Preparación de las cepas

Se utilizaron controles positivos de Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Enterococcus faeccalis (ATCC 29212), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) y Candida albicans. Los microorganismos se obtuvieron del Laboratorio Nacional para la Investigación en Inocuidad Alimentaria y se activaron en medio de cultivo de caldo de soya tripticaseína (TSB) (BD Bioxon, México) e incubados a 37 ºC durante 24 h; posteriormente, se estriaron en agar soya tripticaseína (TSA) (BD Bioxon, México) y se incubaron a 37 °C durante 24 h (Microbank, Pro Lab Diagnostics, EE. UU.). Finalmente, las colonias obtenidas se utilizaron para preparar una suspensión de 1.5 x 10⁸ CFU/mL correspondiente al estándar de escala de McFarland 0.5 (^{CLSI, 2017}).

Reactivos

Los reactivos naringina, apigenina, ácido clorogénico, diosgenina, metanol, hexano, 2-aminoetil difenil borato, anisaldehído y superóxido de dimetilo se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.); acetato de etilo, ácido acético glacial, ácido fórmico y sulfúrico de J.T. Baker (Xalostoc, Estado de México, México); y polietilenglicol 4000 de Alfa Aesar (Tewksbury, MA, EE. UU.).

Colección de plantas

Se recolectaron hojas de T. diffusa Willd ex Schult. var. aphrodisiaca Ward Urb. y T. diffusa Willd. ex Schult. var. diffusa, en etapa de floración y fructificación en Imala, Culiacán, Sinaloa, México (24 °51 ‘35 “N; 107 °13 ‘1 “W; 92 masl) del 2016-2017. Las variedades se identificaron en la Universidad Autónoma de Sinaloa (UAS) en Culiacán, Sinaloa y en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR) La Paz, B.C.S. México. Las muestras con los números de accesión HCIB30319 para Tdd y HCIB300069 para Tda que se encuentran depositados en el herbario del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR).

Preparación de extractos

Las hojas, previamente lavadas con agua del grifo y posteriormente deshidratadas a la sombra durante siete días, se pulverizaron y se maceraron con metanol o hexano, en proporción 1:10, bajo agitación constante de 175 rpm (Shaker DOS-10L, SKY LINE, ELMI, CA, USA) durante 24 h. Luego, los extractos se filtraron y se concentraron al vacío en un evaporador rotatorio (BUCHI, CH) a 335 mbar, 45 °C y 35 rpm, para el extracto metanólico, a 360 mbar, 40 °C y 35 rpm para el extracto hexánico. Los extractos concentrados se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Cromatografía en capa fina de alta resolución

El análisis de HPTLC se realizó según la metodología propuesta por ^{Reich (2012)}. Para lo cual, se cargaron los extractos metanólicos y hexánicos de damiana (5 μL de una solución 1:10 en metanol o hexano, respectivamente) y las soluciones estándar naringina, ácido clorogénico, apigenina y diosgenina (4 μL de una solución 1: 1 en metanol o hexano, respectivamente) con una longitud de banda de 10 mm y distancia de 15 mm entre cada banda, en placas de vidrio de 10 x 10 cm HPTLC 60F254 (CAMAG, Merck, DE), utilizando el aplicador semiautomático Linomat V (Camag, Muttenz, CH), y analizando los resultados con el software VisionCATS 2.4. La placa se desarrolló en una cámara de doble canal (CAMAG, Merck, DE) con la respectiva fase móvil hasta 80 mm. Se siguió la metodología de la ^{FEUM (2013)} para la separación de los compuestos fenólicos del extracto metanólico, que consistió en desarrollar la placa con la fase móvil: acetato de etilo, ácido acético, ácido fórmico y agua (100:11:11:27) con saturación previa de 20 min. La placa revelada se dejó secar a temperatura ambiente y se calentó a 100 ºC durante tres minutos. Las bandas se derivatizaron con 2-aminoetil difenil borato al 1 % en metanol (NP) y con polietilenglicol 4000 al 5 % en etanol (PEG). Para el extracto hexánico, la fase móvil utilizada fue hexano, ácido acético (7.2: 2.9) y la placa se desarrolló bajo las mismas condiciones que el extracto metanólico, la derivatización se realizó con anisaldehído en ácido sulfúrico concentrado (170 mL de metanol frío, 20 mL de ácido acético glacial, 10 mL de ácido sulfúrico y 1 mL de anisaldehído) (^{Sophia et al., 2011}). Las bandas obtenidas en la placa se observaron con luz UV a 254 y 366 nm (CAMAG, Merck, DE) y se detectaron con un escáner de TLC (CAMAG, Merck, DE) a 254 y 366 nm para el extracto metanólico y 500 nm para el extracto hexánico (^{Sophia et al., 2011}; ^{Seasotiya et al., 2014}).

