Introducción

Hay un esfuerzo para usar microorganismos benéficos y promover el crecimiento de las plantas para reducir el uso intenso de agroquímicos y contribuir a la expansión de prácticas agrícolas sostenibles (^{Vassilev et al., 2001}., ^{Cappellari et al., 2013}). Los tres grupos principales de microorganismos: hongos micorrízicos, hongos que promueven el crecimiento de las plantas y las rizobacterias, se consideran beneficiosos para el crecimiento de las plantas (^{Harman et al., 2004}; ^{Malusá et al, 2012}). Los hongos micorrízicos incluyen micorrizas arbusculares y ectomicorrizas de múltiples clados fúngicos, como la Glomeromycota, Ascomycota y Basidiomycota (^{Kuo et al., 2014}). Los hongos promotores del crecimiento de plantas libre incluyen especies de los géneros Trichoderma, Aspergillus y Phoma (^{Harman et al., 2004}; ^{Salas, 2011}). Las rizobacterias promotores del crecimiento de las plantas comprenden los géneros Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella y Pseudomonas, y algunos endofitos como Axoarcus, Gluconacetobacter y Herbaspirillum (^{Siddiqui, 2006}). La acción de los microorganismos promotores del crecimiento de las plantas (PGPM) se estudió intensamente en la década reciente; el aumento de la biomasa y la producción de frutas de diversas especies cultivadas, debido a efectos directos e indirectos de los microorganismos se documentó (^{Gupta et al., 2000}; ^{Saharan and Nehra, 2011}). Los efectos directos más comunes son la fijación de N, la solubilización del fosfato, la producción de sideróforo y fitohormonas, y los efectos indirectos incluyen la inducción de la resistencia de las plantas huésped y el antagonismo contra el fitopatógeno (^{Martínez-Viveros et al., 2010}; ^{Ahemad y Kibret, 2014}).

Aunque la inoculación de plantas con PGPM se realiza comercialmente en la agricultura, la formulación del inóculo con un efecto confiable y consistente en condiciones de campo es todavía problemática (^{Malusá et al., 2012}). La formulación exitosa de PGPM debe superar temperaturas humedad, salinidad y radiación UV, y estrés hídrico pH del suelo desfavorables (^{García et al., 2011}). Un aspecto clave de la tecnología de inoculación exitosa es evitar la pérdida de actividad de PGPM mediante la formulación adecuada del inóculo y la selección de un portador apropiado (^{Malusá et al., 2012}). El portador ayuda a suministrar la cantidad adecuada de microorganismos en buenas condiciones fisiológicas, lo que puede proporcionar un microambiente adecuado y asegurar la suficiente vida útil. Entre los materiales naturales utilizados como portadores, los polímeros orgánicos se utilizan ampliamente (^{Bashan et al., 2002}, ^{Yabur et al., 2007}). Los polímeros orgánicos son compuestos que se reticulan formando una matriz, que temporalmente encapsula o inmoviliza microorganismos y luego se liberan gradualmente, durante la degradación del polímero (^{Malusá et al., 2012}). La encapsulación con polímeros ofrece protección contra el estrés ambiental y, en consecuencia, aumenta la supervivencia y liberación de microorganismos en el suelo o en la semilla (^{Guo et al., 2012}). Los materiales usados para la encapsulación en polímeros deberían ser económicos y disponibles, como la carboximetilcelulosa, la goma de guar, la goma de xantano, el alginato y el almidón (^{Bhardwaj et al., 2000}; ^{Hernández et al., 2011}).

El efecto de la encapsulación basada en polímeros sobre el rendimiento de PGPM se ha evaluado. Pero no hay un análisis sistemático del rendimiento de estos microorganismos cuando se encapsulan en una matriz con polímeros. En este contexto, el presente meta-análisis aborda las siguientes preguntas: 1) ¿la encapsulación basada en polímeros mejora el rendimiento de los microorganismos? 2) ¿es la respuesta de la encapsulación basada en polímeros de PGPM similar para todas las especies de plantas? 3) ¿cuáles son las estructuras vegetales más influenciadas cuando las plantas se inoculan con PGPM encapsulado basado en polímeros? 4) ¿el endurecedor o la concentración de goma del polímero influye en el rendimiento del PGPM encapsulado?

