Artículo original

 

Estudio del daño celular producido por isquemia cerebral, en un modelo de rata. Determinación de la presencia de apoptosis

 Cellular injury study caused by cerebral ischemia in a rat model. Determination of apoptosis presence

Alma Ortíz Plata, Carlos Sandoval, Paul Uribe, Jorge Guevara, Daniel Rembao,
Juan Nader, Fidel de la Cruz Hernández Hernández

 

Departamento de Neuropatología. Laboratorio de Enfermedades Neurodegenerativas del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía Manuel Velasco Suárez. Departamento de Patología Experimental, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. México D. F.

 

Correspondencia:
Alma Ortíz Plata.
Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía Manuel Velasco Suárez. Departamento de Neuropatología.
Insurgentes Sur 3877. Col. La Fama.
14269 México D. F.
E–mail: aortiz@innn.edu.mx

 

Recibido: 27 enero 2004
Aceptado: 12 marzo 2004

 

RESUMEN

La enfermedad vascular cerebral constituye una de las primeras causas de discapacidad y mortalidad en el mundo. En este trabajo, se analizó el daño celular isquémico por oclusión de la arteria cerebral media en ratas a distintos tiempos (5, 10, 12–15, 30 y 60 min), n diferentes regiones cerebrales (frontal, parietal, occipital e hipocampo), que fueron, analizadas por microscopia óptica, microscopia electrónica, LM–PCR (Ladder Assay–Polymerase Chain Reaction) y TUNEL (Terminal deoxinucleotidil transferasa mediated dUTP Nick End Labeling). A los 5 min se observaron cambios hipóxicos caracterizados por células de volumen reducido y núcleos picnóticos. A los 12 min aparecieron en todas las regiones cerebrales y con predominio en occipital e hipocampo, cambios sugestivos de apoptosis consistentes en células individuales con condensación de la cromatina, disminución de volumen celular y ausencia de edema. Al microscopio electrónico se observó condensación de la cromatina en algunas células. El LM–PCR mostró a partir de los 12 min de isquemia, la característica fragmentación en escalera del DNA que se encuentra en la apoptosis. La prueba de TUNEL fue positiva a los 12 min en hipocampo y lóbulo occipital. Estos resultados sugieren que la apoptosis activa, ocurre en las células cerebrales, en fases tempranas de la muerte neuronal isquémica a partir de los 12 min de isquemia focal.

Palabras clave: isquemia cerebral, apoptosis, muerte celular retardada, TUNEL.

 

ABSTRACT

The cerebral vascular disease is one of the main reasons of incapacity and mortality in the world. Here it was analyzed the cellular ischemic injury by middle cerebral artery occlusion in a rat model at several times (5, 10, 12–15, 30 and 60 minutes), in different cerebral regions (frontal, parietal, occipital and hippocampus), that were analyzed by light microscopy, electron microscopy, LM–PCR (Ladder Assay–Polymerase Chain Reaction) and TUNEL (Terminal deoxinucleotidil transferasa mediated dUTP Nick End Labeling). At five minutes hypoxic changes as loss of cytoplasmic volume and nuclear pyknosis were observed. At 12 minutes were found changes suggesting apoptosis such as individual cells with chromatin and cytoplasmic condensation but without edema in all cerebral regions, predominantly in occipital and hippocampus. Under electron microscopy so me cells with chromatin condensation were observed. LM–PCR technique shows the typical DNA ladder fragmentation, starting at 12 minutes. TUNEL test was positive in neurons at 12 minutes in occipital and hippocampus regions. These results suggest that apoptosis in cerebral cells start at 12 minutes after focal cerebral ischemia. It might evidence the presence of cellular active processes of neuronal death at early times of ischemia.

Key words: cerebral ischemia, apoptosis, delay cell death, LM–PCR, TUNEL.

 

La enfermedad vascular cerebral es una de las primeras causas de discapacidad y mortalidad en el mundo, en donde la isquemia constituye aproximadamente el 80% de los casos ¹ . Por tal motivo, se ha trabajado en identificar los mecanismos de daño celular producido por la isquémica. En la isquemia cerebral se desencadenan una serie de cambios bioquímicos y fisiológicos que causan daño a la célula. Estos cambios llevan a la muerte celular de manera inmediata por necrosis en el centro del infarto o tardía en la zona de penumbra isquémica. En esta producción de daño se ha propuesto que ocurren procesos de apoptosis, con base en diferentes investigaciones en las cuales se han encontrado proteínas que participan en la muerte celular por apoptosis como la proteína p53, endonucleasas y caspasas ^2–5. En este trabajo se estudió el daño celular que produce la isquemia cerebral focal en distintos tiempos en diferentes regiones del cerebro, buscando principalmente la activación de los procesos de la apoptosis.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

