INTRODUCCIÓN

El nitrógeno es el elemento más abundante en la atmósfera del planeta Tierra (78%) y uno de los principales elementos de la célula como integrante de ácidos nucleicos, aminoácidos. Sin embargo, este elemento no es fácilmente accesible para la mayoría de los organismos, debido a que el triple enlace del nitrógeno molecular (N₂) resulta en una molécula poco reactiva. Al nitrógeno elemental que se une a un átomo distinto y que forma compuestos orgánicos o iones como el amonio (NH₄⁺) o nitrato (NO₃^-), se le conoce como nitrógeno reactivo o biológicamente disponible (^{Elser, 2011}; ^{Boyle, 2017}). En la naturaleza, la mayor parte del nitrógeno reactivo se origina mediante procariotas fijadores de nitrógeno atmosférico (diazótrofos) mientras que una pequeña parte es generada por rayos. Sin embargo, actualmente las fuentes antropogénicas de nitrógeno reactivo (combustión de hidrocarburos, desechos de crianza de animales, fertilizantes nitrogenados) exceden las contribuciones naturales, liberando gases de efecto invernadero (óxido nitroso: N₂O, óxido nítrico: NO, dióxido de nitrógeno: NO₂), deteriorando la calidad del agua, la salud y alterando el ciclo global del nitrógeno (^{Ren et al., 2017}; ^{Beeckman et al., 2018}; ^{Scheer et al., 2020}).

En los cuerpos de agua, la presencia de compuestos nitrogenados puede llegar a ser tóxica, conducir a la eutrofización, hipoxia y pérdida del hábitat y de la biodiversidad (^{Ahmed et al., 2017}; ^{Stevens, 2019}). El principal contaminante nitrogenado en los cuerpos de agua es el NH₄⁺ y sus compuestos asociados como son NO₃^- y nitrito (NO₂^-). Para eliminar estos y otros contaminantes, así como el carbono de la materia orgánica, se ha recurrido a procesos físicos, químicos o biológicos, siendo estos últimos los que se emplean preferentemente en las plantas de tratamiento de aguas residuales (^{Karri et al., 2018}). La eliminación biológica de nitrógeno se basa en dos procesos microbiológicos que forman parte del ciclo del nitrógeno: la nitrificación y la desnitrificación. Son llevados a cabo por las bacterias y arqueas, así como por otros grupos microbianos, como algas y hongos desnitrificantes, siendo el grupo de las bacterias el mejor estudiado (^{Ferrera & Sánchez, 2016}; ^{Yin et al., 2018}). A pesar de la amplia diversidad taxonómica y capacidad metabólica de los microorganismos transformadores del nitrógeno (MTN), tradicionalmente se les ha agrupado, por ejemplo, como “nitrificantes” o “desnitrificantes” según el proceso respiratorio principal que realicen para obtener energía, sin tener en cuenta otros procesos metabólicos que puedan efectuar (^{Kuypers et al., 2018}). Para que la eliminación biológica de nitrógeno y otros contaminantes se lleve a cabo a pesar de las variaciones en la composición del influente y otras alteraciones medio ambientales, los microorganismos, de forma individual o en comunidades, deben ser resistentes y resilientes. Deben contar, por ejemplo, con vías metabólicas alternativas que les permitan seguir cumpliendo un proceso o sobrevivir, es decir, deben ser metabólicamente flexibles (^{Kuypers et al., 2018}). La comprensión de la estabilidad funcional de los ecosistemas microbianos y su respuesta ante cambios son temas fundamentales en el estudio y el control de estos sistemas (^{Isobe & Ohte, 2014}). Al conjunto de poblaciones microbianas con sus distintas especies interactuando para realizar una función o un proceso de nuestro interés y que a las poblaciones por separado se les dificulta o no son capaces de realizar, se le llama consorcio microbiano (^{Congestri et al., 2020}; ^{Shahab et al., 2020}). Gracias al avance en la ciencia y en particular al desarrollo de la biología molecular y las ciencias ómicas, como la transcriptómica y genómica, es posible conocer qué tipo de microorganismos y en qué proporción están presentes en un sistema natural o artificial (^{Qin et al., 2018}), en otras palabras, conocer la estructura de las comunidades y asociar un cambio en las comunidades con el cambio en algún parámetro medio ambiental a través del tiempo (^{Ferrera & Sánchez, 2016}; ^{Dangi et al., 2019}). No está de más recordar la sinergia positiva que puede darse entre la ecología, fisiología microbiana y biología molecular, por un lado, para dar respuestas a interrogantes ecológicas, metabólicas, genéticas y evolutivas, y por otro lado, para la ingeniería de los sistemas diseñados y lograr que las comunidades de microorganismos realicen un proceso eficiente, seguro y estable (^{McMahon et al., 2007}; ^{Sharma & Shukla, 2020}; ^{Biswas et al., 2022}).

El objetivo de este trabajo es mostrar evidencia de la diversidad y flexibilidad metabólica de las bacterias y consorcios involucrados en la eliminación de NH₄⁺ y sus compuestos asociados de aguas residuales por los procesos de nitrificación y desnitrificación en ecosistemas artificiales. La información recopilada fue analizada principalmente a través de tres enfoques: ecología, fisiología microbiana y biología molecular, abordando aspectos de formación de comunidades, estabilidad de estas ante cambios del medio, diversidad metabólica y genética de los microorganismos relacionados con los procesos de la nitrificación y desnitrificación.