Materiales y Métodos

Recopilación de datos y criterios de inclusión

Una búsqueda electrónica se realizó de noviembre de 2013 a febrero de 2014. Los artículos relevantes publicados se recuperaron mediante búsquedas en Google Scholar y revistas de primer nivel evaluadas por colegas e indexadas en: Only Library, Science Direct, Springer Journal, Taylor & Francis y Wiley Online Library. Para buscar estudios se usaron las siguientes combinaciones de palabras clave: “microcápsulas”, “cápsulas”, “microorganismos”, “crecimiento”, “promoción”, “germinación” “bacterias”, “planta”, “alginato de sodio” “antagonista” y “hongos”.

En la búsqueda bibliográfica se recuperaron todos los estudios científicos relevantes que reportan la efectividad del uso de agentes microencapsulados en PGPM para una amplia variedad de cultivos. Aproximadamente se examinaron 117 referencias con base en el título, resúmenes y palabras clave dentro de la primera etapa de evaluación de este estudio. Un subconjunto de 91 informes irrelevantes se excluyó y se identificaron 26 artículos potenciales para cumplir con los criterios de elegibilidad: 1) los estudios tenían que cuantificar los efectos de PGPM encapsulada y no encapsulada basada en polímeros en la germinación de las semillas o en las variables de crecimiento de las plantas (área foliar, biomasa de hojas, biomasa de raíces, biomasa de brotes, biomasa total, número de hojas, longitud de raíces y de brotes); 2) los estudios tenían que incluir entre sus tratamientos la PGPM encapsulada y no encapsulada basada en polímeros y esta última se usó como control; 3) los estudios tuvieron que usar polímeros naturales como gomas para encapsular microorganismos; 4) los estudios tenían que presentarse en inglés y publicarse en la literatura revisada por expertos. Se obtuvieron 11 artículos publicados entre 2002 y 2012 que cumplieron con estos criterios (Cuadro 1, Anexo A), y de ellos seleccionamos 41 casos para evaluar con por el meta-análisis.

Cuadro 1 Visión general de las fuentes de datos. Procesos de la planta: SG = germinación de semillas; PG = Crecimiento de la planta. Estructura de crecimiento de la planta; LA = área foliar; LB = Biomasa de las hojas; LN = Número de johas; SB = Biomassa de los brotes; SL = Longitud de los brotes; RL = Longitud de la raíz; RB = biomassa de la raíz; TB = Biomassa total. 

Resultados y Discusión

La respuesta general de PGPM a la encapsulación basada en polímeros fue positiva [E ++ (tamaño de los efectos medios) = 0.8700; 95 % Bias CI (intervalo de confianza) = 0.02171 a 1.5178], aunque hubo clara diferencia entre las especies de microorganismos (df=11, Q=22.6, p=0.01). El hongo Trichoderma harzianum mostró efecto negativo, y las bacterias Rhodanobacter sp., Anthrobacter sp. y Azospirillum brasilense corrig. ^{Tarrand et al, (1978)} no tuvieron respuesta a la encapsulación basada en polímeros (Figura 1).

Figura 1 Promedio de los tamaños de efecto de Hedges (±95% de los intervalos de confianza corregidos por sesgo), tamaños de muestra y números de seguridad (n_fs) para los estudios que comparan PGPM encapsulado en base a polímero frente a PGPM no encapsulado. Los patrones significativos ocurren cuando los intervalos no incluyen cero, que está marcado con una línea punteada. Las especies de microorganismos en negrita indican que el número de seguridad es elevado (>5 n + 10). 

