Recolección de muestras y detección de baculovirus poliédricos

En este trabajo se muestrearon poblaciones de moscas sierra asociadas a los árboles Pinus y Juniperus que habitan en bosques templados ubicados entre 1 500 y 3 000 m en todos los sistemas montañosos de México (Figura 1). Con la ayuda de la red de técnicos locales de la CONAFOR (Comisión Nacional Forestal) se detectaron brotes de estos defoliadores en diversas regiones forestales. Posteriormente, de dichas infestaciones se recogieron 23 muestras de larvas vivas o muertas, sospechosas de portar infecciones baculovíricas. Las colectas se realizaron entre 2011 y 2019. La mayoría de las muestras se conformaron de larvas muertas y deshidratadas, colocadas dentro de contenedores individuales o en pequeños grupos de individuos con el mismo aspecto. Cuando los individuos colectados todavía estaban hidratados fueron puestos en frascos con silica gel o sus confinamientos se pusieron en hielo para transportarlos al laboratorio. Todos los especímenes se congelaron hasta su diagnóstico microscópico. Dos de las muestras se colectaron como larvas vivas, pero murieron durante su traslado al laboratorio.

Las muestras se examinaron para determinar la presencia de baculovirus en los cadáveres. Para su diagnóstico individual, sobre un portaobjetos, se preparó un frotis de la región abdominal de cada cadáver y se observó al microscopio Olympus CX43 a 400X o 1000X con iluminación de contraste de fases o campo oscuro; se registró el aspecto del cadáver, el tipo de microorganismo observado y su abundancia relativa. Para identificar las especies de moscas sierra involucradas en cada muestra de campo, los adultos obtenidos en campo o laboratorio se procesaron con claves taxonómicas apropiadas (^{De Lira et al., 2021}); sin embargo, para cuatro muestras (1, 2, 9 y 10, Cuadro 1) no se obtuvieron adultos ni se criaron a partir de larvas. Para las muestras 3, 7, 14, 15 y 23 (Cuadro 1) solo se determinó el género debido a la falta de claves taxonómicas apropiadas. Los adultos obtenidos de estas muestras no coincidieron de forma convincente con las claves taxonómicas disponibles, lo que sugiere que podrían tratarse de especies nuevas.

Figura 1 Mapa en el que se señalan los lugares donde se tomaron las 23 muestras de larvas de mosca sierra para la búsqueda de sus infecciones baculovíricas. El cuadro en la esquina superior derecha contiene la lista de las muestras analizadas y el nombre de los lugares de recolección. 

Detección molecular de ADN de baculovirus en larvas

Se realizó una prueba de hibridación de ácidos nucleicos en el ADN de cadáveres larvarios de Zadiprion ojedae Smith & Sanchez recolectadas en Guachochi, Chihuahua, y de Zadiprion borjai (^{González et al., 2022}) colectadas en Miquihuana, Tamaulipas.

Ensayos de actividad biológica de inóculos baculovíricos

Un cadáver de cada una de las cinco muestras de campo (4, 7, 8, 14 y 16; Cuadro 1) probadas se utilizó como fuente de inóculo para tratar un grupo de larvas sanas. Los inóculos se prepararon macerando el cadáver donante con un micropistilo en tubos Eppendorf de 1.5 mL con agua destilada y esterilizada (1.0 mL) y 0.05 % de Tween 80. El inóculo obtenido de cada uno de los cuatro primeros cadáveres donantes se aplicó en larvas (19 a 22) de Zadiprion spp. procedentes de Xicotes, Atzalán, Veracruz, mientras que el quinto inóculo se utilizó en 145 larvas de Monoctenus cuauhtemoci (^{De Lira et al., 2022}) procedentes de Ixcateopan de Cuauhtémoc, Guerrero (Cuadro 3). Un grupo control de 20 larvas sanas se utilizó para los inóculos 4, 7, 8 y 14 mientras que otro de 100 larvas sanas se utilizó para el inóculo 16. En este último caso, el inóculo de campo se incrementó en varias larvas sanas de la misma localidad, un año antes. La abundancia de poliedros de baculovirus fue diferente en cada cadáver donante.