DISCUSIÓN

Procesos biológicos en el ciclo del nitrógeno. El ciclo del nitrógeno (Figura 1) se compone de los siguientes procesos biológicos: la fijación de N₂, la amonificación, la reducción desasimilatoria de NO₃^- a NH₄⁺ (por sus siglas en inglés DNRA: dissimilatory nitrate reduction to ammonium), la oxidación anaerobia de NH₄⁺ (en inglés anammox: anaerobic ammonium oxidation), la oxidación completa del amoníaco (NH₃) (en inglés comammox: complete ammonia oxidation), la nitrificación y la desnitrificación. La formación de NH₃/NH₄⁺ puede realizarse por la fijación o reducción biológica del N₂, por la mineralización de la materia orgánica, por la DNRA o en menor proporción de manera abiótica a través de rayos (^{Stein & Klotz, 2016}; ^{Takai, 2019}). La fijación biológica del nitrógeno (N₂ → NH₃) es un proceso fundamental en el ciclo del nitrógeno porque genera nitrógeno bioaccesible a partir de una molécula muy poco reactiva. Para combinar N₂ con H₂ y obtener NH₃ se necesitan de 300-400 °C y una presión de ~300 atm, mientras que las bacterias y arqueas diazótrofas con sus nitrogenasas catalizan esta reacción a temperatura y presión ambiental (^{Lee et al., 2014}; ^{Soumare et al., 2020}; ^{Zehr & Capone, 2020}). La amonificación es parte de la mineralización de la materia orgánica que comienza con la ruptura de proteínas a aminoácidos (aminación) y la posterior conversión de los grupos amino (NH₂) a NH₃ (^{Stein & Klotz, 2016}). El proceso de DNRA sirve de vínculo entre la oxidación de compuestos nitrogenados y su reducción, y es un proceso reportado en diversos ambientes anaerobios como suelos, sedimentos de humedales marinos o de estuario y recientemente en la interfaz óxica-anóxica de zona ribereña, así como en sistemas artificiales (^{Wang et al., 2020a}, ^b). El proceso anammox utiliza el NH₄⁺ como donador de electrones y al NO₂^- como aceptor final, con los intermediarios NO e hidrazina (N₂H₄) para formar N₂ (^{Kuenen, 2020}; ^{Weralupitiya et al., 2021}). En el proceso comammox, la nitrificación u oxidación del NH₃ hasta NO₃^-, es efectuada por un solo microorganismo (Nitrospira spp.), a diferencia del proceso nitrificante en el que participan dos grupos bacterianos distintos (^{Daims et al., 2016}; ^{Mehrani et al., 2020}; ^{Zheng et al., 2022}). La nitrificación (Figura 2) es un proceso respiratorio aerobio donde el NH₄⁺ y el NO₂^- sirven como donadores de electrones y el oxígeno (O₂) se emplea como aceptor final de electrones, y canónicamente se le ha atribuido principalmente a dos grupos de bacterias quimiolitoautótrofas filogenéticamente no relacionadas entre sí, donde la parte de la nitritación (NH₄⁺ → hidroxilamina (NH₂OH) → NO₂^-) la llevan a cabo las bacterias amonio oxidantes (AOB) así como arqueas amonio oxidantes (AOA), y la parte de la nitratación (NO₂^- → NO₃^-) las bacterias nitrito oxidantes (NOB) (^{Stein & Klotz, 2016}; ^{Takai, 2019}). El proceso desnitrificante (Figura 2) por su parte comprende una serie de reducciones enzimáticas donde se emplean compuestos orgánicos o inorgánicos como donadores de electrones para reducir el NO₃^- o NO₂^- hasta N₂: NO₃^- → NO₂^- → NO → N₂O → N₂, y ocurre generalmente cuando la concentración de O₂ disuelto es menor que 0.2 mg O₂/L (^{Zumft, 1997}; ^{Seitzinger et al., 2006}; ^{Takai, 2019}).

Figura 1 Ciclo del nitrógeno. N₂: nitrógeno molecular, NH₃: amoníaco, NH₄⁺: amonio, R-NH₂: amina, NH₂OH: hidroxilamina, NO₃^-: nitrato, NO₂^-: nitrito, NO: óxido nítrico, N₂O: óxido nitroso. Comammox: oxidación completa del amoníaco. DNRA: Reducción desasimilatoria del nitrato a amonio. Anammox: oxidación anaerobia del amonio. 

Figura 2 Procesos nitrificante y desnitrificante. AOB: bacterias amonio oxidantes. NOB: bacterias nitrito oxidantes. AMO: amonio monooxigenasa, gen amoA. HAO: hidroxilamina oxidorreductasa, gen hao. NXR: nitrito oxidorreductasa, genes nxrA, nxrB. Nar, Nap: nitrato reductasa, genes narG, napA. NirS, NirK: nitrito reductasa, genes nirS, nirK, cNOR: óxido nítrico reductasa, gen norB. N₂OR: óxido nitroso reductasa, gen nosZ. 

