Explantes de semillas maduras

En agosto de 2018 se colectaron al azar semillas de E. parryi de frutos maduros de plantas nativas en el municipio de Juárez, Chihuahua, México. Los frutos se colocaron en bolsas de papel y se llevaron al laboratorio de biotecnología vegetal de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Los frutos se diseccionaron longitudinalmente con tijeras y las semillas se colocaron en una bolsa de papel en la oscuridad a 25 ± 1 °C hasta su uso. Las semillas se esterilizaron con cloro comercial al 50 % (Cloralex® solución de hipoclorito de sodio al 5 %) durante 15 minutos, se enjuagaron con agua destilada estéril y se dejaron en agua estéril durante 24 h (^{García-González et al., 2020}). La mitad de la cubierta seminal se retiró con pinzas y bisturí esterilizados. Diez semillas escarificadas por frasco en cada tratamiento germinaron en medio de cultivo basal MS (^{Murashige & Skoog, 1962}) suplementado con 2, 4-D a 0, 2, 4 y 6 mg∙L^-1 para inducción de callo. El callo embriogénico se estimó como el porcentaje de estructuras globulares después de 60 días. Los callos mantenidos durante 60 días se subcultivaron cada 30 días en medio MS con las mismas concentraciones de 2, 4-D. Se hizo un registro de la formación de callo embriogénico y no embriogénico, el color y el número de brotes regenerados después de 120 días.

Explantes de plántulas

Plántulas estériles procedentes de la germinación de semillas con 40 días de cultivo in vitro se utilizaron como explantes. Las plántulas se diseccionaron en tres secciones: apical, media y basal (se eliminó la raíz). Treinta y seis explantes por sección se colocaron en cajas de Petri con 15 mL de medio de cultivo basal MS suplementado con 0, 2, 4 y 6 mg∙L^-1 de 2, 4-D para inducir la formación de callo embriogénico. Los callos inducidos se dividieron al azar en 27 piezas por tratamiento y se subcultivaron tres veces cada 30 días en el mismo medio de cultivo. Después de 90 días, los callos con estructuras globulares (27 piezas de 1 a 2 cm) se transfirieron a MS con 0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg∙L^-1 de 2, 4-D, BAP y kinetina (K) (Caisson Labs). La respuesta morfogenética y el color del callo se evaluaron después de 120 días.

Explantes de callos verdes compactos

Los callos verdes compactos del ápice del brote y cultivados en diferentes concentraciones de BAP durante 30 semanas procedieron de experimentos previos de micropropagación in vitro utilizados para este estudio. Nueve explantes de callos (1 a 2 cm) se utilizaron por tratamiento en cajas Petri (100 x 15 mm) con 0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg·L^-1 de 2, 4-D, BAP o K, para comparar su efecto en la inducción de embriogénesis somática. Los experimentos se evaluaron después de 30 días utilizando el software de imágenes NIS-Elements (Nikon) para el conteo de embriones somáticos.

Los tres tipos de explantes se incubaron en una cámara de luz bioclimática con fotoperiodo (16 horas luz). Las bombillas fluorescentes proporcionaron la intensidad de luz (5 000 lux) a 25 ± 2 °C. Los callos se observaron bajo el estereoscopio Nikon SMZ 800 para la identificación de brotes o embriones somáticos. Las imágenes se tomaron con un estereomicroscopio acoplado a una cámara Nikon Digital Sight DS-Fi2.

Explantes de semillas maduras

El callo incipiente fue de color blanco y derivó directamente del cotiledón después de 20 días de cultivo. Posteriormente, el callo presentó áreas de color rosa intenso, verde claro y blanco. Los datos transformados por el ANOVA mostraron que 2, 4-D produjo efecto significativo en el porcentaje de callo embriogénico comparado con el testigo (Cuadro 1). Después de 60 días de cultivo, se observaron estructuras embriogénicas globulares en la periferia de los callos en todas las concentraciones de 2, 4-D (Cuadro 2). El subcultivo de callos embriogénicos en medios con o sin 2, 4-D a 120 días no promovió su maduración.

