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Introducción
Lycaste aromatica (Graham) Lindl. es una orquídea epífita litofítica y ocasionalmente es terrestre, se localiza en los bosques de robles de clima templado, selva tropical de alta elevación y bosques de neblina de selva lluviosa de montaña (Hágsater et al., 2005); se distribuye en los estados de Chiapas y Veracruz, México (Fowlie, 1970). Las orquídeas como L. aromatica (Graham) Lindl. no tienen hojas durante la temporada seca del año, y en los pseudobulbos se realiza la fotosíntesis de tipo metabolismo ácido de las crasuláceas. Estas orquídeas desarrollan nuevas hojas durante la temporada de lluvias y, en condiciones de alta disponibilidad de agua, realizan un metabolismo fotosintético de tipo C3 (Hágsater et al., 2005). Debido a la belleza de la flor y a que emite aroma agradable a canela, es muy apreciada en el mercado veracruzano, pero los ejemplares se obtienen por sustracción ilegal de su hábitat silvestre, por lo que sus poblaciones están amenazadas. En estas circunstancias, en un sendero de 4.5 km en Chocamán, Veracruz, en que se reportaban ejemplares de esta especie, en años recientes no se encontraron individuos (Baltazar et al., 2014); así mismo, L. aromatica (Graham) Lindl. no prolifera en ambientes secundarios como las plantaciones de café (Scheffknecht et al., 2010).
Dentro de la propagación in vitro, el interés en el uso de biorreactores de inmersión temporal ha aumentado durante la última década (Aragón et al., 2014), ya que su uso garantiza un mejor desarrollo de las plántulas en la aclimatación (Aragón et al., 2014; Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu, 2016), en comparación con plantas obtenidas en medio semisólido.
En un protocolo de micropropagación la aclimatación es la etapa final, consiste en la adaptación de las plántulas antes de pasar al invernadero o a un ambiente natural (Rabaiolli et al., 2017). Las plántulas in vitro de orquídeas se desarrollan en condiciones controladas de baja intensidad luminosa, de 36 (Mengarda et al., 2017) a 57 µmol m-2 s-1 (Bello-Bello et al., 2020); alta humedad relativa, de 85 (Dwiyani et al., 2022) a 98 % (Chen, 2004) y bajo intercambio de CO2 y O2; por ésto, sólo un 70 % de plantas micropropagadas de Dendrobium chrysanthum que se establecieron en condiciones de 70-80 % de humedad relativa y sustrato de pedazos de ladrillo, pedazos de carbón y hojarasca en descomposición (1:1:1) sobrevivieron en el periodo de aclimatación (Hajong et al., 2010). Al lograr que las plántulas de orquídeas silvestres se aclimaten exitosamente en invernadero, se recomienda que se establezcan en su hábitat natural para contribuir a la repoblación de individuos.
El sustrato para orquídeas debe proporcionar las condiciones físicas apropiadas, un ejemplo es el sustrato turba-perlita (porosidad total de 93 %, de la cual 20 % es porosidad de aireación y 73 % es porosidad de retención de agua) (Cabrera, 1999), al mismo tiempo que debe garantizar las condiciones químicas y biológicas necesarias para el desarrollo de las plántulas (Macedo et al., 2014). El musgo rubio Sphagnum en su hábitat natural conserva la humedad durante largos periodos, a pesar de estar en sitios escarpados, pues en él crecen abundantes orquídeas (Hágsater et al., 2005). El sustrato de Sphagnum es el más utilizado en la aclimatación de plantas producidas in vitro, debido a que tiene una retención de agua del 85-90 % y una textura esponjosa que evita daños en el sistema radicular de las plántulas (Macedo et al., 2014). El uso de sustrato de Sphagnum en el proceso de aclimatación ha sido reportado en las orquídeas Dendrobium primulinum Lindl. (Pant y Thapa, 2012), Brassavola tuberculata Hook (Macedo et al., 2014), Cattleya guttata, Zygopetalum mackayi (Manhães et al., 2015) y Cattleya walkeriana (Galdiano et al., 2017).