Bacterias nitrificantes. Taxonómicamente las bacterias nitrificantes AOB y NOB se agrupan en el phylum Proteobacteria (clases Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria y Gamaproteobacteria), en cuatro phyla de Deltaproteobacteria y en el caso del género Nitrospira, pertenece al phylum Nitrospirae (^{Waite et al., 2020}). Varios de estos microorganismos especializados poseen una alta diversidad filogenética y metabólica (^{Garrity & Holt, 2015}; ^{Spieck & Bock, 2015}). En plantas de tratamiento de aguas residuales, además de bacterias nitrificantes, se han encontrado AOA, la mayoría de la clase Nitrososphaeria, phylum Thaumarchaeota (^{Kerou et al., 2016}; ^{Xu et al., 2021}) o Thermoproteota (^{Rinke et al., 2021}). Las condiciones ambientales (temperatura, concentración de O₂ disuelto) y características de las aguas residuales (por ejemplo, concentración de NH₄⁺ y materia orgánica) influyen en determinar cuáles grupos son los dominantes tanto en las AOB como en las AOA (^{Lang et al., 2018}; ^{Yin et al., 2018}). La composición en cuanto a microorganismos participantes de una comunidad y la función de esta pueden no estar relacionadas, microorganismos filogenéticamente cercanos pueden presentar diferentes características metabólicas y, por el contrario, la capacidad de oxidar el NH₄⁺ o de reducir NO₃^- a N₂ puede presentarse en microorganismos filogenéticamente distantes. Es por esto que, al abordar el estudio de un grupo de microorganismos en cuanto a caracterización y cuantificación, es preferible hacerlo desde un punto de vista funcional a través de genes marcadores funcionales, cuyas secuencias puedan ser utilizadas para crear cebadores o sondas génicas que puedan presentar una alta especificidad y poder de resolución. De esta forma, sería posible relacionar la presencia de estos genes con características del entorno o función de las poblaciones en una comunidad (^{Petersen et al., 2012}; ^{Ma et al., 2019}; ^{Zheng et al., 2021}). Es posible que los genes de los principales ciclos biogeoquímicos hayan surgido y diseminado por transferencia horizontal o lateral, mientras que las presiones de selección de tipo nutricional o energético hayan promovido su permanencia en los MTN en diferentes entornos (^{Alvarez et al., 2011}; ^{Khadka et al., 2018}; ^{Parsons et al., 2021}).

Enzimas amonio monooxigenasa (AMO, gen amoA) e hidroxilamina oxidorreductasa (HAO, gen hao). En el primer paso del proceso nitrificante (Figura 2), la oxidación de NH₃ → NH₂OH es catalizada por la metaloenzima amonio monooxigenasa (AMO) de 283 kDa (^{Gilch et al., 2009}; ^{Lehnert et al., 2018}). La enzima AMO está ligada a la membrana plasmática y contiene cobre, hierro y zinc, siendo el cobre el elemento clave en la oxidación del NH₃. La AMO bacteriana está formada por las subunidades AmoA, AmoB y AmoC, codificadas respectivamente por los genes amoA, amoB y amoC. Estos genes se presentan en una o múltiples copias, la mayoría agrupados en operones amoCAB (^{Norton et al., 2002}, ²⁰⁰⁸). Otros genes que forman parte del amoCAB son el amoD y el amoE, con proteínas cuya función está aún por determinarse (^{Musiani et al., 2020}). La enzima AMO además de ser clave en el proceso nitrificante es importante porque es capaz de participar en la eliminación de muchos otros compuestos (^{Sayavedra-Soto et al., 2010}; ^{Su et al., 2021}). El sitio activo de la enzima AMO se sitúa en el polipéptido producido por el gen amoA, donde el acetileno, un inhibidor de la AMO, se une de manera irreversible (^{Gilch et al., 2009}). El gen amoA está altamente conservado y puede presentarse en las AOB en varias copias por célula (^{Norton et al., 2002}; ^{Musiani et al., 2020}). Cabe señalar que la enzima AMO es poco conocida a nivel estructural y de procesos (^{Lehnert et al., 2018}). La enzima bacteriana periplásmica hidroxilamina oxidorreductasa (HAO) interviene en el paso NH₂OH → NO₂^- y su gen hao puede ser utilizado también como un marcador molecular alternativo para las AOB (^{Caranto & Lancaster, 2017}). Se debe considerar que el gen hao también está presente en los organismos no amonio oxidantes, incluidas las bacterias oxidantes de metano y otros microorganismos (^{Junier et al., 2010}; ^{Lehnert et al., 2018}). Las AOA codifican distintos genes homólogos a las subunidades de la AMO y se han propuesto genes (amoX, amoY, amoZ) que podrían codificar las subunidades AmoX, AmoY, AmoZ (^{Tolar et al., 2017}; ^{Hodgskiss et al., 2023}). Al no encontrarse un gen homólogo de la hidroxilamina oxidorreductasa (pero sí la presencia de NH₂OH como intermediario), el paso de oxidación del NH₃ a NO₂^- en las AOA no está aún definido (^{Vajrala et al., 2013}; ^{Yin et al., 2018}; ^{Wu et al., 2020}). Las AOA serían un grupo dominante en ambientes con una baja concentración de NH₃, de O₂ disuelto, baja carga orgánica, temperaturas altas o bajas y en aguas residuales salinas (^{Yin et al., 2018}).