Los efectos de PGPM encapsulado basado en polímeros en varias especies de plantas mostraron tendencia general positiva [E ++ (tamaño de los efectos medios) = 0.8654; IC del sesgo del 95% (intervalo de confianza) = 0.3093 a 1,5350]. No se detectaron efectos diferenciales entre las especies de plantas (df=6, Q=6.6, p=0.35), pero la magnitud del efecto mostró cierta variación (Figura 2). Por ejemplo, en Triticum sp., Vigna radiata y Gossypium sp. hubo una tendencia positiva en la respuesta, mientras que en la hierba de búfalo [Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm], gran salbrush [Atriplex lentiformis (Torr.) S. Watts ], Lechuga (Lactuca sativa L. 1753) y tomate (Solanum lycopersicum L.), no hubo respuesta (Figura 2).

Figura 2 Media de tamaños de efecto de Hedges (±95 % de los intervalos de confianza corregidos por sesgo), tamaños de muestra s y números de seguridad (nfs) para estudios que comparan los efectos de PGPM encapsulado en base a polímeros frente a PGPM no encapsulado en diferentes especies de plantas. Los patrones significativos ocurren cuando los intervalos no incluyen cero, lo cual está marcado con una línea punteada. Las especies de plantas en negrita indican que el número de seguridad por fallas es elevado (> 5 n + 10). 

El crecimiento de las plantas se dividió en el análisis de las estructuras de las plantas y en el proceso de la planta. Para el crecimiento de las plantas, el efecto de la encapsulación polimérica de PGPM fue positivo en 67.69 % de las especies utilizadas en este estudio [E ++ (tamaño de los efectos medios) = 0.6769; IC del sesgo del 95 % (intervalo de confianza) = 0.1008 a 1.3027]. Sin embargo, la magnitud del aumento en el crecimiento fue diferente entre las estructuras de las plantas (df=4, Q=13.91, p=0.007), en las que sólo la masa de la raíz y la longitud de los brotes mostraron un efecto significativo por la inoculación de PGPM encapsulado basado en polímeros de células libres; mientras que la masa total de la planta, la masa de los brotes y la longitud de la raíz no mostraron ningún efecto (Figura 3a).

Figura 3 Media de tamaños de efecto de Hedges (±95% de los intervalos de confianza corregidos por sesgo), tamaños de muestras y números de seguridad por fallas (n_fs) para estudios que comparan el efecto del PGPM encapsulado en polímeros frente al PGPM no encapsulado sobre el crecimiento de diferentes estructuras vegetales (a) y el proceso de la planta (b). Los patrones significativos ocurren cuando los intervalos no incluyen cero, lo cual está marcado con una línea punteada. Las estructuras de la planta y el proceso señalados en negrita indican que el número de seguridad por fallas es elevado (> 5 n + 10). 

La respuesta del proceso de las plantas fue categórica en comparación con el crecimiento de las plantas y la germinación de las semillas. Sin embargo, las estructuras de las plantas y su proceso no fueron colineales. En general, se encontró una tendencia de efecto positivo de la PGPM encapsulada basada en polímeros [E ++ (media de tamaños de los efectos) = 0.9680; IC del sesgo del 95% (intervalo de confianza) = 0.3714 a 1.6551]. La respuesta sobre el crecimiento de las plantas fue altamente positiva, mientras que en la germinación de las semillas no hubo respuesta (df=1, Q=21.42, p≤0.0001) (Figura 3b).

Las concentraciones de endurecedor produjeron respuestas diferentes en el rendimiento de la PGPM encapsulada basada en polímeros [E ++ (media de los tamaños de los efectos) = 0.8652; IC del sesgo de 95 % (intervalo de confianza) = 0.3273 a 1.5450]. El efecto, sin embargo, no fue significativo (df=4, Q=6.8, p=0.14), pero se observó una respuesta unimodal para 1.1, 2 y 5.55 % (bajo y mayor porcentaje de endurecedor) de mejor rendimiento de la PGPM encapsulada basada en polímeros (Figura 4a).