Las larvas tratadas (tanto de Zadiprion spp. como de M. cuauhtemoci) fueron inoculadas mediante la impregnación de cebos de su dieta natural (acículas de pino o ramitas de Juniperus flacida Schltdl., respectivamente). La impregnación se hizo sumergiendo los trozos de acículas de pino (aproximadamente 8 cm de largo) o las ramitas de J. flacida (4 cm) en el macerado del inóculo respectivo. Los grupos de control se sumergieron en agua destilada. Ambos cebos fueron clavados en esponja floral (cubos de aproximadamente 2 x 2 x 2 cm) saturada con agua destilada para mantenerlos vivos, turgentes y erguidos, mientras las larvas se alimentaban de ellos. Los cebos fueron colocados dentro de confinamientos cilíndricos de plástico trasparente de 10 x 10 cm (diámetro x altura), aproximadamente. A dichos confinamientos se les habilitaron orificios de ventilación de 1.0 cm de diámetro, aproximadamente, cubiertos con malla fina de tela. Cuando las larvas consumieron los cebos impregnados con el inóculo, se proveyó nuevo alimento limpio (no impregnado con el inóculo). Los confinamientos se colocaron en un insectario con 12:12 h (luz: oscuridad), temperatura de 25 °C y humedad relativa de 70 %. Todos los días se revisaron las larvas tratadas para recoger las que habían muerto, conservarlas en recipientes mediante deshidratación con silica gel y luego congelarlas.

Recolección de muestras y detección de infección por baculovirus

En el campo se detectaron diferentes brotes de mosca sierra en 10 regiones comprendidas en ocho estados de la república mexicana (Aguascalientes, Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco, Michoacán, San Luis Potosí y Tamaulipas), cuya ubicación se indica en la (Figura 1). De dichas infestaciones se colectaron 23 muestras de larvas sospechosas de portar infección baculovírica (Cuadro 1). Estas muestras incluyeron, al menos, nueve especies de moscas sierra (Z. falsus Smith, Z. ojedae, Z. borjai, Zadiprion spp., M. sanchezii Smith, M. cuauhtemoci, Neodiprion omosus Smith, N. autumnalis Smith y Neodiprion spp.). Es posible que haya más especies en las cuatro muestras en las que no se determinó el género ni la especie porque no se obtuvieron adultos de la población correspondiente o en las otras cinco muestras cuyos adultos no se ajustaron a las descripciones de las claves taxonómicas, probablemente porque se trata de especies nuevas (Figura 1).

Detección molecular

La sonda DIG-NeabNPVPolh hibridó con su secuencia homóloga del control positivo (secuencia NeabNPVPolh) colocada en los pozos 3A y 3B de la Figura 2, pero no produjo señal significativa en los dos controles negativos: el ADN de garrapata (1A y 1B) y el ADN del cultivo celular de Zadiprion spp. sano (pozos 2A y 2B). La prueba mostró reacción significativa consistente con el ADN de tres muestras de Z. ojedae de Guachochi, Chihuahua (pozos 4A y 4B; 8A y 8B; y 12A y 12B en la Figura 2). Las muestras restantes no mostraron respuestas consistentes entre réplicas, por lo tanto, se consideraron negativas.

Figura 2 Ensayo de hibridación de ADN procedente de cadáveres de larvas de Diprionidae realizado en una membrana de nitrocelulosa. Como sonda se utilizó la secuencia del gen Polh de NeabNPV (741 pb), replicado en el plásmido PucIDT y marcado con digoxigenina. Se utilizaron 100 ng de ADN en cada pozo. Cada muestra se formó con 10 cadáveres de larvas de Zadiprion ojedai y Z. borjai recolectadas en el campo y sospechosas de portar infección baculovírica. La hibridación se detectó mediante una reacción inmunoenzimática utilizando un sustrato cromogénico que produce una coloración oscura. 

Detección de la infección baculovírica por microscopía óptica

Se encontraron pequeños cuerpos brillantes en los frotis de tejido abdominal de larvas observados en el microscopio (Figura 3); su brillo, forma y abundancia los hicieron compatibles con poliedros baculovíricos y diferentes de otros objetos brillantes también presentes en los frotis. Esos poliedros baculovíricos se detectaron en cadáveres de 11 muestras de campo (4, 7, 8, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 22) tomadas de cinco estados mexicanos: Chihuahua, Durango, Guerrero, San Luis Potosí y Tamaulipas (Cuadro 1). Los cadáveres con poliedros también presentaron otros microorganismos como bacterias (cocos o bacilos) (Figura 3), microsporidios u hongos. Con frecuencia dos o más de estos grupos de microorganismos fueron encontrados en cada cadáver.