En las orquídeas, para prevenir el ataque de hongos como Rhizoctonia (Seidel y Venturieri 2011) y Fusarium, y así obtener mayor porcentaje de sobrevivencia de plántulas durante la aclimatación, se utilizan fungicidas químicos como Captan 50 Plus® [Captan N-(triclorometiltio) ciclohex-4-en-1,2-dicarboximida] y Ridomil Bravo® 81 {Metalaxil-M: (R)-2-[(2,6-dimetil-fenil)- metoxiacetilamino]-ácido propiónico metil éster} (Srivastava et al., 2018). Venturieri y de Arbieto (2011) reportaron que en plántulas de Phalaenopsis amabilis la supervivencia fue favorecida por el fungicida Manzate 800 ® [Complejo manganeso etileno bis(ditiocarbamato) (polymérico) con sal de zinc]. Srivastava et al. (2015) reportaron un 80 % de supervivencia en plántulas de Aerides ringens (Lindl.)al usar el fungicida Captan [Captan N-(triclorometiltio) ciclohex-4-en-1,2-dicarboximida] y Singh et al. (2021) señalaron un 76 % de supervivencia en plántulas de Satyrium nepalense al usar el fungicida Bavistin (Carbendazim).
Los trabajos sobre la aclimatación de L. aromatica son escasos, por lo que el objetivo de este estudio fue evaluar, durante la etapa de aclimatación, la supervivencia y desarrollo de las plantas producidas in vitro obtenidas de dos diferentes sistemas de propagación (medio de cultivo semisólido y medio de cultivo líquido en biorreactor), y que durante la aclimatación se establecieron en dos sustratos y les fueron aplicados diversos fungicidas.
Materiales y métodos
Material vegetal y medios de cultivo
Plántulas de L. aromatica (Graham) Lindl. de aproximadamente 5-7 cm de longitud, cultivadas in vitro desde que las semillas fueron germinadas en medio de cultivo en laboratorio, utilizando medio de cultivo basado en las sales minerales MS (Murashige y Skoog, 1962), adicionado con 0.5 g L-1 de ácido nicotínico, 0.04 g L-1 de tiamina, 0.1 g L-1 de inositol, 0.002 g L-1 de glicina y 30 g L-1 de sucrosa. De este medio de cultivo se prepararon dos variantes: 1) medio de cultivo semisólido, que después de ajustar el pH a 5.7 se agregaron 2.5 g L-1 de PhytagelTM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) y después de disolverlo se distribuyeron 100 mL en cada frasco de 1000 mL y 2) medio de cultivo líquido en biorreactor de inmersión por gravedad (BIG). Las plántulas se cultivaron in vitro durante 28 semanas expuestas a iluminación de 56 µmol m-2 s-1 en fotoperiodo de 16/8 h luz/oscuridad a 24 ± 1 °C.
Aclimatación de plántulas
Las plántulas se extrajeron de los frascos, se enjuagaron con agua corriente para eliminar el medio de cultivo adherido a las raíces y se establecieron tres de ellas en charola de plástico transparente de 14 × 14 × 9 cm que contenían una capa de 5 cm de espesor de alguno de los dos sustratos: turba (peat moss Premier®) esterilizada en autoclave durante 15 min a 121 °C, o musgo Sphagnum chileno. El total de plantas en cada sustrato se separó en cuatro grupos para aplicarles cada 20 días durante los dos primeros meses el fungicida correspondiente: 1) 1 g L-1 de Captan 50 Plus®, fungicida químico de contacto [Captan N-(triclorometiltio) ciclohex-4-en-1,2-dicarboximida], 2) 1 g L-1 de Ridomil Bravo® 81, fungicida químico y sistémico {Metalaxil-M: (R)-2-[(2,6-dimetil-fenil)- metoxiacetilamino]-ácido propiónico metil éster}, 3) 0.0135 g L-1 de PHC T-22®, fungicida biológico (Trichoderma harzianum, cepa T-22 KRL-AG2), 4) testigo, sin aplicación de fungicida (Cuadro 1).
Cuadro 1 Efecto del sistema de cultivo in vitro en que se obtuvieron las plántulas, el sustrato en que se establecieron y fungicida que se les aplicó en la aclimatación de Lycaste aromatica (Graham) Lindl. a las 28 semanas.