Enzima nitrito oxidorreductasa (NXR, genes nxrA, nxrB). El paso de nitratación (Figura 2): NO₂^- → NO₃^-, es llevado a cabo por la enzima nitrito oxidorreductasa (NXR). La enzima NXR consta de tres subunidades codificadas por el gen nxr: alfa (nxrA), beta (nxrB) y gamma (nxrC). La subunidad alfa (NxrA) que se une al sustrato puede encontrarse orientada en dos formas, hacia el citoplasma o al periplasma. La forma orientada hacia el citoplasma se presenta por ejemplo en Nitrobacter y la forma orientada al periplasma en Nitrospira (^{Lücker et al., 2010}). Las NXR citoplásmicas están afiliadas filogenéticamente con las enzimas nitrato reductasas y las formas periplásmicas con la familia de enzimas de unión a cofactores de molibdopterina de tipo II (^{Pester et al., 2014}). Los genes nxrA, y en particular el nxrB, son usados como marcadores genéticos para las NOB, así como para las bacterias de Nitrospira que llevan a cabo la oxidación completa del NH₃ (comammox). El gen nxrB también se presenta en múltiples copias. Por ejemplo, Nitrospira marina Watson et al. 1986 (^{Schoch et al., 2020}) puede contener hasta seis copias. Nitrospira y Nitrobacter son NOB comunes en las plantas de tratamiento de aguas residuales, pero Nitrospira es el género más diverso y abundante en este y muchos otros ambientes (^{Mehrani et al., 2020}; ^{Park et al., 2020}). Nitrospira puede ser dominante en medios con bajas concentraciones de NO₂^- y Nitrobacter en ambientes con altas concentraciones de NO₂^-. Por su importancia ecológica, biotecnológica y su diversidad filogenética y metabólica, es necesario continuar avanzando en el estudio de las NOB (^{Daims et al., 2016}; ^{Vijayan et al., 2021}).

Bacterias desnitrificantes. El proceso desnitrificante (Figura 2) es llevado a cabo por grupos taxonómicos tan diversos como bacterias (proteobacterias, α, β, γ, δ), arqueas (Euryarchaeota, Crenarchaeota) y hongos (^{Lu et al., 2014}; ^{Buratti et al., 2022}). Algunas especies de haloarqueas han mostrado capacidades de desnitrificación, lo que puede indicar un papel determinante en la reducción del NO₃^- a N₂ en suelos o cuerpos de agua salinos tanto naturales como artificiales (^{Torregrosa-Crespo et al., 2017}). Si bien es común la distinción entre “sistemas naturales” y “sistemas artificiales”, esto es sólo por precisión de tema ya que los microorganismos no hacen distinción de un entorno u otro, y así, por ejemplo, pueden hallarse organismos propios del suelo en la composición de las comunidades de los llamados sistemas artificiales (^{Pholchan et al., 2013}; ^{Lang et al., 2018}). En las plantas de tratamiento de aguas residuales, los genes marcadores de la desnitrificación se usan ampliamente en la caracterización de la estructura y dinámica de las comunidades microbianas participantes (^{Lu et al., 2014}; ^{Castellano-Hinojosa et al., 2020}).

Enzima nitrato reductasa (Nar, Nap, genes narG, napA). Con la reducción del NO₃^- inicia el proceso de desnitrificación y la enzima que cataliza la reacción NO₃^- → NO₂^- es la nitrato reductasa (Figura 2). En bacterias, hay dos enzimas reductasas que difieren en localización y propiedades, una orientada hacia el citoplasma (Nar) y la situada del lado del periplasma (Nap). La enzima Nar es una enzima heterotrimérica (NarGHI) que contiene el sitio activo en la subunidad NarG (gen narG) ubicada hacia el citoplasma, la subunidad NarH con la función de transferencia de electrones y la subunidad NarI que sirve de unión a la membrana (^{González et al., 2006}; ^{Kraft et al., 2011}). La enzima Nap es una enzima soluble formada por una subunidad mayor NapA y una menor NapB, donde NapA (gen napA) contiene la actividad catalítica, mientras que NapB es esencial en la transferencia de electrones a NapA. Además, puede presentarse la proteína NapC integrada en la membrana, la cual libera electrones a NapB. El orden y presencia de los genes del operón nap es variable dependiendo de la especie, así por ejemplo puede haber expresión de NapABCGH entre otras combinaciones. Un microorganismo puede presentar el gen narG o napA (y sus enzimas correspondientes), o los dos genes. Estas y otras nitrato reductasas son molibdeno dependientes (^{González et al., 2006}; ^{Asamoto et al., 2021}). Es probable que en ambientes con alto contenido en NO₃^- la enzima Nar sea más eficiente, pero con una baja afinidad, mientras que la enzima Nap con mayor afinidad, pero menos eficiente, se presentaría preferentemente en entornos donde el NO₃^- es limitado (^{Pérez-Rodríguez et al., 2013}; ^{Asamoto et al., 2021}). El O₂ puede inhibir a la enzima Nar (sensible a este gas), o bien inhibir la actividad de los transportadores de NO₃^- al interior de la célula. La enzima Nap en cambio se considera que no es afectada por el O₂ y no requiere un transporte de NO₃^- ya que se sitúa en el espacio periplásmico. Ambos genes, narG y napA, pueden emplearse como marcadores genéticos (^{Ma et al., 2019}), aunque el gen napA puede ser particularmente útil en identificar desnitrificantes aerobio tolerantes (^{Zhao et al., 2018}).

