Sitios de colecta

Durante octubre y noviembre del 2019 se inspeccionaron a) árboles de litchi ‘Racimo Rojo’ (48.5 cm de circunferencia promedio de tallo, a 40 cm sobre el nivel del suelo) en un huerto de 15 años de establecido (huerto #1: 18.659528, -96.920972, 609 m) en Zacatal Chico, Zongolica, Veracruz; b) tres huertos de aguacate ‘Hass’ injertado sobre portainjertos de la raza mexicana Persea americana var. drymifolia (Schltdl. & Cham.) S. F. Blake, con árboles de 3 a 3.5 m de altura y alrededor de cuatro a cinco años edad promedio del establecimiento, localizados en Michoacán: huerto #2 (19.334982, -102.165026; 1 674 m) y huerto #3 (19.34375, -102.17336; 1 667 m) en La Escondida, Uruapan, y huerto #4 localizado en Los Lobos, Nuevo Parangaricutiro (19.384093, -102.18279; 2 115 m); y c) una raíz de un tocón de pino (especie de Pinus no identificada) en un área forestal (19.38106, -102.18420, 2 052 m) aledaña al huerto #4 en Nuevo Parangaricutiro, Michoacán.

Muestreo y aislamiento de Armillaria/Desarmillaria

Se muestrearon árboles muertos recientemente o con síntomas de marchitez. El sistema radical de cada árbol se excavó e inspeccionó con el propósito de observar signos típicos (madera podrida, abanicos miceliales, rizomorfos y basidiomas) de la pudrición de raíces por Armillaria (Figura 1). El hongo se aisló de raíces infectadas de árboles siguiendo el procedimiento descrito por ^{Harrington, Worrall, y Baker (1992}) en el medio Benomilo-Dicloran-Estreptomicina (BDS) y se incubó por tres a cinco semanas a temperatura ambiente (20 a 26 °C). Posteriormente, los aislamientos fúngicos se transfirieron a un filtro de nailon sobre medio de malta-agar al 3 % para obtener micelio abundante del cual se extrajo el ADN.

Figura 1 Síntomas y signos de pudrición de raíces por Armillaria en litchi (Litchi chinensis) y aguacate (Persea americana). a) Huerto de aguacate con un árbol asintomático y otro sintomático (clorosis y declinación), b) muerte repentina de un árbol de aguacate, c) agrietamiento cortical con exudado color oscuro por infección de Armillaria mexicana cerca de la base del tallo de aguacate, d) abanico micelial en corona de raíz y base del tallo de árbol de aguacate sintomático, e) rizomorfos adheridos a una raíz de aguacate, f) abanico micelial de Desarmillaria caespitosa en raíz de árbol de litchi muerto recientemente y g) basidiomas de D. caespitosa en la base de un árbol de litchi.  

Amplificación, secuenciación y análisis de secuencias del tef1

Para la amplificación por PCR y la secuenciación de tef1 se siguió el protocolo descrito por ^{Elías-Román et al. (2018}); las secuencias de ADN se editaron y alinearon manualmente con BioEdit 7.1 (^{Hall, 1999}). Los sitios polimórficos se codificaron empleando el código IUPAC para nucleótidos ambiguos. Las secuencias del tef1 editadas de los aislamientos de árboles de aguacate, litchi y pino se compararon con secuencias disponibles en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information, 2021), utilizando la búsqueda de nucleótidos con BLAST y se depositaron en el GenBank. Los aislamientos derivados de abanicos miceliales se depositaron en el laboratorio de Ciencias Forestales, Estación de Investigación de las Montañas Rocosas del Servicio Forestal (RMRS), Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) en Moscow, Idaho, EUA.

Detección de la pudrición de raíces por Armillaria

Se obtuvieron ocho aislamientos de abanicos miceliales de raíces infectadas. Tres aislamientos (Ver2, Ver4 y Ver5) de árboles de litchi, muertos recientemente del huerto #1, mostraron crecimiento algodonoso y blanquecino, sin presencia de rizomorfos en el medio 3 % agar-malta después de aproximadamente cuatro semanas de cultivo. Otros cuatro aislamientos (Mich32, Mich35, Mich51 y Mich52) se obtuvieron de árboles de aguacate ‘Hass’ injertados en portainjertos de P. americana var. drymifolia, sintomáticos y muertos recientemente: Mich32 y Mich35 se colectaron de los huertos #2 y #3, respectivamente, en La Escondida, Uruapan, Michoacán, y los aislamientos Mich51 y Mich52 se colectaron en el huerto #4 en Los Lobos, Nuevo Parangaricutiro, Michoacán. El aislamiento Mich51 se obtuvo de un árbol de aguacate con síntomas de declinación y agrietamiento cortical, con exudado color oscuro cerca de la base del tallo (Figuras 1a, 1c y 1d) y los aislamientos Mich32, Mich35 y Mich52 se obtuvieron de árboles muertos recientemente. Otro aislamiento (Mich4) se obtuvo de un tocón de pino en un área adyacente al huerto #4 de aguacate. Los aislamientos de árboles de aguacate y del tocón de pino formaron micelio crustoso de color variable (marrón claro a oscuro) que produjo rizomorfos abundantes y exudados que provocaron una tinción café en el medio de cultivo.