| SCv | Sust | Fung | Supervivencia (%) | Altura (cm) | Número de hojas | Número de brotes | Cltot (mg g-1 peso fresco) |
| MSS | Pm | NA | 66.7 ± 15.2 abc | 5.1 ± 0.9 abc | 1.0 ± 0.4 a | 1.2 ± 0.4 a | 0.2 ± 0.0 cdefg |
| Pm | PHC | 77.8 ± 15.2 ab | 3.6 ± 0.8 c | 1.4 ± 0.3 a | 1.0 ± 0.4 a | 0.1 ± 0.0 efg | |
| Pm | CP | 100.0 ± 15.2 a | 5.3 ± 0.8 abc | 0.9 ± 0.4 a | 0.6 ± 0.4 a | 0.4 ± 0.0 a | |
| Pm | RB | 88.9 ± 15.2 a | 5.4 ± 0.8 abc | 1.3 ± 0.3 a | 0.9 ± 0.4 a | 0.1 ± 0.0 efg | |
| Ms | NA | 100.0 ± 15.2 a | 5.6 ± 0.8 abc | 0.9 ± 0.4 a | 0.9 ± 0.4 a | 0.1 ± 0.0 defg | |
| Ms | PHC | 100.0 ± 15.2 a | 4.5 ± 0.8 bc | 0.9 ± 0.4 a | 1.0 ± 0.4 a | 0.1 ± 0.0 fg | |
| Ms | CP | 88.9 ± 15.2 a | 7.0 ± 0.8 a | 1.0 ± 0.4 a | 1.0 ± 0.4 a | 0.3 ± 0.0 abcd | |
| Ms | RB | 100.0 ± 15.2 a | 5.6 ± 0.8 abc | 0.7 ± 0.4 a | 1.1 ± 0.3 a | 0.2 ± 0.0 bcdefg | |
| BIG | Pm | NA | 31.5 ± 15.2 c | 6.1 ± 0.9 ab | 1.1 ± 0.4 a | 0.6 ± 0.5 a | 0.2 ± 0.0 defg |
| Pm | PHC | 66.7 ± 18.6 abc | 5.1 ± 0.9 abc | 1.2 ± 0.4 a | 1.1 ± 0.4 a | 0.2 ± 0.0 cdefg | |
| Pm | CP | 44.4 ± 15.2 bc | 7.2 ± 0.9 a | 1.1 ± 0.4 a | 0.7 ± 0.5 a | 0.1 ± 0.0 g | |
| Pm | RB | 66.7 ± 15.2 abc | 5.9 ± 0.8 ab | 1.2 ± 0.3 a | 0.5 ± 0.4 a | 0.2 ± 0.0 bcdef | |
| Ms | NA | 100.0 ± 15.2 a | 6.6 ± 0.8 ab | 0.7 ± 0.4 a | 0.3 ± 0.5 a | 0.2 ± 0.0 bcdefg | |
| Ms | PHC | 77.8 ± 15.2 ab | 5.9 ± 0.8 ab | 0.6 ± 0.4 a | 0.3 ± 0.5 a | 0.3 ± 0.0 bcde | |
| Ms | CP | 100.0 ± 15.2 a | 6.4 ± 0.8 ab | 0.4 ± 0.5 a | 0.2 ± 0.5 a | 0.3 ± 0.0 abc | |
| Ms | RB | 100.0 ± 15.2 a | 5.3 ± 0.8 abc | 0.8 ± 0.4 a | 0.4 ± 0.5 a | 0.3 ± 0.0 ab | |
| FV | ANOVA (significancias) | ||||||
| SCv | 0.0364 | 0.0597 | 0.4792 | 0.0401 | 0.1135 | ||
| Sust | 0.0010 | 0.3534 | 0.0513 | 0.4106 | 0.0097 | ||
| Fung | 0.6112 | 0.0404 | 0.9194 | 0.9249 | 0.0001 | ||
| SCv × Sust | 0.0772 | 0.2794 | 0.5558 | 0.2584 | 0.0001 | ||
| SCv × Fung | 0.9651 | 0.6591 | 0.9476 | 0.9145 | 0.0001 | ||
| Sust × Fung | 0.3991 | 0.7806 | 0.9281 | 0.8671 | 0.5566 | ||
| SCv × Sust × Fung | 0.3814 | 0.7033 | 0.7391 | 0.8465 | 0.0005 | ||
FV: fuentes de variación, SCv: sistema de cultivo in vitro, MSS: medio semisólido, BIG: bioreactor de inmersión por gravedad, Sust: sustrato, Fung: fungicida, Cltot: clorofilas totales. Medias ± error estándar. Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). Las significancias en negrita indican diferencias significativas. Pm: peat-moss Premier®, Ms: musgo Sphagnum chileno, NA: no aplicación, PHC: PHC T-22®, CP: Captan Plus®, RB: Ridomil Bravo® 81, Clorofila total a las seis semanas.