Enzima nitrito reductasa (NirS, NirK, genes nirS, nirK). En el proceso desnitrificante (Figura 2), la reducción de NO₂^- a NO puede catalizarse por dos enzimas periplásmicas que tienen funciones homólogas, pero distinta estructura, la enzima NirK que contiene cobre y es codificada por el gen nirK, y la enzima NirS (citocromo cd₁) que contiene hierro y tiene por origen al gen nirS. Generalmente, en un microorganismo, se presenta el gen nirK o el nirS, aunque hay excepciones, es decir, especies desnitrificantes que pueden presentar ambos genes (^{Wittorf et al., 2018}). La enzima NirK tiene dos centros Cu, uno perteneciente a la subclase de proteínas con Cu de tipo I y el otro de tipo II, siendo en este último donde se produce la unión del sustrato (^{Rinaldo & Cutruzzolà, 2007}). La presencia de Cu puede ser un elemento clave en determinar los niveles de expresión del gen nirK. En el caso de NirS, el sitio activo es d₁ y la síntesis de la enzima puede depender de la presencia de NO₃^- (^{Wittorf et al., 2018}). Ambos genes se han utilizado como marcadores moleculares y se han encontrado en diversos grupos bacterianos (Proteobacteria, Nitrospirae, Actinobacteria, entre otros filos) así como en Archaea (^{Wei et al., 2015}; ^{Ma et al., 2019}; ^{Miralles-Robledillo et al., 2021}).

Enzima óxido nítrico reductasa (cNOR, gen norB). La enzima óxido nítrico reductasa (NOR) que cataliza la reducción del NO a N₂O, es una enzima oxidasa con hierro, localizada en la membrana. En bacterias desnitrificantes comúnmente se encuentra en la forma cNOR (“complejo NorBC”), un dímero formado por las subunidades NorB que contiene el sitio activo y NorC, que son codificadas por los genes norB y norC, respectivamente (^{Matsumoto et al., 2012}; ^{Shiro, 2012}). Esta forma acepta electrones del citocromo c o de la azurina. La enzima qNOR de subunidad única (gen qnor, qnorB o norZ) es otra forma de la enzima NOR presente en bacterias, arqueas y microorganismos no desnitrificantes en los cuales la función de NOR se relaciona con la detoxificación del citotóxico NO. Otra forma de la enzima NOR reportada en el género Bacillus es la Cu_ANor, con el citocromo c551 como donador de electrones (^{Torregrosa-Crespo et al., 2017}). El NO es un gas que puede contribuir a generar o ser sumidero de ozono y la oxidación del NO resulta en ácido nítrico, componente de la lluvia ácida (^{Pilegaard, 2013}). Los genes norB y qnor se han empleado para detectar desnitrificantes óxido nítrico reductores en diferentes ambientes (^{Torregrosa-Crespo et al., 2017}; ^{Ma et al., 2019}; ^{Castellano-Hinojosa et al., 2020}).

Enzima óxido nitroso reductasa (N₂OR, gen nosZ). El último paso en el proceso desnitrificante corresponde a la reducción del N₂O a N₂ (Figura 2) y es catalizado por la enzima óxido nitroso reductasa (N₂OR) (^{Jones et al., 2013}). El gen nosZ codifica la subunidad catalítica. Se han identificado dos tipos de enzimas que realizan este paso. La llamada N₂OR clado I es una metaloenzima periplásmica que contiene múltiples átomos de cobre, con dos dominios, un centro de transferencia de electrones (CuA) y un centro catalítico (CuZ). El gen nosZ se presenta en el grupo de genes nos comúnmente en el arreglo nosRZDFYL (el gen nosX puede presentarse antes o después). Los otros genes de este conjunto están implicados por ejemplo en la regulación de la expresión y maduración de la enzima N₂OR (^{Carreira et al., 2017}). La enzima N₂OR clado II difiere en que está asociada probablemente a la membrana y tiene un dominio adicional hemo C en el extremo C terminal. El gen nosZ forma parte del arreglo nosCZ-ORF-nosDYF-ORF, y los genes nosX y nosR no se presentan. Aparte del dominio bacteria, las arqueas también pueden presentar estos tipos de enzimas (^{Ma et al., 2019}; ^{Keeley et al., 2020}). Debido a la modularidad del proceso desnitrificante, puede no presentarse el gen nosZ en una población microbiana, de forma que se libere el gas N₂O de efecto invernadero, o por el contrario una población puede expresar la enzima N₂OR, y la comunidad de la cual forma parte puede tener la capacidad de eliminar el N₂O del entorno. El gen nosZ se ha empleado como marcador en diversos estudios a fin de identificar los grupos capaces de reducir el N₂O a N₂ bajo diferentes condiciones ambientales (^{Conthe et al., 2019}; ^{Castellano-Hinojosa et al., 2020}; ^{Bernabeu et al., 2021}). Cabe mencionar que es posible que se presente más de una copia de algunos de los genes desnitrificantes mencionados en un mismo microorganismo o cepa. Se han encontrado copias múltiples del nirS en el genoma de especies del género Thauera (^{Wang et al., 2020c}).