Las estructuras globulares en E. parryi probablemente no hayan pasado a las etapas más avanzadas debido a la acumulación de 2, 4-D, la cual se produce en el interior de los embriones globulares. La auxina 2, 4-D, en medio de cultivo, induce una respuesta embriogénica asociada al aumento de los niveles endógenos de IAA y al transporte polar necesario para la formación del eje apical-basal (García et al., 2019). En consecuencia, pueden producirse anomalías morfológicas como la ausencia de meristemo apical que podría afectar el desarrollo posterior del embrión (^{Baskaran & Van Staden, 2017}; ^{Nugent, Chandler, Whiteman, & Stevenson, 2001}). En este estudio, los tratamientos con 2, 4-D favorecieron el callo embriogénico siendo la fase globular la estructura dominante sin alcanzar el siguiente estado de maduración (fase corazón). ^{Pinheiro, Soares, y Arnholdt-Schmitt (2001}) también obtuvieron estructuras globulares de O. ficus-indica incapaces de regenerar plantas. Probablemente, esta respuesta se deba a una deficiencia en los carbohidratos suplementados en los medios de cultivo. Por su parte, ^{Vondrákova et al. (2011}) encontraron que los embriones somáticos de Abies alba Mill. cultivados con 2, 4-D no lograron completar su maduración. En contraste, el callo embriogénico de Mediocactus coccineus (DC.) Britton et Rose indujo estructuras globulares que se convierten en una etapa cotiledonal más definida (^{Infante, 1992}). ^{Stuppy y Nagl (1992}) también indujeron callo verde embriogénico de Ariocarpus retusus Scheidw. y después de cuatro meses apareció el primer embrión somático en la fase cotiledonaria.

Los callos no embriogénicos de E. parryi también se estimularon y generaron la formación de brotes con tricomas (Figura 1). Los datos transformados por el ANOVA mostraron que 2, 4-D causó diferencia significativa (P = 0.007) en el número de brotes en comparación con el testigo. La comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05) indicó que el número de brotes fue superior en medio de cultivo con 2.0 mg∙L^-1 de 2, 4-D después de 120 días (Cuadro 3). Así, los callos de E. parryi fueron capaces de formar callos organogénicos y embriogénicos. El número de regeneración indirecta de brotes depende del genotipo de la planta y de la adición de reguladores de crecimiento vegetal (^{Asad et al., 2019}; ^{Baskaran, Kumari, Naidoo, & Van Staden, 2016}). Por ejemplo, ^{Pedda et al. (2019}) utilizaron BAP a 3.0 mg∙L^-1 + ANA (acido 1-naftalenacético) 0.5 mg∙L^-1 en Hylocereus costaricensis (F. A. C. Weber) Britton et Rose. y produjeron 13.2 brotes. En cambio, ^{Wakhlu y Bhau (2000}) reportaron 23.6 brotes del callo utilizando K a 1.3 mg∙L^-1 en Coryphantha elephantidens Lem. La presencia de tricomas en brotes se considera un marcador morfológico que excluye la posibilidad de que sean embriones somáticos (^{Saptari & Susila, 2019}).

Figura 1 Brotes regenerados de Echinocactus parryi sobre callo subcultivado a los 60 días de cultivo in vitro: a) brotes masivos redondos (s) con tricomas (t) en la periferia del callo con 2,4-D a 2.0 mg∙L^-1; b) brotes alargados (s) mostrando tricomas (t) con kinetina a 2.0 mg∙L^-1. Las barras representan 1 000 µm (1X). 

Explantes de plántulas

Los datos transformados del ANOVA mostraron que 2, 4-D en cuatro niveles, el tipo de explante en tres niveles como efectos principales y sus interacciones fueron significativos para la formación de callo embriogénico (Cuadro 4). La comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05) indicó que la inducción de callo embriogénico fue mayor en los explantes de la sección media (30.86 ± 0.40) y en el tratamiento 2, 4-D a 6 mg∙L^-1, después de 30 días de cultivo in vitro (Cuadro 5). Las secciones apical, media y basal de las plántulas fueron competentes para producir callo embriogénico en todas las concentraciones evaluadas de 2, 4-D en comparación con el testigo. La mejor respuesta de interacción se observó en todas las concentraciones evaluadas con explante de la sección media (100 % de callo embriogénico) y en el explante de la sección basal con 2 y 6 mg∙L^-1 de 2, 4-D (100 % y 92.9 ± 0.04 de callo embriogénico, respectivamente). Estos explantes mostraron estructuras globulares después de 30 días de cultivo in vitro (Cuadro 6).

La sección apical conservó un alto porcentaje de tejido intacto (Figura 2). Las estructuras globulares tuvieron color blanco, verde y rosa que variaba de claro a intenso. Tras 120 días de cultivo, la fase globular no evolucionó hacia un desarrollo embrionario maduro. La auxina 2, 4-D es difícil de eliminar y permanece en este tejido durante un periodo prolongado. La exposición prolongada de los embriones somáticos a esta potente auxina puede promover numerosos embriones anormales, lo que no permite alcanzar las siguientes fases en algunas especies vegetales (García et al., 2019). Por el contrario, ^{Osuna y Barrow (2004}) observaron que en los ápices de los brotes de Bouteloua eriopoda (Torr.) Torr., cultivados con 2, 4-D o Dicamba (ácido 6-dicloro-anísico) durante seis semanas, los embriones somáticos progresaron desde los globulares hasta los embriones maduros, asemejándose a los desarrollados naturalmente en las semillas.