Figura 3 Sección de macrofotografía tomada a un frotis de la región abdominal de un cadáver de Monoctenus cuauhtemoci de Ixcateopan de Cuauhtémoc, Guerrero (muestra 16 en el Cuadro 1). Para esta imagen se utilizó iluminación de contraste de fases con 400X. Los círculos rodean pequeños cuerpos brillantes interpretados como poliedros baculovíricos. Las flechas señalan células bacterianas bacilares con un cuerpo brillante en cada uno de sus extremos, lo que sugiere que pueden pertenecer a alguna variante de Bacillus thuringienesis. Los rectángulos rodean bacterias similares a los cocos. 

Actividad biológica de inóculos cadávericos

Los inóculos cadavéricos explorados indujeron síntomas y signos de enfermedad compatibles con infecciones baculovíricas o bacterianas: las larvas de prueba dejaron de alimentarse, perdieron gradualmente la movilidad y murieron con un oscurecimiento generalizado del cuerpo o localizado en su zona abdominal. En contraste, alrededor de 85 % de las larvas de los grupos de control alcanzaron el estado de pupa o se mantuvieron sanas hasta el momento en que murió la última larva tratada. En el examen microscópico de la mayoría de los cadáveres resultantes de las larvas tratadas con los inóculos 4 y 14 se observaron abundantes poliedros (en 17 de 19 y en 22 de 22, respectivamente). De acuerdo con el Cuadro 3, los inóculos 7 y 8 indujeron poliedros escasos en pocos cadáveres (en 1 de 20 y en 6 de 20, respectivamente). El inóculo 16 indujo una frecuencia moderada de poliedros en los cadáveres resultantes (33 de 145). Todos los macerados indujeron, además de los poliedros, proliferación de otros microorganismos diferenciables bajo el microscopio óptico a 400X o 1000X con contraste de fases o campo oscuro. Tales microorganismos fueron bacilos (pequeños, medianos o grandes), cocos, microsporidios o hifas de hongos. Todos ellos constituyeron la microbiota acompañante de los poliedros en las muestras de campo y en los cadáveres resultantes de este ensayo, parte de la cual es mostrada en la Figura 3. La microbiota acompañante en la mayoría de las larvas tratadas con los inóculos 4 y 14 fueron bacilos. Trece de las 20 larvas tratadas con el inóculo 7 mostraron proliferación de hifas fúngicas similares a las observadas en el cadáver donante del inóculo y las bacterias (Cuadro 3). Otros tres cadáveres de las larvas tratadas con los inóculos 7 u 8 mostraron bacterias tipo cocos (Cuadro 3). La mayoría de las larvas tratadas con el inóculo 16 presentaron bacilos pequeños o medianos o hifas fúngicas.

Detección de infecciones por baculovirus

El diagnóstico microscópico de los frotis de cadáveres larvarios a 400X y 1000X indicó la presencia de pequeños cuerpos brillantes en 11 de las 23 muestras de campo, los cuales fueron interpretados como poliedros de baculovíricos por su brillo, forma y abundancia relativa (Cuadro 1). Ocho especies de moscas sierra están representadas en las muestras portadoras de poliedros baculovíricos: Z. falsus, Z. ojedae, Z. borjai, Zadiprion spp., M. sanchezii, M. cuauhtemoci, N. omosus y N. autumnalis (Cuadro 1), las cuales se distribuyen en tres géneros.

La interpretación de esos cuerpos brillantes como poliedros baculovíricos está respaldada por dos pruebas aportadas en este estudio. 1) La inducción exitosa de la enfermedad en larvas sanas mediante la inoculación de cualquiera de los cinco macerados de cadáveres larvales portadores de poliedros y la proliferación posterior de estos en los cadáveres resultantes de dichas inoculaciones (Cuadro 3). 2) La hibridación de tres submuestras de ADN de la población de Z. ojedae, localizada en Guachochi, Chihuahua (locus 4, 8 y 12 de la Figura 2) con la sonda DIG-NeabNPVPolh, que indica la presencia de ADN baculovírico en las muestras. Otras larvas de esta población mostraron poliedros en un examen microscópico (muestra 18, Cuadro 1). De acuerdo con esta evidencia, los pequeños cuerpos brillantes observados en los cadáveres de las otras 10 muestras (Cuadro 1) no incluidas en la hibridación, también se interpretaron como poliedros baculovíricos: 4 y 8 (Zadiprion falsus); 7, 14, 15 (Zadiprion spp.); 19, Z. borjai; 16 y 17 (Monoctenus cuauhtemoci; 20 (M. sanchezii) y 22 (Neodiprion autumnalis).