Las plantas en charolas fueron transferidas a un invernadero con fluctuación de temperatura de 20 a 37 °C, con una intensidad luminosa de 85 µmol m-2 s-1 y 70 % de humedad relativa de las 8:00 a las 18:00 h. Estas variables ambientales se midieron cada 30 min con un registrador de datos (HOBO U12-012, Onset Computer Corporation, Bourne, Massachusetts, EUA). Las charolas se mantuvieron cubiertas por una estructura cerrada de polietileno transparente durante la primera semana para evitar deshidratación de las plantas durante su aclimatación, y después, el riego fue cada tercer día; posteriormente, las plántulas aclimatadas de L. aromatica se utilizaron en un programa de reintroducción estableciéndose en árboles de Inga sp. (Figura 1) en el bosque mesófilo de Chocamán, Veracruz.
Diseño experimental
Se empleó un diseño experimental completamente al azar en arreglo factorial con tres factores en los tratamientos: sistema de propagación [medio semisólido y medio líquido en biorreactor de inmersión por gravedad (BIG)], sustratos (peat moss Premier® y musgo Sphagnum chileno) y fungicidas [PHC T-22®, Captan Plus® y Ridomil Bravo® 81 y los cuatro testigos sin fungicida, con tres repeticiones (Cuadro 1), resultando un total de 16 tratamientos.
Variables evaluadas
A las 28 semanas después del trasplante y en la estación de invierno se evaluaron: porcentaje de supervivencia, altura de planta (cm), número de hojas y número de brotes. Para extraer y cuantificar las clorofilas totales presentes en las hojas se procedió según Harborne (1998) y se realizó a la sexta semana; utilizando una balanza granataria (ADAM Core® CQT 202, Oxford, Mississippi, EUA) se pesaron 0.25 g de hojas y éstas se picaron finamente utilizando un bisturí; posteriormente, ese material se colocó en tubos de ensayo de vidrio cubiertos con papel aluminio y se añadieron 2.5 mL de acetona 80 % (Fermont®, México), los tubos se almacenaron en oscuridad a 4 °C durante 24 h; después, la muestra se molió totalmente en un mortero, se filtró en papel filtro en un embudo y se aforó a 6.25 mL con acetona 80 %; de esta solución, se tomó una muestra de 2 mL que se colocó en una celda de plástico para leer su absorbancia a 645 y 663 nm en un espectrofotómetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA) utilizando acetona 80 % como blanco. Con los datos de absorbancia se obtuvieron las cantidades de clorofilas totales (mg g-1 peso fresco, PF) de tres repeticiones por tratamiento con la fórmula:
Donde A663 es la absorbancia en la longitud de onda de 663 nm, A645 es la absorbancia en la longitud de onda de 645 nm, V es el volumen aforado (mL) y P es el peso de la muestra (g).
Análisis estadístico
Los datos se sometieron a análisis de varianza y comparación de medias con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). En el caso del porcentaje de sobrevivencia, previo al análisis estadístico se realizó transformación de los datos con la función arcoseno para normalizar su distribución y estabilizar las varianzas. Loas análisis se realizaron con el programa SAS versión 9.3 (SAS Institute, 2011).
Resultados y discusión
Los sistemas de cultivo in vitro (SCv) tuvieron efectos significativos (P = 0.0364) en el porcentaje de sobrevivencia de plantas y en el número de brotes (P = 0.0401). Los sustratos (Sust) tuvieron efectos significativos en el porcentaje de sobrevivencia (P = 0.0010) y clorofilas totales en hojas (P = 0.0097). Los fungicidas (Fung) aplicados tuvieron efectos significativos en altura de planta (P = 0.0404) y en clorofilas totales en hojas (P = 0.0001). Las interacciones SC × Sust y SC × Fung tuvieron efectos significativos (P = 0.0001) en clorofilas totales en hojas. La interacción SC × Sust × Fung tuvo efectos significativos (P = 0.0005) en clorofilas totales en hojas (Cuadro 1).
Los efectos factoriales en la supervivencia de la planta fueron estadísticamente significativos en el sistema de cultivo in vitro (P = 0.0364), donde el mejor sistema fue el medio semisólido (Figura 2A); en el sustrato, en plantas provenientes de ambos sistemas el musgo Sphagnum chileno mostró los valores mayores (Figura 2C). Estas diferencias posiblemente se debieron a que el sustrato de peat moss Premier® se observaba con mayor humedad, lo que provocó la muerte de las raíces y de la planta. Por otra parte, las plantas en los tratamientos con el sustrato de musgo Sphagnum chileno presentaron un mayor porcentaje de supervivencia, porque el sustrato tiene 95-98 % de porosidad total, del cual 85-90 % es capacidad de retención de agua, mientras que el peat moss Premier® tiene un 63 % de porosidad (Macedo et al., 2014).
