Origen y fertilización de los portainjertos

La semilla para producir el portainjerto se recolectó en rodales naturales de P. pseudostrobus var. oaxacana en dos localidades (Santa Catarina Ixtepeji y Santa María Jaltianguis) de Oaxaca, México. No se observaron evidencias de hibridación natural en los sitios, por lo que las plantas portainjertos se consideraron como árboles puros de dicha variedad. Los portainjertos crecieron durante 10 meses en contenedores de plástico de 310 cm³ en un sustrato formado por la mezcla de turba, vermiculita y perlita en proporción 2:1:1, respectivamente; posteriormente, se trasplantaron a bolsa de polietileno negro calibre 400 con capacidad de 5.2 L (20 cm de ancho y 35 cm de largo) en un sustrato de tierra de monte (Andosol 80 %) y corteza de pino molida (20 %). Los portainjertos recibieron tres dosis de fertilización; 3, 5 y 8 kg de fertilizante de liberación controlada Multicote® 15-7-15 + 2MgO + micronutrientes por metro cúbico de sustrato. Al momento del injerto, los portainjertos (1.5 años) con 3 kg de fertilizante·m^-3 de sustrato tenían altura promedio de 136.2 ± 4.7 cm y diámetro en la base del tallo (D) de 14.0 ± 1.5 mm (caso de portainjertos); por su parte, los de 5 kg de fertilizante·m^-3 tenían altura promedio de 143.5 ± 3.8 cm y D = 15.4 ± 1.7 mm, y los producidos con 8 kg de fertilizante·m^-3 alcanzaron una altura promedio de 148.0 ± 4.1 cm y D = 16.9 ± 1.3 mm.

Recolección de yemas

Las yemas para injertar se recolectaron de árboles seleccionados con el método de comparación entre vecinos, propuesto por ^{Zobel y Talbert (1988}), ubicados en las mismas comunidades donde se recolectó la semilla para la producción de portainjertos. En cada época de injertado se recolectó un promedio de 120 yemas por localidad. La edad promedio de los árboles donadores fue 43.5 ± 4.7 años con un diámetro de 53.5 ± 2.2 cm y altura promedio de 35.0 ± 3.7 m. De la parte media-superior de la copa de los árboles, se cortaron yemas sanas con longitud promedio de 18 a 20 cm y calibre de 10 a 15 mm, para facilitar la unión con el portainjerto durante cada época de injertado. Las yemas se colocaron en hieleras etiquetadas, recubiertas con aserrín deshidratado, franelas húmedas y hielo, y se transportaron al vivero del Campo Experimental Uruapan donde se injertaron 24 h después de su recolección.

Método y época de injertado

Los injertos se realizaron en tres épocas: 1) a principios del invierno (diciembre de 2018), 2) a finales del invierno (febrero de 2019), 3) a principios del verano (julio de 2019). Se utilizó la metodología descrita por ^{Muñoz et al. (2013}) con dos tipos de injertado: el de enchapado lateral y el de fisura terminal; la altura promedio de injertado fue de 19.3 ± 1.7 cm y de 74.5 ± 2.4 cm, respectivamente. En cada época de injertado se realizaron 108 injertos intravarietales (54 de cada tipo). Se realizó un total de 324 injertos en las tres épocas de injertado.

Para evaluar el prendimiento del injerto se utilizaron los criterios señalados por ^{Muñoz et al. (2013}) que incluyen dos categorías: a) injertos sin prendimiento (valor de 0), donde aparentemente no se presentó unión funcional del cámbium de ambas estructuras y b) injertos prendidos (valor de 1) con respuesta desde 45 y hasta 90 días del injerto (ddi), que incluyen la formación de acículas nuevas, la brotación o rompimiento de la yema y el crecimiento del brote (Cb). El prendimiento y la supervivencia (%) se registraron cada tercer día, desde los 3 hasta los 90 ddi. El Cb se midió con un vernier digital Neiko® y una regla graduada (cm). De la misma forma, y de manera complementaria para determinar su efecto en el éxito del injerto, se midió la longitud (cm) y diámetro de la yema (mm), altura total (cm), diámetro en la base del tallo del portainjerto (mm) y altura de injertado (cm).

Diseño experimental y análisis estadístico

Se evaluaron cuatro factores con diferentes niveles: (a) procedencia de las yemas (Santa Catarina Ixtepeji y Santa María Jaltianguis); (b) fertilización del portainjerto (3, 5 y 8 kg de fertilizante de liberación controlada Multicote® 15-7-15 + 2MgO + micronutrientes por m³ de sustrato); (c) época de injertado (principios de invierno, finales de invierno, principios de verano); y (d) método de injertado (enchapado lateral y fisura terminal). Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2 x 3 x 3 x 2 con nueve repeticiones por tratamiento; cada injerto representó una unidad experimental.

Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para determinar el efecto de los factores y sus interacciones sobre los valores de prendimiento y Cb; el ANOVA para ambas variables se realizó con los datos de la evaluación a los 90 ddi, con el siguiente modelo estadístico.

donde,

y_ijklm = valor variable respuesta de la repetición l del nivel i de A, nivel j de B, nivel k de C y nivel l de D

µ = media general

A_i = efecto del nivel i del factor A (procedencia de la yema)

B_j = efecto del nivel j del factor B (fertilización del portainjerto)

C_k = efecto del nivel k del factor C (época de injertado)

D_l = efecto del nivel l del factor D (método de injerto)

AB_ij = interacción A*B, correspondiente al nivel i de A y nivel j de B

AC_ik = interacción A*C, correspondiente al nivel i de A y nivel k de C

AD_{i l}= interacción A*D, correspondiente al nivel i de A y nivel l de D

BC_jk = interacción B*C, correspondiente al nivel j de B y nivel k de C

BD_jl = interacción B*D, correspondiente al nivel j de B y nivel l de D

CD_kl = interacción C*D, correspondiente al nivel k de C y nivel l de D

ABC_ijk = interacción A*B*C, correspondiente al nivel i de A, nivel j de B y nivel k de C

ABD_ijl = interacción A*B*D, correspondiente al nivel i de A, nivel j de B y nivel l de D

ACD_ikl = interacción A*C*D, correspondiente al nivel i de A, nivel k de C y nivel l de D

BCD_jkl = interacción B*C*D, correspondiente al nivel nivel j de B, nivel k de C y l de D

ABCD_ijkl = interacción A*B*C*D, correspondiente al nivel i de A, nivel j de B, nivel k de C y nivel l de D.

Є_ijklm = error experimental correspondiente a la repetición m del nivel i de A, j de B, k de C y l de D.

Previo al ANOVA, los datos de prendimiento se transformaron con la función arcoseno de la raíz cuadrada del valor original expresado en fracción decimal [T = arcoseno (√Y)]. Después del análisis, los valores promedio se transformaron nuevamente a las unidades originales. Cuando se presentaron diferencias significativas, se hizo una prueba de comparación de medias de Tukey (P = 0.05). Para evaluar la supervivencia, los injertos muertos se codificaron como cero y los vivos como uno. La dinámica de la supervivencia para los cuatro factores se analizó mediante la prueba Log-Rank, a partir de curvas de supervivencia construidas por el método ^{Kaplan-Meier (Kaplan & Meier, 1958}) en el que se define la función de supervivencia como:

donde,

S (t) = probabilidad de que una muerte ocurra en un tiempo T

P = probabilidad de supervivencia en los intervalos de tiempo durante la evaluación

T = tiempo total de supervivencia hasta el final de la evaluación, que debe ser mayor que t

t = tiempo en cualquier momento desde el comienzo de la evaluación.

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa STATISTICA versión 13.0 (^{StatSoft Inc., 2018}).

Prendimiento del injerto

La formación de acículas, estructuras florales y brotación de yemas se manifestó desde los 45 días después de injertado (ddi), lo cual fue indicativo de la actividad y prendimiento de los injertos. El Cuadro 1 muestra que se obtuvieron diferencias significativas (P < 0.05) en el prendimiento y Cb por efecto de la procedencia de la yema, la época, el método de injertado y algunas de sus interacciones.

Acorde con el Cuadro 2, los injertos mediante la técnica de enchapado lateral presentaron en promedio 36 ± 0.1 % de prendimiento y los de fisura terminal 13 ± 0.1 %. Con respecto a la época, el prendimiento aumentó a 41 ± 0.1 % cuando el injerto se realizó en febrero del 2019; las diferencias fueron de hasta 27 % respecto a los injertos realizados en diciembre del 2018 (época 1: 13 ± 0.1 %) y julio del 2019 (época 2: 20 ± 0.1 %). Durante las tres épocas, la yema que provenía de Santa Catarina Ixtepeji tuvo mayor éxito (26 ± 0.1 %) que la de Santa María Jaltianguis (23 ± 0. 2 %) en ambas técnicas de injertado, especialmente para injertos laterales (Cuadro 2). El efecto de la época de injertado se debe a las diferencias en el estado fenológico y fisiológico de la yema; al momento de recolectarse, durante la época 2 (febrero 2019), la yema presentó quiescencia inicial propiciando mayor crecimiento en diámetro (8 a 14 ± 1.2 mm) y longitud (12 a 16 ± 3.3 cm). Asimismo, el diámetro del portainjerto (14 a 18 ± 1.4 mm) y de la yema (8 a 14 ± 0.8 mm) influyó en la unión de ambas estructuras; el éxito del injerto involucra aspectos morfológicos, anatómicos, fisiológicos y bioquímicos de una planta (^{Yin et al., 2012}). Por tanto, cuanto más rápida sea la unión (soldadura) de los tejidos de ambas estructuras, mayor será el éxito y prendimiento, ya que esta eficiencia disminuye el tiempo en que el injerto está en riesgo de deshidratación (^{Gaspar, Wendling, Stuepp, & Angelo, 2017}).