La sonda DIG-NeabNPVPolh se considera altamente específica para detectar el gen de la poliedrina del nucleopoliedrovirus de las moscas sierra, ya que su secuencia, la misma del gen Polh del NeabNPV, solo difiere 5 % de la secuencia homóloga de cualquiera de los otros nucleopoliedrovirus conocidos en Diprionidae; por ejemplo, las de N. lecontei (NeleNPV) y N. sertifer (NeseNPV) (^{Lauzon et al., 2006}). Esa máxima divergencia esperada entre la sonda aquí utilizada y su ADN objetivo no representa un impedimento para la hibridación, como sugiere el uso exitoso de otras sondas en la detección de sus respectivos blancos de ADN con divergencias >20 % (^{Meier-Kolthoff et al., 2014}).

Aspecto de los cadáveres (rictus mortem)

En la literatura, la única descripción encontrada sobre el rictus mortem inducido por baculovirus en estos insectos simplemente indica que las larvas cuelgan de sus patas traseras (^{Dixon, 2019}). Con base en esa descripción y en la experiencia de nuestro grupo de trabajo con infecciones baculovíricas en lepidópteros, al principio de este trabajo se buscaron cadáveres con esa apariencia en campo. Se esperaba que fueran oscuros, aplanados con tejidos internos licuados, tal como se ha descrito para las larvas de lepidópteros que mueren por baculovirus (^{Federici, 1997}). No obstante que se observaron larvas con tejidos internos licuados en tres de las primeras muestras con poliedros, las muestras posteriores mostraron que esa apariencia es la menos frecuente en los dipriónidos muertos por baculovirus. Dos muestras de la misma población de Zadiprion spp. (14 y 15; Cuadro 1 y Figura 4) claramente muestran que la consistencia más común de los cadáveres de Diprionidae con poliedros difiere de la observada en lepidópteros (colgados de las patas traseras, con tejidos licuados y cuerpo aplanados).

La primera de estas muestras, la número 14 (Cuadro 1; Figuras 4A y 4B), consistió en cadáveres encontrados en acículas de ramas bajas de los pinos. Los cadáveres estaban colgados de las patas traseras o bien cayeron de las ramas más altas; sus cuerpos estaban aplanados, de color negro y con consistencia correosa o dura. Solo uno de ellos presentó poliedros abundantes, mientras que los otros 40 mostraron pocos o escasos poliedros. Alrededor del 97 % de los cadáveres de esta muestra presentaron bacilos como microorganismo dominante, por lo que su muerte se atribuyó al bacilo y no al virus, a pesar de la presencia de estos últimos en los cadáveres.

Figura 4 Aspecto de cadáveres de larvas de moscas sierra (Zadiprion spp.) en campo (Unión de San Isidro de Montes de Oca, Sierra de Ixtapa, Guerrero), las cuales portaban poliedros baculovíricos. A y B son los típicos en la muestra 14; C, D y E son los típicos en la muestra 15 del Cuadro 1. Los primeros se encuentran total o parcialmente oscurecidos. Los segundos están oscurecidos solo parcialmente, dependiendo de la abundancia relativa de la microbiota acompañante en los cadáveres. 

Los cadáveres en la muestra 15 (Cuadro 1; Figuras 4C, 4D y 4E) se encontraron en el suelo, al pie de los pinos. Se asume que bajaron caminando por el tronco antes de morir, posiblemente para pupar. Los cuerpos se encontraron secos y duros (no licuados), conservando su forma cilíndrica y, la mayoría de ellos, incluso su color natural (amarillento), mientras que otros mostraron zonas negras en su cuerpo. Debido a que estas características sugieren una muerte por hongos, los primeros 145 cadáveres examinados de esa muestra se colocaron en una cámara húmeda o pequeños trozos de ellos fueron depositados directamente en medios de cultivo PDA. Posteriormente, para los siguientes 42 cadáveres se prepararon frotis de su región abdominal; bajo microscopio óptico se observó que los poliedros dominaban sobre la microbiota concurrente en más de 90 % de ellos (38 de 42) y solo cuatro cadáveres tuvieron cocos y bacilos como microbiota dominante.