Figura 2 Respuesta de sección apical, media y basal de explantes de plántulas de Echinocactus parryi después de 30 días de cultivo. a) Alta división celular y callo embriogénico (ce) y ápice del brote con tejido intacto: meristemo apical (am), cotiledones (c) y callo embriogénico (ce). b) La sección media muestra callo embriogénico (ce) cubriendo 100 % del tejido original. c) Sección basal con callo embriogénico (ce) justo en la parte cortada del explante. Las barras representan 1 000 µm (1X). 

Explantes de callos verdes compactos

En el caso de los callos verdes compactos de E. parryi (30 semanas) cultivados en 2, 4-D, BAP y K, los datos mostraron que solo los callos cultivados en medio con 0.5 mg∙L^-1 de K promovieron el mayor número de embriones somáticos después de 30 días de cultivo. Este tratamiento indujo una media de 19.2 embriones por explante. Por el contrario, los callos cultivados con tratamientos BAP o 2, 4-D no generaron embriones somáticos ni brotes. Los resultados indicaron que los callos verdes compactos de E. parryi pueden producir embriones somáticos sin auxinas sintéticas. Asimismo, ^{Al-Dein, Al-Ramamneh, Sriskandarajah, y Serek (2006}) utilizaron 1.5 mg∙L^-1 de K para lograr embriones somáticos en estado globular, torpedo y cotiledón de Schlumbergera truncata (Haw.) Moran.

Los embriones somáticos de E. parryi se diferenciaron fácilmente debido al color blanco, muy contrastado con el color verde del callo. El color blanco indica la presencia de carbohidratos y proteínas esenciales para el desarrollo del embrión y la germinación en Ledebouria ovatifolia (Bak.) Jess. (^{Baskaran et al., 2016}). Las mismas características se reportaron en Santalum album L. (^{Rugkhla & Jones, 1998}), O. ficus-indica (^{Linhares et al., 2006}), Zingiber officinale Rosc. (^{Lincy, Remashree, & Sasikumar, 2009}) y Musa sp. (^{Debbrama, Sudhakar, Kumar, & Soorianathasundaram, 2019}). Los embriones somáticos de E. parryi se transfirieron al medio de cultivo MS sin regulador de crecimiento vegetal para inducir su germinación. Después de 30 días, los embriones somáticos no germinaron y el número de embriones disminuyó drásticamente en aproximadamente 50 %. La no germinación de los embriones somáticos podría deberse a una maduración ineficaz debido a malformaciones de meristemos (^{Correia, Cunha, Slagueiro, & Canhoto, 2012}). García et al. (2019) afirman que las anomalías generadas por cambios genéticos en el ADN de los embriones somáticos son difícilmente reversibles; sin embargo, las anomalías causadas por cambios epigenéticos pueden ser reversibles y los embriones anormales pueden producir plantas en la mayoría de los casos. Por el contrario, otras especies de cactus tuvieron una germinación exitosa de embriones somáticos en medio de cultivo basal MS. Algunos ejemplos son M. coccineus (^{Infante, 1992}), Ariocarpus kostchoubeyanus (Lem.) K. Schum. (^{Moebius-Goldamer, Mata-Rosas, & Chávez-Avila, 2003}), S. truncata (^{Al-Dein et al., 2006}) y O. ficus-indica (^{Bouamama et al., 2011}).

La inducción de embriones somáticos solo es posible en células vegetales totipotentes reprogramadas genéticamente y su morfología se relaciona con embriones cigóticos (^{Osuna & Barrow, 2004}; ^{Silveira et al., 2013}; ^{Wu et al., 2020}). Cada embriogénesis comprende cuatro etapas: globular, corazón, torpedo y cotiledón (^{Quiroz-Figueroa et al., 2006}; ^{Saptari & Susila, 2019}). Los embriones somáticos de E. parryi pasaron por todas las etapas al mismo tiempo (Figura 3). El logro depende de la especie y la suplementación de reguladores de crecimiento vegetal. La kinetina tuvo influencia más significativa para inducir todas las fases del embrión somático que el resto de los tratamientos. Desafortunadamente, las últimas fases no germinaron a pesar de que los callos compactos no se cultivaron en condiciones de 2, 4-D. Esta falta de germinación podría deberse al genotipo de la planta, que en ocasiones presenta maduración ineficaz durante el proceso morfogenético. Por ejemplo, los embriones somáticos de orquídeas (semillas sintéticas) en diferentes etapas germinaron (91 %) en MS con BAP y kinetina a 0.5 mg∙L^-1 cada uno (^{Manokari et al., 2020}). A pesar de que los embriones somáticos han sido inducidos en muchas especies, aún quedan problemas por resolver en el caso de E. parryi.