El efecto significativo de la interacción de los factores procedencia de la yema-época de injerto (Cuadro 1; Figura 1a) reforzó los resultados obtenidos; las yemas provenientes de Santa Catarina Ixtepeji injertadas durante la época dos presentaron 48 ± 0.04 % de éxito. Por otra parte, la interacción procedencia de la yema-método de injerto (Cuadro 1) demostró que el prendimiento es mayor (40 ± 0.03 %) cuando se injerta mediante la técnica de enchapado lateral con yemas procedentes de Santa Catarina Ixtepeji (Figura 1b).

Figura 1 Efecto de las interacciones: procedencia de la yema-época de injertado (a) y procedencia de la yema-método de injerto (b) en el prendimiento de los injertos en Pinus pseudostrobus var. oaxacana (barras indican error estándar de la media). 

Es común que el prendimiento y la tasa de crecimiento reducida sean causa de la mala calidad de unión yema-portainjerto que a menudo se relaciona con poca formación de callo causada por un contacto deficiente o por incompatibilidad intra o interespecífica (^{Castro-Garibay, Villegas-Monter, & López-Upton, 2017}; ^{Yin et al., 2012}). Un factor que favoreció el prendimiento fue la afinidad genética entre púa y patrones, ya que los injertos intraespecíficos son más exitosos por tener mayor similitud anatómica, morfológica y fisiológica entre los componentes del injerto (^{Goldschmidt, 2014}). Estos resultados concuerdan con los reportados por ^{Muñoz et al. (2013}) para injertos intraespecíficos de enchapado lateral con P. pseudostrobus var. pseudostrobus, ya que obtuvieron 40 % de prendimiento a 90 ddi; con los descritos por ^{Pérez-Luna et al. (2019}) para injertos del mismo tipo, pero con P. engelmannii Carr., quienes registraron 25 % de prendimiento a los 180 ddi.

Crecimiento del brote

El Cuadro 1 indica que el Cb tuvo diferencias significativas (P ≤ 0.05) únicamente para los factores individuales época y método de injertado. De acuerdo con el Cuadro 2, los injertos realizados durante la época 2 (febrero 2019) presentaron 3.3 cm (14.5 ± 0.1 cm) más que las otras épocas. El Cb fue mayor en los injertos de enchapado lateral con 13.6 ± 0.1 cm, respecto a lo observado en injertos de fisura terminal con 11.4 ± 0.1 cm. Las diferencias de Cb se deben a que, en los injertos terminales, la yema líder se sustituyó e injertó a mayor altura (74.5 ± 2.4 cm); en consecuencia, el portainjerto podría reducir el flujo de agua y nutrientes que requiere para su crecimiento (^{Świerczyński, Kolasiński, Urbaniak, Stachowiak, & Nowaczyk, 2018}). En cambio, en los injertos laterales, la parte aérea del portainjerto se retiró en tres etapas según lo mencionado por ^{Muñoz et al. (2013}); además, la altura del injerto fue menor (19.3 ± 1.7 cm) y, por lo tanto, las acículas que el injerto desarrolló a los 45 ddi realizaron todas las actividades de fotosíntesis y transpiración. Estas condiciones repercutieron y establecieron diferencias en el Cb.

Se ha mencionado que, generalmente, las diferencias de Cb se deben al hábito de crecimiento de las procedencias; sin embargo, no fueron significativas en este caso, sino que el Cb fue afectado por la época en la que se realizó el injerto (^{Koepke & Dhingra, 2013}; ^{Martínez-Ballesta, Alcaraz-López, Muries, Mota-Cadenas, & Carvajal, 2010}; ^{Świerczyński et al., 2018}). De acuerdo con Martínez-Ballesta et al. (2010), la formación incorrecta del callo entre yema-portainjerto puede reducir el Cb. El uso de yemas en etapa de quiescencia inicial o receso (época 2) aumentó el crecimiento de la púa injertada, ya que el Cb iniciaba su fase activa (^{Viveros-Viveros & Vargas-Hernández, 2007}). Por otro lado, el uso de púas en estado de quiescencia posdormancia (época 3) interrumpió el Cb en el periodo de prendimiento (primeros 45 días), mientras se establecían las conexiones en el punto de unión del injerto.

