Estándares analíticos

Se preparó una solución madre individual de cada uno los estándares analíticos de plaguicidas organofosforados de alta pureza (> 97 %), en acetona, a partir de la cual se prepararon mezclas a concentraciones intermedias de 10 ng/µL y 50 ng/µL que se utilizaron para fortificar las muestras control y para preparar las disoluciones de trabajo en el mismo solvente (Tabla 1).

Material de análisis

Muestras control de fruto fresco de tomate (como producto de alto contenido de humedad) fueron obtenidas de un productor de frutos orgánicos mientras que muestras de harina de trigo (como producto de baja humedad) se adquirieron en el mercado local de la ciudad de Culiacán, Sinaloa, ambas fueron previamente analizadas por duplicado para para demostrar que se encontraban libres de los analitos bajo alcance.

Preparación de la muestra

Los productos con alto (tomate) y bajo contenido (harina) de humedad fueron preparados conforme a lo reportado en el Manual Analítico de Plaguicidas (PAM), específicamente en el apartado 102-A referente a la preparación de muestras para el análisis de plaguicidas. En el caso del tomate, la parte comestible fue licuada y homogenizada en una licuadora industrial (Marca: Waring, Modelo: 7010G), donde una porción fue tomada como muestra representativa para el análisis; mientras que en el caso de la harina se tomó la submuestra necesaria para el análisis (^{FDA, 1999}).

Determinación de plaguicidas mediante el método PAM 302

Para el caso de muestras con alto contenido de humedad, 100 ± 1.0 g de la muestra preparada, fueron pesados en un vaso de licuadora y se agregaron 200 mL de acetona; para el caso de muestras secas, entre 10 y 50 ± 0.5 g fueron pesados en vaso de licuadora y se agregaron 350 mL de una mezcla de agua-acetona al 35 % y se licuaron a alta velocidad por 2 min. En ambos casos, el extracto se filtró al vacío utilizando una bomba (Marca: Welch, Modelo: 2567B-50B), y una alícuota de 40 mL se colocó en un embudo de separación de 1,000 mL conteniendo 7.0 g de cloruro de sodio, posteriormente se adicionaron 50 mL de cloruro de metileno y 50 mL de acetona (todos los solventes fueron grado HPLC), se agitó por un minuto y se dejaron separar las fases, la fase acuosa (inferior) fue transferida a un segundo embudo de separación de 500 mL, mientras que la fase orgánica fue filtrada a través de sulfato de sodio anhidro y recibida en un concentrador Kuderna-Danish de 500 mL. La capa acuosa contenida en el embudo de separación de 500 mL fue reextraída dos veces más con 50 mL de cloruro de metileno, cada re-extracción fue pasada a través del sulfato de sodio anhidro y recibida en el concentrador Kuderna-Danish al final el sulfato de sodio fue enjuagado con 30 mL de cloruro de metileno. Se agregaron algunas perlas de calentamiento al concentrador y se le colocó una columna Snyder, iniciando la evaporación, en un baño de vapor de anillos concéntricos (Marca: Thermo scientific, Modelo: 2898), a temperatura suave (para evitar reacción brusca de los solventes) la cual se fue aumentando paulatinamente, se evaporó casi a sequedad y luego se agregaron 100 mL de éter de petróleo, se evaporó casi a sequedad y se agregaron 50 mL más de éter de petróleo, se continuó la evaporación casi a sequedad y se agregaron 30 mL de acetona, haciéndolo por las paredes de la columna para arrastrar posibles restos de muestra, se evaporó para obtener aproximadamente 1.0 mL del extracto. Se dejó enfriar y luego se agregó el estándar interno de trifenilfosfato (TPP) y se aforó a 4 mL con acetona, quedando listo el extracto para para su posterior determinación mediante cromatografía de gases con detector fotométrico de flama (CG-FPD) (^{FDA, 1999}).

