambiental generado no solo por una concentración alta de metales, sino también por cambios en el pH y contenido de nutrientes, que con frecuencia acompañan a los suelos impactados por residuos mineros. Es probable que A. terreus, aislado en el presente estudio, utilice mecanismos adaptativos similares a los mencionados.

Cambios en la morfología

En el desierto de Sonora se han encontrado, en su mayoría, hongos microscópicos con micelio de color verde intenso, café o negro (^{Ranzoni, 1968}). La Figura 6 muestra los cambios en la morfología y pigmentación del micelio por exposición a la mezcla de metales. A partir de 16 ppm se observan cambios en la coloración café en comparación con el control. En otros estudios también se ha documentado este fenómeno al exponer el micelio a metales en medio de cultivo (^{Yazdani, Yap, Abdullah, & Tan, 2010}). ^{Fazli et al. (2015}) observaron cambios en la coloración en varios hongos por exposición al cadmio: decoloración en Aspergillus versicolor Tirab. 1908 y Cladosporium sp., el color rosa de Paecilomyces sp. cambió a blanco, y Terichoderma sp. y A. fumigatus cambiaron de verde a blanco. En algunas especies pueden producirse pigmentaciones en las células fúngicas que van desde rojas, amarillas, negras o de otras tonalidades. Lo anterior puede deberse a la precipitación de los metales en la pared celular, en respuesta a que los hongos producen diversos compuestos extracelulares como agentes acomplejantes, agentes precipitantes, polisacáridos y pigmentos con capacidad de unir metales (^{Gadd, 2007}). En general, la posible explicación de estos cambios morfológicos puede deberse a los vastos mecanismos de desintoxicación/tolerancia que cada cepa ha desarrollado. La variación en la tolerancia a los metales tóxicos podría deberse a la presencia de uno o más tipos de estrategias de tolerancia o mecanismos de resistencia de las especies de hongos (^{Zafar et al., 2007}); además, se observó alteración de la estructura microscópica de la biomasa fúngica (hifas con aspecto rugoso y esporas aplanadas) tratada con 100 ppm de cadmio.

Figura 6 Morfología de las colonias de Aspergillus terreus en el sistema multimetal. a) 4 ppm, b) 8 ppm, c) 16 ppm, d) 64 ppm, e) 80 ppm, f) 120 ppm, g) 200 ppm y h) 400 ppm de la mezcla de cadmio (CdCl₂), cromo (K₂Cr₂O₇), mercurio (HgCl₂) y plomo [(CH₃COO)₂Pb(3H₂O] en proporción equitativa de cada metal, i) control sin metales.