Identificación de los conceptos del área de Biología

La actividad comienza con la selección y troceado de una muestra biológica, que puede ser un vegetal (tomate), un hongo (champiñones), una muestra animal (saliva humana) o bacteriana. Este paso sirve para recordar que el material hereditario, ADN, es un atributo común a todos los seres vivos y a algunos agentes acelulares, como los virus. Esto permite abordar la diversidad de los seres vivos y sus niveles de organización (órgano -como el tomate completo-, tejidos -como los observados a partir del tomate en trozos- y células) e introducir el concepto de célula como unidad funcional y estructural de los seres vivos. Además, se puede abordar la localización del material genético: ¿Se encuentra en todos los tipos de células? ¿Se encuentra en algún tejido en particular? ¿Todas las células tienen ADN? Este diálogo permite responder a la pregunta: ¿De dónde se puede extraer ADN? Dado que el ser humano es uno de los temas centrales en todos los niveles educativos, este momento es adecuado para recordar que las células humanas más numerosas, los eritrocitos, no tienen núcleo celular (^{Sender et al., 2016}), lo que permite abordar el concepto de diferenciación celular.

Posteriormente se puede tratar la estructura celular, recordando que todas las células están rodeadas por una membrana grasa y además, en las células de plantas, hongos y bacterias, por una pared celular rígida. Conocer la composición y características de estas dos estructuras es imprescindible para comprender y poder iniciar el proceso de extracción: la composición grasa de las membranas y la rigidez de la pared celular determinan el método de ruptura celular idóneo. Si las células que forman la muestra tienen pared celular son más duras y, por tanto, es necesario utilizar un método mecánico para romperlas, como una batidora o un mortero. Mientras, que si solo tienen membrana plasmática, como las células animales, no es necesario realizar este paso y basta con utilizar detergente y agitar vigorosamente para disolverlas.

Las membranas biológicas, tanto la citoplasmática como las de los orgánulos celulares, están formadas fundamentalmente por lípidos que se organizan en forma de bicapa (Figura 1) debido a su carácter anfipático, concepto químico que se aborda en el siguiente apartado. Esta característica grasa de las membranas hace que un detergente sea una sustancia adecuada para disgregarlas. La homogeneidad en la composición química de las membranas no se mantiene en las paredes celulares, aunque sí su carácter rígido. Así, diferentes organismos presentan distinto componente principal en sus paredes celulares: quitina los hongos, peptidoglicano o mureína las bacterias y celulosa con lignina los vegetales.

Figura 1 Estructura de la bicapa lipídica que constituye las membranas biológicas (^{Gu, 2015}).  

Otros conceptos biológicos a desarrollar durante la práctica son dos aspectos muy relevantes de la molécula de ADN: su localización intracelular y su estructura (^{Llach y Vila, 2017}). El ADN se encuentra localizado principalmente en el núcleo celular, pero, en los organismos eucariotas, también está en las mitocondrias de animales, plantas y hongos, y en los cloroplastos de las plantas. Estos tres compartimentos celulares también están delimitados por membranas grasas, por lo que se pueden disolver utilizando detergente. Respecto a su estructura, el ADN tiene carga neta negativa debido a que los fosfatos, que forman parte de los nucleótidos que lo componen, quedan dispuestos hacia el exterior de la doble hélice (Figura 2). Conocer esta característica es esencial para comprender por qué el ADN es soluble en agua.

Figura 2 Estructura de la doble hélice de ADN. Los aniones fosfatos quedan dispuestos hacia el exterior de la molécula (^{Richards, 2016}).  

Finalmente, otro concepto biológico a comentar es el de enzima, o proteína que cataliza las reacciones químicas en los sistemas biológicos. La actividad enzimática es sensible a la temperatura y el pH, entre otros factores, por lo que ambos deben ser tenidos en cuenta en el proceso de extracción. Para optimizar la extracción de ADN el proceso debe realizarse a baja temperatura, lo que se consigue empleando agua fría y manteniendo los recipientes utilizados en una bandeja con hielo. La baja temperatura ralentiza la actividad enzimática, evitando que las moléculas biológicas, como el ADN, sean degradadas tras la ruptura de las membranas celulares que conlleva la liberación de los componentes subcelulares. En este punto cabe recordar que los lisosomas (en células animales) y las vacuolas digestivas (en hongos y vegetales) contienen enzimas que al ser liberadas provocan la degradación de las biomoléculas.