Instrumentación y condiciones cromatográficas

Los estándares y las muestras fueron inyectados de forma automática a través de un automuestreador 7693 de Agilent a puertos de inyección split/splitless con columna capilar Marca Agilent VF-5 Pesticides de 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm, bajo las siguientes condiciones (Tabla 2).

Temperatura del Inyector 250ºC

Gas: Helio 1.5 mL/min

Make up: Nitrógeno 30 mL/min

Modo: Split - Tasa 10:1

Volumen de inyección: 2.0 µL

Temperatura del detector: FPD-250 ^oC

Cálculos

Para calcular la concentración del analito en la muestra se utilizó un estándar externo mediante el uso de la fórmula siguiente:

Donde:

Determinación de plaguicidas mediante el método QuEChERS

Instrumentación y condiciones cromatográficas

Cada muestra fue inyectada de forma automática a través de un sistema Sample Manager- FTN Acquity de Waters a un equipo de cromatografía de líquidos de ultra-alta resolución (UPLC Acquity serie H) equipado con columna Marca Waters Acquity UPLC BEH C₁₈ 1.7µm, 2.1 x 50mm, en un volumen de 5.0 µL. Las condiciones empleadas fueron establecidas por el laboratorio durante el desarrollo del método cromatográfico, quedando como fase móvil A (formiato de amonio 5 mM, pH 3.0) y fase móvil B (metanol + formiato de amonio 5 mM + 0.1 % de ácido fórmico) con el siguiente gradiente (Tabla 3).

Con un tiempo total de corrida de 9.0 minutos. La identificación y cuantificación se realizó mediante sonda ESI⁺ en un espectrómetro de masas Xevo TQ-S de Waters y estación de trabajo MassLynx. Los iones fueron monitoreados usando MRM (Multiple Reaction Monitoring) para al menos dos transiciones bajo las siguientes condiciones de tándem masas (Tabla 4).

Experimentos para la verificación

Parámetros de verificación evaluados en la comparación metodológica

En ambos métodos se evaluaron los parámetros de límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ), linealidad del equipo (intervalo de trabajo), linealidad del método, exactitud y precisión del método (en condiciones de repetibilidad) según la guía de validación del EURACHEM y posteriormente se hizo una comparación de estos entre los métodos.

Linealidad del método e Intervalo lineal de trabajo (equipos de medición)

Para establecer la linealidad del sistema se construyó una curva de calibración para cada analito con seis niveles de concentración (0.05 ng/µL a 1.0 ng/µL) para método PAM 302 y siete niveles de concentración (rango 1.0 a 40 µg/L) para el caso del método QuEChERS. Para este ejercicio se usaron los estándares en mezcla, cada nivel de concentración de la mezcla de estándares fue analizada bajo condiciones de operación y se obtuvieron gráficas de área bajo la curva de la concentración teórica contra respuesta de los detectores (conteos de area), usando Excel 2010 y confirmando con el gráfico generado por los softwares MS Workstation 7.01 y OpenLab Chemstation, para método PAM 302 y por el software MassLynx para método QuEChERS.

La linealidad del método se estableció con la fortificación de muestras control en tres niveles de concentración alto, medio y bajo mencionadas anteriormente dentro del rango lineal de trabajo y graficando el promedio de las cantidades de recobro contra las cantidades de analito agregadas, en ambos casos (linealidad del sistema y del método), el criterio de aceptación según el ^{EURACHEM (1998)} es que el coeficiente de determinación (R²) sea mayor o igual que 0.98.

Precisión (Repetibilidad)

Se determinó fortificando muestras control en tres niveles de concentración (bajo, medio y alto), se realizaron siete réplicas de cada nivel de concentración y cada nivel en días diferentes y en la etapa determinativa fueron corridas en réplica simple, se calcularon los porcentajes de recobro (% R) y la precisión en condiciones se repetibilidad se evaluó como el coeficiente de variación (% CV) de las repeticiones del nivel intermedio.