La isquemia cerebral focal del hemisferio izquierdo sin reperfusión, se produjo en un modelo de ratas wistar a diferentes tiempos (5, 10, 12–15, 30 y 60 min), mediante la oclusión de la arteria cerebral media por introducción de un hilo nylon monofilamento de calibre 3–0 ⁶ . Al término de cada tiempo los cerebros de las ratas fueron fijados por perfusión vía intracardiaca con paraformaldehído al 4% en amortiguador de fosfatos salino (PBS) 0.1M pH 7.2. A continuación se extrajeron los cerebros y se separaron las regiones frontal, parietal, occipital e hipocampo del hemisferio isquémico, cada una fue deshidratada e incluida en parafina; se les realizaron cortes de 4 µm de espesor, se tiñeron con hematoxilina y eosina ⁷ y se analizaron al microscopio óptico (Olympus H2). El mismo procesamiento se realizó en ratas que fueron sometidas al procedimiento quirúrgico sin producir isquemia (Sham) y en ratas intactas como control. En otro grupo de cortes de la región del hipocampo y occipital, con 12 minutos de isquemia cerebral focal, se realizó la técnica de TUNEL (Terminal deoxinucleotidil transferasa mediated dUTP Nick End Labeling), para el análisis in situ de la fragmentación del DNA (In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein, ROCHE, Mannheim, Germany), característica de la apoptosis, que fue analizada en un microscopio confocal (BioRad MRC 1024).

De otro grupo de ratas se obtuvieron muestras que fueron fijadas con glutaraldehído al 2.5% en PBS, postfijadas por 1 h en tetraóxido de osmio al 0.5% preparado en el mismo amortiguador, deshidratadas en alcoholes graduales de concentración ascendente e incluidas en resina epóxica (Epon 812, Merck) para su análisis en un microscopio electrónico EM10–A (Carl Zeiss, West Germany). Por último, en un tercer grupo de muestras de ratas con isquemia de 12 y 15 min, Sham y control, se realizó la extracción de DNA para el análisis de la fragmentación en escalera, por medio de la técnica de LM–PCR Ladder Assay (Kit ApoAlertTM, Clontech, Palo Alto CA. USA).

 

RESULTADOS

El análisis con la tinción de hematoxilina y eosina, a los 5 min mostró escasas células eosinófilas con núcleos picnóticos y edema citotóxico, indicativos de daño hipóxico. A los 10 min se presentaron cambios hipóxicos más marcados caracterizados por basófilia y encogimiento celular. A los 15 min se presentaron cambios más intensos, que incluyeron la aparición de grupos de neuronas con daño citotóxico y edema vascular en medio de regiones con células morfológicamente normales (células eosinófilas, con ligera disminución en el volumen citoplásmico, ligera alteración de la membrana nuclear y ausencia de edema citotóxico). Estas observaciones llevaron al análisis de los cambios en tiempos intermedios con el fin de encontrar indicios de la activación de los procesos de apoptosis. A los 12 min comenzaron a aparecer en todas las regiones cerebrales estudiadas, y con predominio en las regiones occipital e hipocampo, cambios sugestivos de apoptosis en células individuales caracterizadas por condensación de la cromatina, pérdida de volumen celular y ausencia de edema. La microscopía electrónica mostró también condensación de la cromatina en las células nerviosas. El estudio del rompimiento del DNA por medio de la técnica de LM–PCR mostró la fragmentación en escalera que se encuentra característicamente en la apoptosis, a partir de los 12 minutos de isquemia y la prueba in situ por medio de la técnica de TUNEL fue positiva también a los 12 minutos de isquemia en la región del hipocampo y lóbulo occipital.

Todas las observaciones realizadas se resumen en la tabla 1.