Identificación de los conceptos del área de Química

El primer concepto químico a tratar en la práctica es el de las cargas eléctricas de las moléculas, ya que estas son responsables de las interacciones electrostáticas. Cuando en una molécula son más numerosos los protones que los electrones su carga neta es positiva y se denomina ion positivo o catión. Sin embargo, cuando el número de electrones es superior al de protones, su carga neta es negativa y se denomina ion negativo o anión. Por otra parte, las moléculas eléctricamente neutras, con igual número de protones y electrones, según la distribución de cargas pueden ser polares (presentan una ligera separación de carga positiva y negativa en diferentes partes de la molécula), apolares (en las que no aparece esta distribución de cargas) o anfipáticas (con una región polar y otra apolar, como los lípidos de las membranas biológicas) (^{Gillespie, 2006}). En un disolvente, la carga y polaridad de las moléculas es importante ya que le confiere propiedades de solubilización de diferentes solutos (^{Ortolani et al., 2012}).

En la disolución de lisis el agua actúa como disolvente, formando una mezcla homogénea, ya que las moléculas polares que la forman establecen interacciones electrostáticas (a través de puentes de hidrógeno) unas con otras y con todas las moléculas cargadas o polares. Para explicar el concepto de disolución polar se puede recurrir a la disolución de cloruro sódico (NaCl) o sal común en agua. La sal es una red cristalina formada por átomos de Cl^- y Na⁺, unidos mediante un enlace iónico (atracción electrostática entre los iones de distinto signo). El agua actúa sobre la sal estableciendo puentes de hidrógeno con el Cl^- y el Na⁺, venciendo las fuerzas intermoleculares que los mantienen unidos e hidratándolos (^{Ortolani et al., 2012}) (Figura 3). Lo mismo ocurre con el ADN, que forma puentes de hidrógeno con el agua a través de las cargas negativas de sus fosfatos. De esta manera, se puede comprender que el ADN y los iones Cl^- y Na⁺ permanecerán disueltos mientras estén interaccionado electrostáticamente con el agua, y dejarán de estar disueltos si, en lugar de interaccionar con el agua, lo hacen con los iones opuestos (el Cl^- con el Na⁺ y el ADN con el Na⁺), formado de nuevo una red cristalina. Este proceso es necesario para comprender por qué el ADN es soluble en agua y cómo, posteriormente, se altera su solubilidad al añadir alcohol.

Figura 3 Disolución polar de Na+ en agua. Cada catión Na+ queda rodeado de moléculas de agua debido a la ligera carga negativa de estas (^{Keall, 2008}).  

En la disolución de lisis, la sal común se encuentra en una concentración saturante (en exceso respecto al disolvente), lo que aumenta la fuerza iónica: debilita las interacciones iónicas entre biomoléculas (como entre el ADN y las proteínas asociadas a él) y aumenta las interacciones hidrofóbicas entre proteínas, provocando su coagulación (^{Cohn, 1925}). El papel de la sal común también es clave en la fase de precipitación del ADN, que se produce tras añadir lentamente el alcohol frío sobre la pared de un recipiente estrecho en el que se encuentra el caldo molecular. En la interfase etanol-agua, las moléculas de alcohol se unen a las de agua, desplazando así tanto el agua que interacciona con el ADN y como la que interacciona con los iones de Na⁺, y que hacía posible su disolución. Este desplazamiento permite que algunos iones Na⁺ se unan a los iones fosfato del ADN, neutralizando su carga, perdiendo su solubilidad y facilitando la precipitación del ADN como filamentos blancos (color debido a la red cristalina que forma con el NaCl).

Continuando con el concepto de polaridad química, los fosfolípidos de las membranas celulares son el ejemplo de molécula anfipática más característico de los sistemas biológicos. Las moléculas anfipáticas en agua forman micelas o bicapas debido a la unión de sus partes apolares entre ellas y de sus partes polares con el agua (Figura 4). Estas bicapas lipídicas constituyen la estructura básica de las membranas biológicas. El detergente lavavajillas, otro de los componentes de la disolución de lisis, también está formado por moléculas anfipáticas.

Figura 4 Estructuras formadas por moléculas anfipáticas en medio acuoso: bicapa (1) y micela (2). En ambos casos las regiones polares (P) se mantienen en contacto con el agua, mientras que las regiones apolares (U) contactan entre ellas (^{Gilbert, 2003}).  

Esta característica le permite solubilizar la grasa a través de la formación de micelas (^{Novelo-Torres y Gracia-Fadrique, 2005}): estructuras moleculares en las que las partes apolares de las moléculas de detergente interactúan con la grasa, disolviéndola y manteniéndola en suspensión, mientras que las partes polares interactúan con el agua. Cuando el detergente disuelve las membranas biológicas, se introduce entre los fosfolípidos de las membranas, rompiéndolas y formando micelas solubles (Figura 5). Con esta explicación, se comprende cómo se lisan las membranas grasas y se liberan las biomoléculas, entre ellas el ADN.