Donde:

El criterio de aceptación es que el porciento del CV debe ser ≤ 20 % (^{EURACHEM, 1998}).

Exactitud (% de recobro)

Para evaluar este parámetro se tomaron los datos de porcentaje de recobro obtenidos en cada nivel y se obtuvo el promedio de las recuperaciones de los tres niveles para cada analito.

El criterio de aceptación es que el porcentaje de recobro debe estar entre el 70 % y 120 % (^{EURACHEM, 1998}).

Límite de detección (LOD) y Límite de Cuantificación (LOQ)

Estos parámetros fueron estimados de los datos de la repetibilidad del primer nivel de fortificación calculando la concentración recuperada y obteniendo la desviación estándar (SD) que se utilizó para estimar los límites de detección (LODs) y de cuantificación (LOQs) del método como se describe en las siguientes fórmulas (USEPA, 2000):

LOD= t_0.99*SD (t_0.99 = 3.1427; valor de tablas de t de Student de una cola con 6 grados de libertad (n=7) y 99% de nivel de confianza).

Límites de detección (LODs) y cuantificación (LOQs)

Los límites de detección obtenidos para cada analito por método analítico para la matriz de alto contenido de humedad se observan en el Cuadro 5 mientras que para la matriz de bajo contenido se observan en el Cuadro 6. Como puede observarse el método PAM 302 presenta menores límites tanto de detección como de cuantificación que el método QuEChERS. Sin embargo, los límites de detección y cuantificación de este último son mejores que los reportados por ^{Ahumada & Zamudio (2011)} para acefato (LOD=0.01 mg/kg y LOQ= 0.04 mg/kg) y dimetoato (LOD=0.005 mg/kg y LOQ= 0.02 mg/kg) empleando el método QuEChERS-UPLC/MS-MS en la misma matriz (tomate). Mientras que, en el caso de harina integral de trigo se han reportado LOQs de 0.01 mg/kg para diclorvos y metamidofos empleando el método QuEChERS-UPLC/ MS-MS los cuales son inferiores a los reportados en el presente estudio (^{Bordin et al., 2016}).

Otros métodos empleados en la determinación de organofosforados en tomate como el método QuEChERS y determinación mediante cromatografía de gases acoplado a detector de espectrometría de masas simple (GC-MS) reportan LODs y LOQs superiores para dimetoato (LOD=0.1 y LOQ=0.4 mg/kg) (^{Domínguez et al., 2014}) y diclorvos (LOD=9.72 y LOQ=32.4 mg/kg) (^{Jahanmard et al., 2015}).

Por otro lado, también se han reportado límites inferiores para algunos compuestos como diazinón (LOD=0.0001 y LOQ=0.0002 mg/kg) (^{Fenoll et al., 2007}), dimetoato y diclorvos (LOD=0.003 y LOQ=0.009 mg/kg) (^{Trivedi et al., 2014}) en tomate usando la misma técnica de cuantificación empleada aquí para el método PAM 302.

Intervalo lineal de trabajo

Todas las curvas de calibración de los analitos bajo estudio, independientemente del método, cumplieron con el criterio especificado en el EURACHEM. La Figura 1 muestra a manera de ejemplo las curvas de calibración de acefato y metamidofos en matriz de alta humedad.

Figura 1 Curvas de calibración para acefato y metamidofos en matriz de alta humedad. 

Linealidad del método

Ambos métodos mostraron una respuesta lineal para los analitos evaluados cumpliendo con el criterio establecido, en el cuadro 9 se resumen los resultados obtenidos tanto para la matriz de alto como la de bajo contenido de humedad.

Precisión en condiciones de repetibilidad

La precisión fue estimada como desviación estándar relativa o % CV en el nivel bajo de concentración. Los resultados de precisión para los métodos evaluados se observan en el cuadro 10, los cuales indican que ambos métodos son precisos ya que en todos los casos se cumple con el criterio de evaluación.