Al comparar el aspecto de los cadáveres en las muestras 14 y 15 de Zadiprion spp. y la microbiota acompañante, queda claro que el cuerpo aplanado y el color oscuro observados en la muestra 14 están relacionados con los bacilos y no con el virus. Del mismo modo, el cuerpo duro y cilíndrico de los cadáveres de la muestra 15 se asocia con el virus y no con la microbiota acompañante. Otro dato sugerente de que las larvas de mosca sierra muertas por baculovirus permanecen duras o coriáceas, pero no licuadas, proviene de ^{Lucarotti et al. (2007}), quienes describen la manera en la que conservan y procesan grandes cantidades de larvas de N. abietis muertas por baculovirus para la formulación de un bioinsecticida.

El aspecto licuado de los cadáveres se observó en un individuo de la muestra 4, en 10 de la muestra 7 y en 10 de la muestra 8. El cadáver licuado de la muestra 4 presentó pocos cocos y muchas bacterias y poliedros; mientras que los de las muestras 7 y 8 mostraron pocos poliedros, pero mucha microbiota acompañante (Cuadro 1). Posteriormente, cuando el macerado del cadáver de la muestra 4 se inoculó en larvas sanas, indujo una frecuencia alta de cadáveres con poliedros (17 de 19) y una gran cantidad de poliedros en cada cadáver; mientras que el macerado de la muestra 7 indujo pocos poliedros en un solo cadáver y abundante microbiota acompañante en todas las larvas tratadas (Cuadro 3). Por lo tanto, en los cadáveres que portan poliedros, características como la licuefacción de tejidos, el cuerpo aplanado y obscurecido y el hecho de que cuelguen de las patas traseras, parecen estar asociadas con la presencia, el tipo o la abundancia relativa de la microbiota acompañante, pero no con el baculovirus.

Cuando el baculovirus fue el agente de mortalidad predominante en los cadáveres de moscas sierras, la mayoría de ellos conservó su forma cilíndrica, su cuerpo fue duro y no colgaban de las patas traseras. Este rictus mortem es diferente del inducido por baculovirus en especies de Lepidoptera, los cuales se licuan, se aplanan, se rompen y cuelgan y, comúnmente, cuelgan de sus patas traseras (^{Federichi, 1997}). Las diferencias, muy probablemente, emergen del hecho de que, en diprionidos, solo son atacadas las células del mesenterón (^{Harrison et al., 2018}) dejando el resto de los tejidos intactos (a menos que otros microorganismos los degraden); mientras que en Lepidoptera, casi todos los tejidos son colonizados y licuados por estos virus. Esta descripción del rictus mortem causado por baculovirus en moscas sierra puede ser útil en futuras búsquedas de baculovirus de este tipo de plagas forestales.

Potencial bioinsecticida de baculovirus

Los cinco inóculos analizados mostraron potencial diferenciado como bioinsecticidas. A pesar de que todos ellos produjeron la muerte en todas las larvas tratadas, la identificación del agente causante de la muerte proporciona una primera apreciación del potencial relativo de cada inóculo como bioinsecticida. Los inóculos de las muestras 4 y 14 provocaron la aparición de numerosos poliedros en cada uno de los cadáveres y una proporción elevada de cadáveres con poliedros (17 de 19 y 22 de 22, respectivamente; Cuadro 3), mientras que los de las muestras 7 y 8 provocaron un número reducido de poliedros en cada cadáver y pocos cadáveres con poliedros (1 de 20 y 6 de 20, respectivamente; Cuadro 3).

El inóculo de la muestra 16 provocó la proliferación de poliedros con una frecuencia moderada (33 de 145 larvas; Cuadro 3). Se asumió que las larvas muertas que no mostraban poliedros fueron eliminadas por la microbiota que acompañaba a los virus en los cadáveres de los donantes. Más adelante se analiza la capacidad de provocar la muerte, de al menos parte de la microbiota que acompaña a los baculovirus en las moscas de sierra. No se identificaron especies de la microbiota que acompañaba a los poliedros, pero fue evidente que las hifas fúngicas observadas en los cadáveres de este ensayo no pertenecen a Metarhizum ni a Beauveria.