Análisis de susceptibilidad antimicrobiana

Perfil cromatográfico del extracto metanólico

Se utilizaron extractos crudos para los análisis. En la Figura 1, se muestran los perfiles de las dos variedades, antes (a) y después (b) de la derivatización de los metabolitos con el revelador NP-PEG. Después de la derivatización, se observaron cuatro bandas amarillas en ambas variedades con mayor intensidad y definición en la variedad Tda; también se observó una banda amarilla a marrón a la luz del día. A 254 nm, se observaron ocho y siete bandas amarillas en Tda y Tdd, respectivamente. A 366 nm, los cromatogramas del extracto metanólico de las hojas de T. diffusa de ambas variedades revelaron coloraciones de bandas de amarillo a naranja; estos resultados confirmaron la presencia de flavonoides, de acuerdo con la ^{FEUM (2013)}.

Figura 1 Perfil cromatográfico del extracto metanólico de Tda y Tdd. Línea 1: estándares de naringina, ácido clorogénico y apigenina (1 mg/mL), línea 2: Tda y línea 3: Tdd. a) Placas antes de la derivatización, b) Placas después de la derivatización. 

Los cromatogramas de HPTLC generados para los estándares y el extracto metanólico de Tda y Tdd se muestran en la Figura 2. El cromatograma de 366 nm en Tda mostró diez picos (2A) mientras que el de Tdd mostró ocho (2B). Estos picos pueden representar grupos de metabolitos, ya que se utilizaron extractos crudos.

Figura 2 a) Cromatograma del extracto metanólico de Tda por HPTLC b) Cromatograma del extracto metanólico de Tdd. c) Cromatograma de estándares, pico 1: naringina, pico 2: ácido clorogénico y pico 3: apigenina. 

Perfil cromatográfico del extracto hexánico

En la Figura 3 se muestran los perfiles del extracto hexánico de las dos variedades, antes (a) y después (b) de la derivación de los metabolitos con anisaldehído en ácido sulfúrico, se observaron bandas de coloraciones azules a violetas (Figura 3b), que corresponden a metabolitos de naturaleza terpenoide (^{Sophia et al., 2011}). Los cromatogramas obtenidos por HPTLC de los extractos hexánicos revelaron nueve picos para las dos variedades (Figura 4) y las diferencias en la retención por la fase estacionaria se muestran en la Tabla 2.

Figura 3 Perfil cromatográfico del extracto hexánico de Tda y Tdd. Línea 1: diosgenina estándar (1 mg/mL), línea 2: Tda y línea 3: Tdd. a) Placas antes de la derivatización, b) Placas después de la derivatización. 

Figura 4 a) Cromatograma hexánico de Tda por HPTLC, b) Cromatograma hexánico de Tdd, c) Cromatograma del estándar diosgenina. 

Se conoce que la damiana contiene sesquiterpenos (cariofileno), triterpenos (escualeno y sisosterol) y politerpenos (ficaprenol) (^{Zhao et al., 2007}), cuyos compuestos corresponden a los grupos de metabolitos observados en este estudio.

Susceptibilidad microbiana

En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos de la evaluación de la actividad antibacteriana y antifúngica mediante el método de difusión en disco, de los extractos metanólicos y hexánicos crudos de Tda y Tdd contra S. aureus, E. faecalis, E. coli, K. pneumoniae y C. albicans. Cuando los resultados se compararon con el control (ciprofloxacino para bacterias y nistatina para levaduras), los extractos metanólicos y hexánicos mostraron una capacidad estadísticamente inferior al control positivo. Los 3 mg del extracto metanólico de Tdd mostraron un halo de inhibición de 14.49 mm en la prueba contra S. aureus, mostrando la mejor actividad sin diferencias estadísticamente significativas con 2.5, 2.0 y 1.5 mg del mismo extracto. El extracto hexánico de Tdd fue el único que mostró actividad contra E. coli, sin diferencias significativas entre 1-3 mg y sin actividad contra E. faecalis, mientras que el extracto metanólico de Tda y Tdd a 2.5 y 3 mg tuvo los mejores resultados en esta bacteria. En cuanto a la K. pneumoniae, todos los extractos mostraron actividad inhibitoria, pero no mostraron diferencias estadísticamente significativas. Solo los extractos hexánicos de las dos variedades (Tda y Tdd) a 3 mg muestran actividad antimicrobiana contra C. albicans.

Todos los análisis estadísticos presentaron una R cuadrada de 98.00-99.80, con un nivel de significación del 95 %.

Si bien, algunos extractos no mostraron actividad inhibitoria en la prueba de actividad antimicrobiana por el método de difusión en disco, se continuó con los ensayos de Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) y Concentración Mínima Bactericida (MBC) para todos los extractos. Para C. albicans, donde solo las concentraciones más altas de extractos hexánicos mostraron actividad en el método de difusión en disco, la MIC y el MBC se encontraron a 0.05 mg tanto para los extractos metanólicos como hexánicos de las dos variedades. En cuanto a E. coli y K. pneumoniae, se registraron de 0.05 a 0.1 mg. La MIC se encontró a partir de 2-3 mg para el extracto metanólico con respecto a S. aureus y E. faecalis; por otro lado, el extracto hexánico de las dos variedades para S. aureus y E. faecalis se encontró a 0.5 mg y 1.5 mg, respectivamente. Además, no se detectó la MBC para E. faecalis de los extractos hexánicos, donde, la cantidad más alta analizada fue 5 mg de extracto (Datos no mostrados) (Tabla 4).