Exactitud de los métodos

El porcentaje de recuperación o porcentaje de recobro es un parámetro que demuestra la eficiencia del método de extracción para cada analito en muestras fortificadas intencionalmente. Ambos métodos demostraron ser exactos par el objetivo planteado, los porcentajes de recobro para el método QuEChERS estuvieron entre 85 y 99 % para la matriz de baja humedad y entre 91 y 101 % para la de baja; mientras que para el método PAM 302 se observaron recobros entre 93 y 99 % para la matriz con bajo contenido de humedad y entre 91 y 110 % para la de alta, en todos los casos se cumple con el criterio establecido (Tabla 11).

En lo que respecta a los métodos de extracción evaluados en el presente estudio, el PAM 302 se basa en una extracción líquido-líquido (LLE) que consiste en la distribución de los analitos en diferentes disolventes orgánicos debido al coeficiente de partición de cada analito. Es una técnica de extracción comúnmente utilizada en métodos estandarizados de análisis de plaguicidas (^{Farajzadeh et al., 2014}; ^{Puri, 2014}). Sin embargo, presenta mayores desventajas que ventajas como son: empleo de grandes volúmenes de disolventes orgánicos tóxicos, formación de emulsiones, baja sensibilidad, es un proceso tardado ya que normalmente requiere un paso extra para limpieza del extracto, es costoso y tedioso (^{Ramos, 2012}; ^{Farajzadeh et al., 2014}).

Mientras que el método QuEChERS se basa en la extracción dispersiva en fase sólida (d-SPE) la cual consiste en la dispersión de la muestra con sulfato de magnesio anhidro para lograr la separación del agua presente en ésta del disolvente orgánico usado para extraer los analitos. Posteriormente, el extracto obtenido se mezcla con el sorbente PSA que se utiliza para eliminar componentes polares co-extraídos de la matriz (ácidos grasos, algunos azúcares, pigmentos polares, etc.) y en algunos casos también se adicionan otros sorbentes como C18 o carbón-grafito para eliminar otros interferentes (esteroles, pigmentos como la clorofila, etc.) (^{Anastassiades et al., 2003}). Entre las ventajas de este procedimiento están su rapidez, robustez, alto porcentaje de recuperación, facilidad de manejo, requerimiento mínimo de disolvente y bajo costo. Una de sus desventajas es que se requiere de la evaporación y reconstitución del extracto final para mejorar la sensibilidad de los plaguicidas estudiados (^{Anastassiades et al., 2003}; ^{Ramos, 2012}; ^{Bruzzoniti et al., 2014}; ^{Puri, 2014}).

Respecto a la cuantificación de plaguicidas en muestras alimentarias, la cromatografía de gases y líquidos acoplada a espectrometría de masas actualmente son las técnicas instrumentales más utilizadas en el análisis de residuos debido a que permiten la identificación inequívoca de los analitos mientras que con el uso de detectores selectivos normalmente se requiere realizar confirmación ya sea con el uso de columna y/o detector diferente (^{Di Stefano et al., 2012}; ^{Gómez-Ramos et al., 2013}; ^{Bruzzoniti et al., 2014}; ^{Hird et al., 2014}; ^{Puri, 2014}; ^{Saraji & Boroujeni, 2014}).

Monitoreo del método aplicado a muestras reales

Para demostrar el desempeño de los métodos evaluados, muestras reales se obtuvieron de mercados y supermercados en Culiacán, Sinaloa. Un total de cuatro muestras fueron analizadas (tres muestras representativas para matrices con alto contenido de humedad y una muestra representativa para matrices con bajo contenido de humedad).

En una de las muestras de tomate se detectaron dos de los analitos bajo el alcance (metamidofos y dimetoato). Los residuos fueron detectados en concentraciones de 0.056 y 0.038 mg/kg, respectivamente mediante el método QuEChERS y 0.031 y 0.023 mg/kg, respectivamente por el método PAM 302.