Análisis de secuencias del tef1

Los aislamientos colectados de las raíces (Figura 1f) de árboles de litchi (Ver2, Ver4 y Ver5) del huerto #1 en Zongolica, Veracruz, se identificaron como Desarmillaria caespitosa con base en las secuencias de 1 215 pb del tef1 (accesiones en GenBank con números MZ851975, MZ851976 y MZ851977 para Ver2, Ver4 y Ver5, respectivamente), las cuales tuvieron similitud muy alta (99.7 %) con secuencias del tef1 disponibles en GenBank BLAST que fueron derivadas de aislamientos de D. caespitosa, como la accesión del GenBank MT232068 del aislamiento OOI-210 obtenido de durazno (^{Antonín et al., 2021}). La pudrición de raíces por Armillaria debido a D. caespitosa (reportada como C. tabescens), se ha asociado con la mortalidad de árboles de litchi y se han recomendado estrategias de manejo como la reducción de fuentes de inóculo, entre otras medidas (^{Cohen, 1955}). ^{Volk y Burdsall (1995}) consideraron previamente a C. tabescens como sinónimo de A. tabescens; sin embargo, la vicariante norteamericana de A. tabescens s. l. es reconocida actualmente como D. caespitosa (^{Antonín et al., 2021}).

Los cinco aislamientos colectados de aguacate y pino se identificaron como A. mexicana R. Elías, Medel, Alvarado, Hanna, Ross-Davis, Kim, & Klopfenstein (^{Elías-Román et al., 2018}) con base en secuencias del tef1 (accesión en GenBank con números MZ851978, MZ851979, MZ851980, MZ851981 y MZ851982 para los aislamientos Mich4, Mich32, Mich35, Mich51 y Mich52, respectivamente). La longitud de las secuencias del tef1 fue de 1 150 pb para el aislamiento Mich32 y 1 202 pb para los aislamientos Mich4, Mich35, Mich51 y Mich52. El BLAST de nucleótidos del GenBank tuvo similitud extremadamente alta (99.9 %) en tef1 para esos cinco aislamientos con el de A. mexicana (accesión en GenBank número KR061313). Esta especie, reportada por primera vez como Armillaria sp. se encontró en Zinapécuaro, Michoacán causando mortalidad de árboles de durazno y ciruelo (reportado como Prunus domestica L.) (^{Rivas-Valencia et al., 2017}). Por otra parte, se demostró que A. mexicana fue patógena y más virulenta que A. mellea (Vahl) P. Kumm en cuatro especies de Prunus evaluados en condiciones de invernadero y campo en el Estado de México (^{Elías-Román et al., 2019}), donde también A. mexicana fue reportada previamente en una zona forestal sobre un tocón de encino (Quercus sp.) (Elías-Román et al., 2018). Otras investigaciones mencionaron la presencia de A. mexicana en árboles de aguacate ‘Hass’ injertados sobre portainjertos mexicanos de semilla; sin embargo, las secuencias del tef1 no se depositaron en el GenBank para permitir la verificación de estas identificaciones (^{Hernández-Ramos et al., 2018}; ^{Michua-Cedillo et al., 2016}). Cabe destacar que las secuencias de 3’ LSU-IGS1 del ADN ribosómico en el GenBank (accesiones KU378660, KU378658, KU378657, KU378654, KU378655 y KU378659) muestran similitud alta con A. mexicana (accesión del GenBank KR061306); no obstante, dichas accesiones de GenBank no están asociadas con alguna publicación que discuta su origen. La región 3’ LSU-IGS1 es de utilidad en la identificación de A. mexicana (Elías-Román et al., 2013), pero no permite distinguir entre algunas otras especies de Armillaria, como A. gallica Marxm. & Romagn., A. sinapina Bérubé & Dessur. y A. cepistipes Velen. (^{Kim et al., 2006}). Adicionalmente, varias especies de Armillaria tienen secuencias 3’ LSU-IGS1 muy diversas que no pueden alinearse sin ambigüedad para efectuar análisis filogenéticos.

Las proyecciones del cambio climático sugieren que, probablemente, la pudrición de raíces por Armillaria aumentará en zonas donde el clima será menos adecuado para los hospederos, pero seguirá siendo adecuado para los patógenos (^{Kim et al., 2021}; ^{Klopfenstein, Kim, Hanna, Richardson, & Lundquist, 2011}). Además, la incidencia y severidad de la pudrición de raíces por Armillaria podrían multiplicarse en varias zonas frutícolas de México debido a los factores siguientes: 1) empleo de sustratos contaminados con propágulos de Armillaria/Desarmillaria en la propagación de plantas en viveros; 2) cambio de uso de suelo de bosque de pino-encino que podría promover la propagación de especies patógenas de Armillaria/Desarmillaria en huertos frutícolas recién establecidos; 3) uso de árboles que no se adaptan al sitio o se vuelven inadaptados debido al cambio climático; y 4) otras perturbaciones bióticas y abióticas que crean condiciones adecuadas para la pudrición de raíces por Armillaria.