Diversidad y flexibilidad metabólica de bacterias nitrificantes y desnitrificantes. La ubicuidad, abundancia, diversidad taxonómica y metabólica del dominio bacteria es enorme. Se ha estimado que pueden existir en nuestro planeta de millones a miles de millones de especies del dominio bacteria y arqueas (^{Pallen et al., 2021}), de los cuales solo 150000 genomas han sido secuenciados y almacenados en Genome Taxonomy Database. Sin embargo, de ellos el 40% carece de una asignación taxonómica específica (^{Parks et al., 2020}). La cantidad de secuencias que esperan ser clasificadas continúa en aumento día a día (^{Overmann et al., 2019}; ^{Pallen et al., 2021}). Otro problema asociado con esta diversidad es que no existe un concepto de especie para procariotas que sea ampliamente aceptado. Siendo microorganismos asexuales y con un habitual intercambio horizontal de material genético, puede resultar en una imprecisión al tratar de distinguir una especie de otra. Se ha optado por una solución pragmática y más bien dirigida a especies cultivables, con hibridación DNA-DNA del 70% como límite entre especies (^{Gevers et al., 2005}; ^{Doolittle & Rapke, 2006}) o por la propuesta enfocada a los microorganismos no cultivables con el promedio de similitudes de nucleótidos (ANI: average nucleotide similarities) entre genomas, donde un ANI < 90% es un criterio para distinguir poblaciones coexistentes (^{Doolittle & Rapke, 2006}; ^{Overmann et al., 2019}; ^{Parks et al., 2020}). Teniendo en cuenta la búsqueda de orden mediante la categorización de la gran diversidad microbiana, se comprende que la clasificación de los microorganismos de acuerdo con un solo proceso (“fijador de nitrógeno”, “nitrificante”, “desnitrificante”) haya sido desde un inicio artificial y no refleje completamente la diversidad y versatilidad metabólica de los MTN (^{Stein & Klotz, 2016}; ^{Kuypers et al., 2018}).

La Tabla 1 presenta ejemplos de la diversidad y versatilidad metabólica de algunas bacterias nitrificantes y desnitrificantes clasificadas tradicionalmente de acuerdo con un proceso respiratorio único. Por ejemplo, la bacteria Nitrosomonas europaea Winogradsky 1892 (^{Schoch et al., 2020}) se ha clasificado como un quimiolitoautótrofo obligado que obtiene energía para su crecimiento de la oxidación del NH₃ a NO₂^- en presencia de O₂ y que cubre su necesidad de carbono mediante la fijación de dióxido de carbono (CO₂). Sin embargo, N. europaea puede consumir y crecer con sustratos orgánicos como fructosa y piruvato usados como únicas fuentes de carbono, si bien sigue necesitando el NH₃ como fuente de energía (^{Chain et al., 2003}; ^{Hommes et al., 2003}). Otras AOB también han sido reportadas como capaces de utilizar la vía heterotrófica utilizando sustratos orgánicos como fuentes de carbono para su crecimiento (^{Kjeldal et al., 2014}). Además, en N. europaea, una representante típica de las bacterias amonio oxidantes, se han encontrado secuencias homólogas de los genes nirK y norB y sus enzimas correspondientes. Esto le permite realizar parte del proceso desnitrificante en ambientes con bajas concentraciones de O₂ y altas en NO₂^-. Puede decirse que N. europaea es también una bacteria desnitrificante (^{Schmidt, 2004}; ^{Yu & Chandran, 2010}). Nitrobacter hamburgensis Bock et al. 2001 cepa X14 (^{Schoch et al., 2020}) (Tabla 1) es una bacteria que obtiene su energía de la oxidación del NO₂^- y el carbono del CO₂, pero también es capaz de tener un crecimiento mixotrófico con NO₂^- y D-lactato como fuentes de energía, nitrógeno y carbono, o un crecimiento organotrófico sin NO₂^-, pero con NH₃/NH₄⁺ como fuente de nitrógeno y con D-lactato como fuente de energía y carbono (^{Starkenburg et al., 2008a}, ^b). Si bien el lactato se asimila y metaboliza hasta CO₂, se requiere la exposición al CO₂ atmosférico o la adición de carbonato de sodio tanto en el crecimiento mixotrófico como en el organotrófico, en este último caso a fin de obtener un crecimiento óptimo. Otros Nitrobacter como N. agilis (actualmente N. winogradsky Winslow et al. 1917) y N. vulgaris Bock et al. 2001 también tienen la capacidad de crecimiento quimioorganotrófico (^{Bock, 1976}; ^{Bock et al., 1990}; ^{Schoch et al., 2020}). Es posible que la utilización de compuestos orgánicos sea una estrategia empleada para complementar requerimientos energéticos ya que el NO₂^- es un sustrato energéticamente pobre (^{Starkenburg et al., 2008a}). La ubicuidad de los nitrificantes en diversos sistemas se podría explicar en parte por la capacidad de emplear como donadores de electrones tanto compuestos específicos como compuestos orgánicos (^{Bock, 1976}). Acinetobacter sp. ND7, Pseudomonas stutzeri (Lehmann & Neuman 1896) (actualmente Stutzerimonas stutzeri) cepa UFV5 y Vibrio diabolicus Raguns et al. 1997 cepa SF16 (^{Schoch et al., 2020}) (Tabla 1) son cepas bacterianas que han sido reportadas como capaces de realizar el proceso de nitrificación heterotrófica y desnitrificación en condiciones aerobias (proceso HN-AD). Es decir, que en condiciones aerobias y utilizando compuestos orgánicos como fuente de carbono y electrones, estas bacterias tienen la capacidad de eliminar N-NH₄⁺, donde una parte de estos compuestos puede ser asimilada y otra puede ser liberada como N₂, y como CO₂ respectivamente. Acinetobacter sp. ND7 es una cepa que elimina eficientemente NH₄⁺, NO₂^- y NO₃^- respectivamente o en combinación: NH₄⁺ y NO₃^-, como fuentes de nitrógeno y con acetato como fuente de carbono. Otras fuentes con las que ND7 es capaz de eliminar nitrógeno eficientemente son el succinato o el citrato (^{Xia et al., 2020}). Es necesaria la presencia de una fuente de carbono orgánico para que se realice la eliminación de NH₄⁺. En el balance de nitrógeno (NH₄⁺ y acetato como sustratos iniciales), el 56.5% del N-NH₄⁺ inicial se convirtió en N₂, el 40.9% se incorporó en biomasa y 2.1% en intermediarios. Los genes clave que se presentan en esta cepa y cuyas enzimas intervienen en el proceso HN-AD son: hao; importante en el proceso nitrificante heterotrófico, nap; interviene en la reducción del NO₃^- en condiciones aerobias, y nirS; amplificado con frecuencia de bacterias desnitrificantes aerobias (^{Zhao et al., 2018}). P. stutzeri UFV5 es capaz de eliminar el NH₄⁺ de forma eficiente cuando se emplean fuentes de carbono (relación C/N: 6-12, salinidad de 0-3%) como piruvato o citrato entre otros compuestos que forman parte del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. A través del balance de nitrógeno empleando citrato, se calcula que 47% del N-NH₄⁺ se incorpora en biomasa y 53% puede convertirse en N₂. Los compuestos NH₂OH, NO₂^- y NO₃^- productos de la nitrificación, las enzimas AMO, HAO y sus genes amoA y haoF no se detectaron en la cepa UFV5, probablemente debido a que participan enzimas y genes distintos a los involucrados en la nitrificación autotrófica (^{Silva et al., 2020}). En cambio, las enzimas y los genes de la desnitrificación anaerobia sí se encontraron presentes. En el proceso HN-AD, el NH₄⁺ no se emplea como fuente de electrones para generar energía, y se considera que su eliminación posiblemente sea una forma de retirar un compuesto que es percibido como tóxico por P. stutzeri UFV5 (^{Silva et al., 2020}). V. diabolicus SF16 es una bacteria halófila con la capacidad de eliminar eficientemente NH₄⁺ y NO₃^- respectivamente con 1-5% de salinidad y con acetato como fuente de carbono. Puede usar de igual forma otras fuentes de carbono como citrato, glucosa o sacarosa (^{Duan et al., 2015}). A través de un balance de nitrógeno (3% de salinidad), se calcula que 35.8% de N-NH₄⁺ se incorpora en biomasa, 53.9% puede liberarse como N₂ y 0.2% como NO₂^- y NO₃^-. La cepa SF16 presenta el gen napA. En los tres casos mencionados de las bacterias que realizan el proceso HN-AD, la eliminación del NH₄⁺ está asociada al crecimiento bacteriano. En el balance de nitrógeno, más de la mitad del N-NH₄⁺ se libera como N₂ y menos de la mitad se incorpora en biomasa, lo que resulta conveniente si se considera al bajo volumen de lodos que se pudieran producir. Así también la diversidad en sustratos, vías metabólicas y condiciones que pueden tolerar (por ejemplo, en cuanto a salinidad) vuelve a estos microorganismos un grupo de interés por su posible uso en el tratamiento de aguas residuales (^{Duan et al., 2015}; ^{Silva et al., 2020}; ^{Xia et al., 2020}).