Supervivencia de los injertos

La supervivencia de los injertos se determinó de acuerdo con lo mencionado por varios autores, ya que se evaluaron los injertos muertos sin PI e injertos vivos con respuesta y Cb (^{Cuevas et al., 2015}; ^{Muñoz et al., 2013}; ^{Pérez-Luna et al., 2019}). De manera general para todo el experimento (incluidos todos los tratamientos), la supervivencia disminuyó de 100 % hasta 50 ± 5 % a los 40 ddi y 27.9 ± 4.6 % a los 90 ddi (Cuadro 3).

En la prueba Log-Rank se presentaron diferencias estadísticas (P < 0.001) únicamente para el método de injerto respecto a la época de injertado. La supervivencia promedio de los injertos laterales a 90 ddi fue de 20.5 % y para injertos terminales de 30.3 %. El mayor porcentaje de mortalidad se registró durante los primeros 40 días, ya que más del 50 % presentó problemas de prendimiento (Cuadro 3; Figura 2).

Figura 2 Supervivencia estimada con el modelo de Kaplan-Meier para injertos de enchapado lateral y fisura terminal en Pinus pseudostrobus var. oaxacana. Valores con letras distintas indican diferencias estadísticas de acuerdo con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). 

La función de supervivencia estimada con el modelo de Kaplan-Meier permitió distinguir diferencias significativas a los 90 ddi; el injerto de enchapado lateral presentó 24.1 %, 19.2 % y 18.4 % de supervivencia para la época 1, 2 y 3, respectivamente, y para los injertos de fisura terminal, la supervivencia estimada fue 33.3 %, 34.3 % y 23.3 % para las épocas 1, 2 y 3, respectivamente (Figura 2).

Se ha demostrado que la época de injerto influye en el porcentaje de éxito y supervivencia de los injertos; la mayoría de los trabajos recomiendan injertar coníferas en temporada invernal (^{Almqvist, 2013}; ^{Cuevas et al., 2015}; ^{Gaspar et al., 2017}; ^{Świerczyński et al., 2018}). En un estudio similar con injertos laterales en P. engelmannii, realizados al final del invierno, se obtuvo una tasa de supervivencia de 22.5 % a seis meses después del injertado (^{Pérez-Luna et al., 2019}). En especies latifoliadas, al realizar injertos terminales intraespecíficos en Khaya grandifoliola C. DC., la supervivencia incrementó significativamente (81.67 %), así como su crecimiento en altura durante el invierno (^{Opoku et al., 2019}). Con base en los resultados obtenidos se puede decir que la mejor época para realizar injertos en P. pseudostrobus var. oaxacana es al final del invierno, durante la época 2 (febrero). Gaspar et al. (2017) mencionan que es posible el éxito de los injertos de especies leñosas de cualquier parte del mundo en cualquier época del año bajo condiciones climáticas controladas, siempre que la temperatura máxima no sea superior de 24 °C ni la mínima sea inferior de 3 °C.

El método de injertado juega un papel determinante en la supervivencia, ya que, si el portainjerto y la yema no presentan unión en el cámbium, el injerto no tendrá éxito; en este trabajo, los injertos laterales presentaron mayor Cb y prendimiento. Aunque los porcentajes promedio de prendimiento y supervivencia fueron bajos (36 ± 0.1 %) y en la mayoría de los factores no hubo efecto interactivo significativo, sí existió efecto aditivo que aumentó estos valores (hasta 66 %). Lo anterior se reflejó en los injertos laterales realizados en portainjertos producidos con 8 kg de fertilizante·m^-3 con yemas de Santa Catarina Ixtepeji durante la época 2 (febrero 2019).

En este sentido, los resultados representan un avance en el conocimiento del tema respecto a algunos de los factores determinantes para el éxito de injertos intraespecíficos con P. pseudostrobus var. oaxacana. En general, se pudo apreciar que el prendimiento y supervivencia del injerto depende principalmente de factores externos como la ejecución correcta de la técnica de injerto y la época de injertado. Algunos autores indican que los factores internos como la compatibilidad yema/portainjerto y las características anatómicas de ambas estructuras (factor no estudiado) también son importantes (^{Almqvist, 2013}; ^{Castro-Garibay et al., 2017}; ^{Darikova et al., 2013}; ^{Martínez-Ballesta et al., 2010}; ^{Ranjith & Ilango, 2017}; ^{Reig et al., 2018}).