Figura 2 Plántulas de Lycaste aromatica (Graham) Lindl. A) obtenidas en medio semisólido, B) obtenidas en medio líquido en biorreactor de inmersión por gravedad, C) aclimatada en musgo Sphagnum chileno a las 28 semanas. Barra = 1 cm.
La totalidad de las plántulas obtenidas en ambos sistemas de cultivo in vitro y establecidas en el sustrato musgo Sphagnum chileno sobrevivió, lo que coincide con los experimentos en plántulas de Bletia purpurea (Dutra et al., 2008) y Phalaenopsis amabilis (Venturieri y de Arbieto, 2011) en el sustrato de Sphagnum; sin embargo, 67.7 % de plántulas de Brassavola tuberculata Hook sobrevivieron cuando se establecieron en sustrato Sphagnum (Macedo et al., 2014). Plantas de L. aromatica que se establecieron en el sustrato formado por la mezcla de corteza de pino, carbón de roble y piedra pómez (3:1:1) tuvieron sobrevivencia de 90 % transcurridas 12 semanas (Mata-Rosas et al., 2010), el cual es similar a los valores altos de supervivencia observados en este estudio, aunque la composición del sustrato fue diferente. Por otro lado, las plántulas obtenidas de BIG establecidas en sustrato peat moss Premier® sin fungicida tuvieron 31 % de supervivencia (Figura 2B), pero Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu (2016) reportaron 80 % en Vanilla planifolia propagada en BIG y aclimatada en peat moss Premier®-Agrolita® (1:1). Mathur et al. (2008) registraron un 95 % de establecimiento con Trichoderma harzianum y Piriformospora indica, mientras que con Azospirullum sp. (CIM-azo) el establecimiento fue del 85 %, indicaron que una alta tasa de mortalidad durante la transferencia a condiciones ex vitro se debe a la disfunción estomática, sistemas de raíz débiles y un desarrollo deficiente de la cutícula.
Las plantas obtenidas del sistema de medio semisólido y establecidas en sustrato peat moss Premier® con aplicación de Captan Plus® sobrevivieron al 100 %; sin embargo, Srivastava et al. (2015) no observaron diferencias significativas en los fungicidas con respecto al testigo, aunque las plantas sin aplicación de fungicidas en el sustrato peat moss Premier® sobrevivieron en menor proporción (31 %), sobre todo las plántulas que provenían de BIG; por otro lado, el fungicida biológico PHC T-22® tuvo la misma efectividad que los fungicidas químicos Captan Plus® o Ridomil Bravo® 81 en cuanto a supervivencia durante la aclimatación, lo cual es muy importante porque en futuros estudios se podría usar el control biológico y así evitar el uso de agroquímicos. Venturieri y de Arbieto (2011) reportaron que el 100 % de plántulas de Phalaenopsis amabilis establecidas en musgo Sphagnum sobrevivió con y sin el uso de Manzate 800 ® . Las plantas que se establecieron en sustrato peat moss Premier® con aplicación de fungicida PHC T-22® tuvo sobrevivencia de 77 %, resultados que son consistentes con los reportados por Gutiarrez-Miceli et al. (2008), ya que en la aclimatación de Guarianthe skinnerii el 79 % de plantas sobrevivió cuando se establecieron en mezcla de suelo y agrolita (3:1) inoculada con T. harzianum; sin embargo, Srivastava et al. (2015) reportaron que 80 % de plantas de Aerides ringens (Lindl.) sobrevivió al desinfectar las plántulas con Captan. El uso de fungicidas favorece la supervivencia porque previene el ataque de hongos como Rhizoctonia, que causa marchitamiento (Seidel y Venturieri 2011) y Fusarium (Srivastava et al., 2018).
Se observaron diferencias significativas entre los fungicidas para las variables altura de planta (P = 0.0404) y clorofilas totales en hojas (P = 0.0001). Las plantas más altas fueron las que recibieron Captan Plus®. En el número de hojas no se detectaron diferencias significativas debido a los factores evaluados ni en sus interacciones (P ≥ 0.0512). Los resultados de este experimento confirman los obtenidos por Gutiarrez-Miceli et al. (2008), que estudiaron G. skinnerii sin mostrar diferencias significativas en el número de hojas con o sin la aplicación de T. harzianum. Hwang y Jeong (2007) reportaron que plantas de dos variedades de Phalaenopsis desarrollaron tres hojas cuando se establecieron en musgo Sphagnum; sin embargo, en este estudio las plantas obtenidas en medio semisólido y establecidas en sustrato musgo Sphagnum chileno tuvieron una hoja cuando habían transcurrido 28 semanas. El bajo número de hojas se debe a que L. aromatica (Graham) Lindl. es caducifolia en invierno (Scheffknecht et al., 2010).