Otro ejemplo de diversidad metabólica recientemente descubierta en MTN es la capacidad de Candidatus Nitrospira inopinata ^{Daims et al. 2015} (^{Oren et al., 2020}; ^{Schoch et al., 2020}) (Tabla 1) para realizar el proceso nitrificante de forma completa (NH₄⁺ → NO₃^-) en condiciones aerobias. Ca. N. inopinata posee una alta afinidad por NH₄⁺, un alto rendimiento de crecimiento en comparación con los nitrificantes canónicos y una tasa máxima de oxidación de NH₄⁺ relativamente baja. Lo anterior sugiere que Ca. N. inopinata es un organismo propio de ambientes oligotróficos donde presenta un lento crecimiento. Ca. N. inopinata posee homólogos de las enzimas AMO y HAO propias de la oxidación del NH₄⁺ de las AOB y la enzima NXR que oxida el NO₂^- en las NOB (^{Daims et al., 2015}; ^{Kits et al., 2017}).

Los ejemplos previamente descritos ilustran que existe una amplia gama de combinaciones funcionales que pueden presentarse en los MTN, que tiene explicación en el conjunto de genes y su regulación, las relaciones que se establecen entre los microorganismos de una comunidad, así como la necesidad de supervivencia y desarrollo en una gran variedad de ambientes (^{Stein & Klotz, 2016}; ^{Kuypers et al., 2018}). Sin embargo, hacen falta más estudios dirigidos a la fisiología, metabolismo, ecología y genética de los MTN para poder entender, controlar y emplear de forma eficiente su actividad a fin de obtener procesos biológicos óptimos o alternativos en la eliminación de nitrógeno en el tratamiento de aguas residuales.