La abundancia de poliedros en los cadáveres donantes de inóculo de las muestras 4 y 14, por un lado, y 7 y 8, por otro, mantuvo una correspondencia clara con la abundancia de dichos poliedros en los cadáveres resultantes de esta prueba y con la frecuencia de estos cadáveres portando poliedros (Cuadro 3). Esta correspondencia sugiere que los inóculos de las muestras 4 y 14 tienen alto potencial para ser desarrollados como bioinsecticidas debido a su alta infectividad.

El inóculo de la muestra 14 proporcionó también evidencia de tener alto potencial como factor de control natural en el campo donde se recolectó (Unión de San Isidro de Montes de Oca, Sierra de Ixtapa, Guerrero). Debido a que la muestra 15 (Cuadro 1) (no incluida en este ensayo) fue colectada del mismo grupo de pinos que la muestra 14, es razonable asumir que ambas muestras portan la misma cepa viral y que los patógenos encontrados en ellas ejecutaron juntos la escena de buen control de su huésped observada en campo, la cual consistió en eliminar la población huésped antes de la toma de muestras. Dicho control ocurrió muy temprano en el desarrollo de esta infestación, como lo sugiere el aspecto de los cocones pupales encontrados al rascar el suelo y la evidente poca extensión de la infestación. Se estimó que solo dos generaciones de la plaga habrían ocurrido en esa infestación antes de la toma de muestras. Tan temprana eliminación de la población sugiere, claramente, que este inóculo es altamente infectivo en su huésped.

Tanto el propietario del predio donde se colectaron las muestras 14 y 15, como el técnico de la CONAFOR (el funcionario encargado de supervisar la sanidad forestal de la zona) aseguraron que no hubo intervención humana en el desarrollo de esta epizootia. Aunque varios patógenos fueron detectados actuando simultáneamente (virus, bacteria y al menos un hongo), el virus resultó el más frecuente en esta población.

En lo que respecta a los inóculos de las muestras 7, 8 y 16, en una primera percepción, el resultado de este ensayo sugiere que ellos poseen un potencial relativo bajo como bioinsecticidas, debido a que produjeron baja frecuencia de cadáveres con poliedros. Sin embargo, luego de una mirada detallada del resultado de este ensayo se mantiene la expectativa sobre un buen potencial de dichos inóculos como bioinsecticidas, por las razones siguientes: 1) la baja frecuencia de cadáveres con poliedros puede deberse al número reducido de poliedros en los cadáveres donantes; 2) las larvas que recibieron los inóculos 7 u 8 y, la mayoría de las que recibieron el inóculo 16, mostraron abundante microbiota acompañante, pero solo unas cuantas mostraron algunos poliedros sugiriendo capacidad patogénica en dicha microbiota; por lo tanto, 3) inevitablemente, esta microbiota compitió con el virus y pudo desplazarlo, bien por ser más competitiva o más abundante.

Partiendo de esos razonamientos, parece necesario realizar nuevos ensayos para medir adecuadamente el potencial de dichos inóculos, el de la microbiota patógena que los acompaña y la interacción entre ellos. Esa interacción parece muy interesante para el manejo de estas plagas, porque puede implicar sinergias que conviene aprovechar para conseguir un mayor control de la plaga o antagonismos que conviene evitar. En tales nuevos ensayos, sería deseable probar los inóculos virales y la microbiota acompañante, adecuadamente purificados.

Otra precaución razonable sería buscar de manera exhaustiva y evaluar todas las cepas existentes del virus de cada especie de mosca sierra. Dicha evaluación de las cepas debería realizarse en los rodales donde se encuentra su especie hospedadora y la cepa que mejor control proporcione en cada lugar podría utilizarse como medio de control en esas zonas infestadas. De no hacerlo, se corre el riesgo de usar, en algunas zonas, una cepa con menor potencial de control que la residente y, debido a la aplicación inundativa de la cepa exótica menos potente, se desplazaría a la cepa residente con mayor potencial. De este modo, las cepas del virus con potencial superior podrían perderse por no ser descubiertas oportunamente.