Figura 4 Media de tamaños de efectos de Hedges (±95% de los intervalos de confianza corregidos por sesgo), tamaños de muestras y números de seguridad por fallas (nfs) para estudios que comparan el endurecedor (a) y la concentración de goma polimérica (%) (b) para encapsular el material. Los patrones significativos ocurren cuando los intervalos no incluyen cero, que está marcado con una línea punteada. El endurecedor y las concentraciones de goma polimérica en negrita indican que el número de seguridad por fallas es elevado (>5n + 10). 

Todas las concentraciones de goma, excepto la más elevada (3.5 %), mostraron efectos beneficiosos sobre el rendimiento de PGPM [E ++ (media de tamaños de los efectos) = 0.8702; IC del sesgo de 95 % (intervalo de confianza) = 0.2977 a 1.5245] (Figura 4b). No se observaron efectos diferentes entre las concentraciones de goma (df=3, Q=2.18, p=0.53), pero los resultados para la concentración del 2 % fueron elevados (Figura 4b).

El presente metanálisis revela los efectos de la encapsulación basada en polímeros en el rendimiento de PGPM. Nuestros hallazgos principales son los siguientes: 1) la mayoría de las PGPM incluidas en el estudio respondieron positivamente y de forma similar en magnitud a la encapsulación basada en polímeros; sin embargo, algunas de ellas no mostraron respuesta y en el caso de Trichoderma harzianum se obtuvo una respuesta negativa; 2) los efectos de la encapsulación sobre el rendimiento de PGPM dependieron de las especies de plantas inoculadas y en este sentido se observó una clara tendencia de efectos positivos en Triticum sp., Vigna radiate y Gossypium sp. y 3) los aumentos en la masa de las raíces y la longitud de los brotes fueron los efectos más comunes cuando las plantas fueron inoculadas con PGPM encapsulado basado en polímeros; sin embargo, la germinación de las semillas no se afectó cuando las semillas se inocularon con PGPM encapsulada basada en polímeros; 4) la concentración del endurecedor y la goma influyeron en el rendimiento de la PGPM cuando se encapsuló con efectos positivos observados cuando las concentraciones tanto del endurecedor como del polímero fueron de 2 %. Es importante señalar que en todos los casos los resultados están fuertemente influenciados por el número de estudios analizados.

Como lo indica el número de seguridad por fallas, casi todos los resultados que obtuvimos no fueron lo suficientemente sólidos como para sacar conclusiones decisivas (^{Fragkos et al. 2014}, pero hubo tendencia clara al rendimiento mayor de PGPM cuando se encapsuló en una matriz polimérica. Sin embargo, ^{Belman y Wolfson (2014)} consideran que con un bajo número de artículos, los estudios de caso (41) podrían ser un buen número para el metanálisis si los criterios de inclusión se restringieran al área de cultivo hortícola. A pesar de esto, otros estudios podrían considerar técnicas de conteo de votos (donde los criterios de inclusión utilizados podrían aumentar para agregar estudios al metanálisis) para fortalecer la evidencia sobre este ítem (^{Butler et al., 2012}).

Nuestro análisis muestras que en la mayoría de las especies PGPM (67%) los efectos de un agente encapsulado a base de polímeros fueron positivos, comparados con los efectos de PGPM no encapsulada. Sin embargo, cerca de un cuarto de las especies no mostró respuesta a la encapsulación. Es importante un caso (Trichoderma harzianum) en que el efecto de la encapsulación fue negativo porque las bacterias tienen un mejor proceso de germinación que los hongos al usarse individualmente (^{El-Katatny, 2010}).

La razón por la que no todas las PGPM mostraron una respuesta positiva a la encapsulación podría estar relacionada con dos aspectos: 1) hay especies de microorganismos que tienen una resistencia natural per se al medio ambiente severo cuando se exponen a esas condiciones; así, la adición de una matriz basada en polímeros no ayuda a mejorar el rendimiento, especialmente para los microorganismos que forman biofilms y aquellos que tienen la capacidad de reconocer y hacer frente a las condiciones físicas y químicas estresantes de un ambiente específico (^{Santos et al., 2010}); 2) el polímero puede haber afectado la viabilidad o liberación de células. Esto se observó en estudios donde se evaluaron diferentes tipos de gomas y especies de PGPM (^{Tittabutr et al., 2007}).