Ecología de comunidades. Una comunidad es un conjunto formado por distintas especies, donde los organismos viven e interactúan entre sí y su entorno en un área específica. Esta organización compleja multiespecífica se presenta en una gran diversidad de ambientes y funciones, estas últimas relacionadas por ejemplo con la agricultura, industria, salud humana y ciclos biogeoquímicos. Al formarse una comunidad, esta puede adquirir comportamientos y características propias (propiedades intrínsecas) que no son identificables en los individuos participantes y que no surgen de la simple adición de las características de sus integrantes (^{Konopka, 2009}; ^{Fierer et al., 2012}; ^{Madsen et al., 2018}; ^{Trego et al., 2021}). En una comunidad microbiana, las diferentes especies se presentan en proporciones relativas y los distintos microorganismos contribuyen con su genoma a dotarla de una diversidad metabólica. Hay poblaciones microbianas que constituyen la parte activa de la comunidad, y el cambio en la riqueza o diversidad de estas poblaciones clave puede alterar la función de esta (^{Brenner et al., 2008}; ^{Johnson et al., 2015}; ^{Goldford et al., 2018}). Si bien la diversidad de especies no asegura la integridad y permanencia de la comunidad, sí posibilita en general un mejor desempeño ante cambios ambientales y nutricionales (^{Brenner et al., 2008}; ^{Awolusi et al., 2015}; ^{Widder et al., 2016}). Las comunidades microbianas son sistemas dinámicos con la capacidad inherente de soportar perturbaciones, es decir de ser estables por ejemplo ante eventos repentinos que puedan modificar su función (^{Arnoldi et al., 2019}). Las interacciones entre los miembros son fundamentales en la formación, estabilidad y funcionamiento de la comunidad. Estas interacciones son variadas y comprenden: interacciones a nivel trófico; competencia por recursos; metabólicas (sintrofía, bienes públicos); de señalización (quorum sensing); estructurales físicas o metabólicas (biopelículas, flóculos, gránulos) y de intercambio de material genético (transferencia horizontal de genes) (^{Brockhurst et al., 2008}; ^{Konopka, 2009}; ^{Widder et al., 2016}; ^{Madsen et al., 2018}). Los consorcios microbianos en forma de flóculos, gránulos y biopelículas son las comunidades más frecuentes en los sistemas empleados en la eliminación de contaminantes de aguas residuales. Para la formación y permanencia de estas comunidades, se requiere entre sus participantes comunicación, interacción y coordinación (comportamiento colectivo coordinado). La proximidad espacial de los taxones en estos bioagregados multitróficos posibilita una mejor comunicación entre los microorganismos a través de moléculas autoinductoras, así como el montaje de una respuesta por parte de la comunidad. La diversidad y flexibilidad metabólica de los taxones explicaría por qué el consumo de metabolitos, la eliminación de contaminantes y agentes antimicrobianos muestran ser más eficientes en consorcios que en los microorganismos planctónicos o de vida libre (^{Flemming et al., 2016}; ^{Maddela et al., 2019}; ^{Cai, 2020}; ^{Trego et al., 2021}). De esta forma, si en una comunidad algunos microorganismos presentan solo partes de vías metabólicas, los pasos faltantes o vías complementarias pueden estar en organismos próximos, como en el caso de los procesos nitrificante y desnitrificante que se efectúan en gránulos donde las poblaciones pueden localizarse en la estructura de estos de acuerdo con la disponibilidad de nutrientes y O₂ (^{Cordero & Datta, 2016}; ^{Di Capua et al., 2022}).

Conclusiones. Los procesos microbiológicos de nitrificación y desnitrificación forman parte del ciclo del nitrógeno y acoplados tienen la función de regresar el nitrógeno de compuestos como el NH₄⁺ a la atmósfera en forma de N₂. Los organismos involucrados en estos procesos se utilizan en los sistemas artificiales de tratamiento de aguas residuales. Lo que se conoce de su metabolismo y fisiología se basa en estudios realizados en unos cuantos microorganismos cultivables. Sin embargo, se debe tener en cuenta que estos microorganismos pueden estar presentes en ambientes muy diversos y que la cantidad de taxones que aún quedan por descubrirse es enorme. En el futuro y con la ayuda de la bioinformática y las ciencias “ómicas”, la extensa diversidad metabólica de bacterias, arqueas y otros MTN será mejor comprendida. La información contenida en esta revisión destaca que un organismo identificado como nitrificante o desnitrificante puede tener la capacidad de acuerdo con su genoma y condiciones del entorno, de efectuar otros procesos y funciones. Los genes funcionales que codifican las principales enzimas de los procesos de la nitrificación y desnitrificación se presentan en diversos taxones y a través de su empleo como genes marcadores, es posible caracterizar y cuantificar un grupo de organismos con una función común. Es conveniente que el análisis de la transcripción y traducción de los genes funcionales sea incluido de manera más amplia en los estudios de los consorcios usados en el tratamiento de aguas residuales. Esto permitirá relacionar las diferentes condiciones ambientales y nutricionales con los genes y su grado de expresión para la síntesis de sus correspondientes enzimas, ampliando el conocimiento de la capacidad y flexibilidad metabólica de los consorcios. Las poblaciones en general y en este caso las nitrificantes y desnitrificantes pueden reunirse para formar una comunidad o consorcio donde cada componente aporta diversidad genética y taxonómica. Estos consorcios ubicuos en sistemas naturales y artificiales comúnmente presentan capacidades mejores o distintas de las que presentan las especies participantes de manera individual y pueden contribuir a una eliminación más eficiente y estable de contaminantes del agua, como NH₄⁺.