Figura 3 Etapas de embriogénesis somática en callos compactos verdes de Echinocactus parryi: a) etapa globular, b) corazón, c) torpedo y d) etapa cotiledonaria (señalada con flechas) a los 40 días de cultivo in vitro en tratamiento con 0.5 mg∙L^-1 de kinetina. Las barras representan 500 µm (4X). 

Histología

El examen histológico de las muestras de callo embriogénico mostró las estructuras globulares de los explantes de las semillas (Figura 4). En la Figura 4a se muestran las células meristemáticas organizadas para formar un embrión globular. Las células muestran núcleos intensamente teñidos y paredes celulares gruesas. Las células meristemáticas son pluripotentes y son el origen de los embriones somáticos (^{Hui-Ju, Jen-Tsung, Hsiao-Hang, & Wei-Chin, 2018}). En la Figura 4b se observan células meristemáticas con un núcleo sólido teñido que dan lugar a la formación de embriones globulares. El protodermo se observó en un embrión globular aislado. Las células meristemáticas muestran un núcleo teñido, un citoplasma denso y granos de almidón (Figura 4c). El análisis histológico mostró células traqueidas en tejido vascular rodeadas de células vacuoladas (Figura 4d). En O. ficus-indica,^{Pinheiro et al. (2001}) reportaron una estructura traqueidal desorganizada observada en E. parryi, lo que probablemente significa un desorden en el metabolismo endógeno y en la distribución de auxina dentro de las células que afectan la maduración de los embriones somáticos.

Figura 4 Análisis histológico de estructuras globulares de callo embriogénico a partir de semillas de Echinocactus parryi en tratamientos con 2.0 mg∙L^-1de 2, 4-D. a) Embrión globular subepidérmico (flecha). b) Células meristemáticas (mc) con núcleo intensamente teñido (flecha). c) Embrión globular aislado con células de protodermo (p), células meristemáticas con núcleo (flecha) y granos de almidón (sg) en el interior de las células. d) Células traqueidas (puntas de flechas) y tejido vascular (flechas). Las barras representan 200 µm (10X). 

En la Figura 5 se representa el análisis histológico en sección longitudinal de los embriones somáticos generados a partir de callos verdes compactos. Este análisis indicó que la formación de embriones somáticos fue posible a partir de una serie de divisiones celulares organizadas. En la Figura 5a se muestra un proembrión desarrollado a partir de células subepidérmicas con un núcleo bien teñido y células vacuoladas con un protodermo evidente. El inicio de un sistema vascular se observó en el embrión en forma de torpedo con células del procambium y tejido vascular del explante (Figura 5b). El sistema vascular típico en la formación del embrión, y la falta de conexión entre los embriones y el tejido del explante se ha confirmado mediante el análisis histológico de O. ficus-indica (^{Linhares et al. 2006}). En la Figura 5c se representa un embrión en forma de torpedo con protodermo evidente y células de procambium para iniciar un sistema vascular. Las células del procambium son un tipo de célula madre y pueden dar lugar a la formación de embriones somáticos con una señal específica (^{Cunha et al., 2018}; ^{Rose, 2019}). La Figura 5d es una vista cercana de las células de embriones somáticos con núcleo teñido y numerosos granos de almidón. El almidón es una fuente de energía para las células en los procesos de diferenciación y división celular, también es necesario para la morfogénesis y la diferenciación de embriones somáticos (^{Baskaran et al., 2016}). El análisis histológico es útil para confirmar la organización estructural de embriones somáticos. Las observaciones histológicas también mostraron la fase globular, corazón, torpedo y cotiledón.

Figura 5 Secciones longitudinales de embriones somáticos a partir de callos verdes compactos de Echinocactus parryi en tratamiento con 0.5 mg∙L^-1 de kinetina. a) Proembrión somático emergiendo de la región subepidérmica con células meristemáticas y protodermo (p) (10X, barra 200 µm). b) Embrión somático en la fase de torpedo con protodermo (p) y células de procambium (pc) y células vasculares del explante (flecha) (10X, barra 200 µm). c) Embrión somático con protodermo (p), células de procambium (pc) (10X, barra 200 µm). d) Células meristemáticas de embriones somáticos con granos de almidón (sg) y núcleo (n) (100X, barra 10 µm).