También observamos que la respuesta de la PGPM encapsulada basada en polímeros dependió, en cierto grado, de las especies de plantas evaluadas. Sorprendentemente, en la especie Lycopersicon esculentum, de la cual hay varios estudios, no hubo efecto positivo después de encapsular PGPM. En este caso, los niveles de germinación influyeron en el crecimiento de las plantas, enmascarando así su efecto positivo tras el metanálisis. Esto ocurre porque durante la germinación de la semilla, la planta requiere una respuesta inmediata de PGPM; pero el inicio de la acción de PGPM encapsulada se retrasa a menudo debido a que la mayoría de las cápsulas poliméricas están diseñadas para una liberación prolongada (^{Serban et al., 2010}).

La diferencia de respuesta entre las especies de plantas puede atribuirse a aspectos de la interacción entre los microorganismos y las raíces de las plantas. Varios estudios señalan la importancia de la asociación de microorganismos a la planta cuando interactúan en la rizósfera (^{Saharan and Nehra, 2011}). Así, la matriz basada en polímeros podría influir en el reconocimiento de microorganismos beneficiosos las raíces de las plantas, ya sea afectando los aspectos fisiológicos de la asociación o el sistema radicular de la planta (^{Salamoni et al., 2010}).

En nuestro análisis también encontramos que con PGPM encapsuladas, el crecimiento de las plantas mejoró en dos aspectos: la biomasa de las raíces y la longitud de los brotes. Sorprendentemente, no observamos efectos sobre la germinación de las semillas. Esto puede sugerir que una posible interacción de la matriz basada en polímeros con el sustrato o el suelo donde las semillas fueron depositadas para la germinación podría haber afectado el proceso de germinación y, por consiguiente, el establecimiento de un nicho ideal para las PGPM (^{Bashan et al., 2014}). En estos tipos de estudios se debe considerar el suelo, las condiciones ambientales y las características de las semillas al usar semillas recubiertas con PGPM de base polimérica (^{Farnsworth, 2000}).Aunque no encontramos efecto de la encapsulación polimérica de PGPM en los puntos extremos de germinación evaluados en este estudio, otros aspectos de la germinación de la semilla podrían haberse beneficiado, como la mayor viabilidad de las semillas por su almacenamiento (^{Sivakumar et al., 2014}).

En cuanto a nuestra última pregunta sobre la influencia del endurecedor y la goma en el rendimiento de la PGPM encapsulada basada en polímeros, en ambos casos las concentraciones de 2 % presentaron señales claras de efectos positivos. La encapsulación de PGPM las protege del estrés mecánico y de condiciones ambientales severas, como pH, sequedad y UV (^{Mortazavian et al., 2007}). Pero cuando las concentraciones del endurecedor o de la goma polimérica son inapropiadas, la liberación y la viabilidad de los microorganismos se comprometen, lo cual afecta significativamente la colonización de la rizósfera por la PGPM (^{John et al., 2011}).

Conclusiones

En nuestro análisis de la literatura acerca de los efectos de la encapsulación basada en polímeros en el rendimiento de PGPM, encontramos respuestas diferenciadas según el tipo de microorganismos, especies de plantas y las concentraciones de endurecedor y de goma evaluados. Detectamos respuestas específicas para cada grupo, permitiéndonos caracterizar los patrones más importantes. La PGPM Bacillus subtilis encapsulada en una matriz polimérica mostró un fuerte efecto positivo. Las especies de plantas no mostraron un patrón claro de respuestas, pero hubo una tendencia de efecto positivo en Triticum sp., Vigna radiate y Gossypium sp. Respuestas positivas más sólidas se detectaron en la masa de las raíces y la longitud de los brotes, pero no en la germinación de las semillas. Finalmente, encontramos que 2 % de concentración para el endurecedor y para la goma polimérica tuvo efectos positivos importantes al encapsular PGPM.