La evaluación antimicrobiana in vitro de los extractos metanólicos de Tda y Tdd mostró que ambos inhibieron el desarrollo de E. faecalis, K. pneumoniae y S. aureus, además, el extracto metanólico de Tdd fue mejor estadísticamente (Tabla 3). Aunque los extractos metanólicos de Tda y Tdd no mostraron actividad visible contra C. albicans utilizando el método de difusión en disco, los extractos de ambas variedades mostraron actividad antimicrobiana a 0.05 mg cuando se analizó por el método de microdilución. Lo anterior, puede deberse a la forma en la que se difundieron los metabolitos en el agar, utilizando el método de difusión, la cual podría no ser tan homogénea como por método de microdilución, ya que en este los metabolitos se colocan en un medio acuoso homogéneo.

Por otro lado, los extractos hexánicos de ambas variedades mostraron inhibición contra K. pneumoniae y C. albicans a una concentración de 3 mg, pero no se observaron diferencias significativas entre ellos (Tabla 3). E. coli y S. aureus mostraron halos de inhibición de 10.64-12.09 mm solo en el extracto hexánico de Tdd utilizando el método de difusión; sin embargo, ambos extractos hexánicos de Tda y Tdd mostraron más eficacia con el método de microdilución. Asimismo, se necesitaron concentraciones más bajas de extractos hexánicos que de extracto metanólico para tener una mayor eficacia en todos los microorganismos probados, excepto en E. faecalis. La actividad antimicrobiana de los extractos metanólicos se ha demostrado en otros estudios, contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas donde los flavonoides eran responsables de esta actividad (^{Taleb-contini et al., 2003}) además, se ha observado una relación estructura-actividad en los flavonoides, de los cuales los más activos son aquellos que contienen grupos dihidroxi en las posiciones C3’ y C4’, la posición C6 ‘no sustituida y C7’ con un grupo hidroxilo (^{Taleb-contini et al., 2003}). Los metabolitos presentes en el extracto metanólico de las variedades de damiana son principalmente flavonoides (Figura 1). Incluso, la apigenina, un flavonoide presente en la damiana (^{Cushnie & Lamb, 2005}; ^{Nayaka et al., 2014}; ^{Cha et al., 2016}) también ha demostrado tener actividad antimicrobiana de manera individual; así que, en nuestro estudio puede atribuir a los flavonoides encontrados en las variedades Tda y Tdd como los responsables de la actividad antimicrobiana contra los patógenos del tracto urinario analizados.

Los extractos metanólicos de nuestro estudio también mostraron actividad antimicrobiana contra bacterias Grampositivas y Gram-negativas, mostrando una actividad máxima contra E. coli y K. pneumoniae de acuerdo con la MIC obtenida. En relación con el análisis estadístico, los extractos metanólicos de Tdd tuvieron diferencias significativas en comparación con los de Tda. Estas diferencias podrían estar relacionadas con el tipo de metabolitos presentes en cada extracto, como se observó en el análisis cromatográfico (Figura 2, Tabla 1); los extractos tenían diferencias en los picos 3 y 4 de Tda, que no se encontraron en Tdd, y el pico 7 de Tdd que no se encontró en Tda. Por otra parte, a 366 nm sin derivatización, el cromatograma mostró dos bandas (de color azul a verde) que eran únicas para Tdd. Por lo tanto, además de los flavonoides presentes, pueden tener otros metabolitos que causan la máxima actividad. Sin embargo, se necesitan más estudios para comprobar esta teoría.

Finalmente, también se ha evaluado la actividad antimicrobiana de los terpenos y terpenoides, donde, se demostró que los terpenos tienen una mayor actividad cuando están en un extracto crudo que cuando son aislados y analizados individualmente (^{Nazzaro et al., 2013}). Por lo tanto, los metabolitos presentes en los extractos hexánicos crudos en este estudio, podrían ser los responsables de esta actividad en todos los microorganismos evaluados, a excepción de E. faecalis. La MIC y la MBC obtenidas no mostraron diferencias significativas contra los microorganismos probados; sin embargo, el análisis cromatográfico de los extractos hexánicos Tda y Tdd si mostraron diferencias. Por lo tanto, los metabolitos responsables de la actividad de la inhibición antimicrobiana de ambas variedades pueden no ser aquellos que son diferentes entre las variedades sino aquellos que se comparten entre ellas. Sin embargo, se necesitan más estudios para identificar los metabolitos responsables de la actividad antimicrobiana en cada variedad y establecer la relación de la estructura de cada metabolito con los metabolitos bioactivos.