En la variable número de brotes se observaron diferencias significativas entre los sistemas de cultivo in vitro, ya que las plantas obtenidas en el sistema de cultivo medio semisólido tuvieron mayor número de brotes pequeños y vigorosos al inicio de la aclimatación en comparación con las plantas obtenidas en el sistema BIG. Bello-Bello et al. (2020) reportaron que, en plántulas de Myrmecophila grandiflora Lindl. bajo aclimatación, obtenidas en dos sistemas de cultivo in vitro, medio de cultivo semi sólido y medio líquido en biorreactor de flujo y reflujo no presentaron diferencias significativas en número de brotes.
En la concentración de clorofila en las hojas se detectó efecto diferente significativo (P = 0.0097) de los sustratos. Las plantas establecidas en Sphagnum chileno tuvieron hojas con la mayor cantidad de clorofila total (0.22 mg g-1 peso fresco), ésto puede ser atribuido a un mejor desarrollo de las plántulas en este sustrato, por su excelente amortiguación de la humedad (Macedo et al., 2014); en fungicidas (P = 0.0001), Captan Plus® produjo los mejores resultados, lo que se puede atribuir a que éste es de contacto; es decir, no ingresa al sistema de la planta, por lo que no modifica su metabolismo; por otro lado, Wigand y Stevenson (1994) reportaron altos contenidos de clorofila a en plantas de Vallisneria americana, a las que se aplicó Captan y fósforo, y lo atribuyeron a que la asociación con micorrizas presentes contribuye a una mayor disponibilidad de nutrimentos para las plantas terrestres, las que aumentan la producción de clorofila. También hubo efecto significativo en las interacciones SCv × Sust (P = 0.0001) en la cantidad de clorofilas totales en hojas (P = 0.0001), mostrando que las plantas obtenidas del sistema BIG establecidas en sustrato musgo Sphagnum chileno representan el mejor tratamiento para la supervivencia de plantas. La interacción SC × Fung fue significativa (P = 0.0001) para el contenido de clorofilas totales en hojas, donde el mejor tratamiento fue el medio semisólido con la aplicación de Captan Plus®. La interacción SC × Sust × Fung tuvo efecto altamente significativo (P = 0.0005) en la clorofila total en hojas, por lo que las plantas obtenidas en sistema de medio semisólido, establecidas en sustrato peat moss Premier® y que recibió el fungicida Captan Plus® sobrevivieron en su totalidad y tuvieron mayor contenido de clorofila total, 0.4 mg g-1 de peso fresco de hoja (Cuadro 1). Los resultados son consistentes con los reportados por Lando et al. (2016), donde las plántulas de Cattleya xanthina tuvieron 0.5 mg de clorofila total g-1 de peso fresco foliar a los 90 días, datos más altos que en L. aromatica (Graham) Lindl. debido a que el incremento en la concentración de clorofila está en función del tiempo. Jeon et al. (2005) mencionaron que en los diversos grupos de plantas de Doritaenopsis el aumento de la concentración de clorofila ocurrió al aplicar 150-200 µmol m-2 s-1 de densidad de flujo de fotones fotosintéticos por inducir las enzimas necesarias para la biosíntesis de la clorofila.
Conclusiones
Los diferentes sistemas de micropropagación, los sustratos en que se establecieron las plantas y los fungicidas que se aplicaron durante la aclimatación de las plantas de L. aromatica (Graham) Lindl. tuvieron efecto sobre la mayoría de variables evaluadas en plántulas, con excepción del número de hojas. Las plantas obtenidas en el medio de cultivo semisólido tuvieron mayor cantidad de sobrevivencia y desarrollaron más brotes durante la aclimatación. Las plantas establecidas en el musgo Sphagnum chileno mostraron la mayor supervivencia y tuvieron más clorofilas totales en hojas. Los diversos fungicidas utilizados tuvieron la misma efectividad en la supervivencia de las plántulas micropropagadas; por lo tanto, se puede utilizar el fungicida biológico PHC T-22® en el protocolo de establecimiento de la orquídea L. aromatica (Graham) Lindl., aunque las plantas a las que se aplicó Captan Plus® mostraron la mayor altura y concentración de clorofila en sus hojas.