 

DISCUSIÓN

El daño celular por necrosis y por muerte celular retardada, como efecto de la isquemia cerebral, ha sido estudiado bajo diferentes tiempos y condiciones experimentales en distintos modelos animales. En estas investigaciones se han reportado cambios celulares relacionados con muerte celular por apoptosis en isquemia cerebral, pero a tiempos largos de reperfusión (desde minutos hasta días) ⁸. En este estudio se muestra un análisis del daño celular por isquemia cerebral focal a diferentes tiempos, valorado en un modelo experimental de isquemia cerebral focal sin reperfusión. Las leves alteraciones encontradas después de los primeros minutos de isquemia (0–5 min), se hicieron más marcadas conforme se avanzó en el tiempo (10 y 15 min) y se fueron encontrando mezcladas células con disminución del volumen citoplásmico y núcleos picnóticos con cromatina condensada, que sugerían signos de muerte celular por apoptosis ⁹. Al realizar el análisis en tiempos intermedios (10–15 min) se encontraron células individuales con estos cambios, lejos de los focos de necrosis y en la zona de penumbra isquémica. Estas evidencias sugirieron cambios celulares compatibles con apoptosis, que después fueron apoyados por el análisis de la fragmentación del ADN detectado de manera directa en el tejido por la técnica de TUNEL y molecularmente por la presencia de la escalera con el LM–PCR ¹⁰. Hay estudios que apoyan la presencia de apoptosis después de la inducción de isquemia cerebral focal de corta duración ^11,12 , pero en observaciones a diferentes tiempos de reperfusión y otros que muestran daño necrótico y presencia de células apoptóticas en regiones de daño isquémico moderado ¹³. En estos trabajos se sugiere que la presencia de muerte celular por apoptosis es producto de los mecanismos de daño desencadenados por la reperfusión. En este estudio se muestra la presencia de apoptosis desde los primeros minutos de comenzada la isquemia y antes de la reperfusión.

 

CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos en este estudio sugieren la presencia de apoptosis en células del hipocampo y de la región occipital a partir de los 12 min de isquemia focal, lo cual evidenciaría la participación de procesos celulares activos, desde fases tempranas de la muerte neuronal isquémica.

Este trabajo fue presentado en el VI Congreso Iberoamericano de Enfermedad Cerebrovascular, San José Costa Rica, septiembre del 2003.

 

AGRADECIMIENTOS:

Proyecto apoyado por CONACyT (756PM9506, MO–334).

 

REFERENCIAS

1. World Health Organization. Leading causes of mortality and burden of disease, estimates for 1999. Disease statistics. World Health Organization 2002.        [ Links ]

2. MacManus JP, Link MD. Gene expression induced by cerebral ischemia: An apoptotic perspective . J Cereb Blood Flow Metab 1997;17: 815–32.        [ Links ]

3. Yi Li, Chopp M, Powers C, Jiang N. Apoptosis and protein expression after focal cerebral ischemia in rat. Brain Res 1997; 765:301–12.        [ Links ]

4. Lee SH, Kim M, Kim YJ, Kim Y A, Chi JG; Roh JK, et al. Ischemic intensity influences the distribution of delayed infraction and apoptotic cell death following transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Res 2002; 956:14–23.        [ Links ]

5. Pfister Y, Sabios A, Vallet PG, Dubois–Dauphin M. Permanent cerebral ischemia induces sustained procaspase 9L increase not controlled by Bcl–2. Brain Res 2003; 966:26–39.        [ Links ]

6. Zea–Longa E, Weinstein PR, Carlson BS, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats, Stroke 1989; 20: 84–91.        [ Links ]

7. T.C. Allen. Hematoxylin and eosin. En Prophet E, Mills B., Arrington 1., Sobin L. (Eds.), Laboratory methods in histotechno–logy. Armed Forces Institute of Pathology, Washington, D.C., 1994: 53–8.        [ Links ]

8. Du C, Hu R, Csernansky CA, Hsu C, Choi DW. Very delayed infraction after mild focal cerebral ischemia a role for apoptosis? J Cereb Blood Flow Metab 1996; 16: 195–201.        [ Links ]

9. Mattson MP, Culmsee C, Yu ZF. Apoptotic and antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell Tissue Res 2000; 301: 173–87.        [ Links ]

10. MacManus JP, Buchañ AM, Hill IE. Global ischemia can cause DNA fragmentation indicative of apoptosis in rat brain. J Cereb Blood Flow Metab 1999;19:502–10.        [ Links ]

11. Renolleau S, Aggoun–Zouaoui D, Ben–Ari Y, Charriaut–Mariangue C. A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat, morphological change indicative apoptosis. Stroke 1998; 29:1454–61.        [ Links ]

12. Kametsu Y, Osuga S, Hakim AM. Apoptosis occurs in the penumbra zone during short–duration focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab 2003; 23 :416–22.        [ Links ]

13. MacManus JP, Hill IE, Huang ZG, Rasquinha 1, Xue D, Buchan AM. DNA damage consistent with apoptosis in transient focal ischemic neocortex. Neuroreport 1994;5:493–6.        [ Links ]