Figura 5 Micela formada por el detergente al disolver los lípidos de una membrana biológica (^{Krcarras, 2008}).  

La disolución de lisis también contiene bicarbonato sódico. Para comprender su papel en el proceso de extracción de ADN es necesario abordar dos conceptos químicos clave: el concepto de pH y el concepto de buffer, tampón o amortiguador químico. El pH es la medida de la concentración de protones de una disolución acuosa, que determina el grado de acidez o alcalinidad de esta: las soluciones ácidas (pH=1-7) presentan una mayor concentración de protones que las básicas o alcalinas (pH=7-14). En las células, es muy importante mantener el pH dentro de un intervalo para preservar la estabilidad y funcionalidad de sus biomoléculas. Por esta razón, los líquidos fisiológicos contienen tampones que mantienen el pH constante ante la formación o adición de ácidos o bases. Los tampones son mezclas de un ácido débil (una sustancia que disocia protones pero que no se ioniza por completo, como el ácido carbónico, H₂CO₃) y su base conjugada (esta misma sustancia ionizada, como el anión bicarbonato, HCO₃ ^-), que permiten estabilizar el pH en valores próximos a su pKa (una medida de la constante de disociación del ácido). El pKa del H₂CO₃ es 6.1 a temperatura fisiológica. Esta mezcla de H₂CO₃ y HCO₃ ^- constituye el tampón bicarbonato sódico (Figura 6), que juega un papel importante en el mantenimiento del pH de diferentes sistemas biológicos, desde los océanos a la sangre y otros fluidos fisiológicos. Así, en la práctica de extracción, el bicarbonato sódico actúa manteniendo el pH constante (pH=6.5, aproximadamente), evitando la degradación de las biomoléculas como el ADN. El intervalo de pH que regula un amortiguador depende de su cantidad (por eso se añade a la disolución de lisis bicarbonato sódico en exceso).

Figura 6 Disociación del ácido carbónico dando lugar al anión bicarbonato y un protón (derecha) y a dióxido de carbono y agua (izquierda).  

Identificación de los conceptos del área de Física

Un concepto clave en Física es el de densidad o cantidad de masa en un determinado volumen de sustancia. Cuando se juntan compuestos inmiscibles de diferentes densidades, los compuestos menos densos quedan encima de los más densos. Si los compuestos son miscibles, es necesario que no se mezclen al juntarlos, para que queden separados por densidades. Conocer esto permite entender por qué, al añadir el alcohol en la última fase del proceso de extracción, este queda por encima del caldo molecular. El alcohol es menos denso que el agua, por lo que si se añade alcohol con delicadeza sobre el agua para evitar que se mezclen, el alcohol se mantendrá flotando sobre el agua. Es muy importante dejar resbalar lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, para que quede en la superficie del agua y no se mezcle con ella, ya que ambos compuestos son miscibles. Además, en general, la densidad de una sustancia aumenta a medida que la temperatura disminuye. Así, el alcohol añadido debe estar frío (a -20 ^oC, temperatura de un congelador), ya que al contactar con el agua la enfriará, haciendo que ésta sea más densa y evitando, por tanto, que se mezclen el alcohol y el agua. Mencionar este fenómeno da pie a discutir una característica fundamental del agua para la biosfera: aunque su densidad aumenta a medida que desciende la temperatura hasta los 2-4 ^oC, su densidad disminuye a medida que la temperatura desciende hasta su punto de congelación (0 ^oC). Por esta razón el hielo flota sobre el agua líquida, permitiendo el desarrollo de la vida bajo ríos, lagos y mares con superficies heladas.

Otro concepto necesario para comprender el fundamento científico de la extracción de ADN es la clasificación de los fenómenos físico-químicos en función de si liberan o absorben energía. Así, aquellos procesos, generalmente espontáneos, en los que se libera energía en forma de luz o calor se denominan exotérmicos, como la combustión o la disolución de ácido sulfúrico en agua; mientras que en los procesos endotérmicos el sistema absorbe energía, como en la fotosíntesis. Además, es preciso abordar cómo varía la solubilidad de los gases disueltos en líquidos en relación a la temperatura: conforme aumenta la temperatura disminuye la solubilidad de éstos (^{Ceretti y Zalts, 2000}). La formación de una red cristalina de sal y ADN, y su consiguiente precipitación, es un proceso exotérmico. El calor liberado hace que aumente ligeramente la temperatura, lo que resulta en una disminución de la solubilidad del oxígeno del agua y en la formación de burbujas. Estas burbujas se observan junto a los filamentos blancos en los que precipitan la sal y el ADN (en la zona en la que se produce la reacción exotérmica), haciendo que los filamentos de ADN floten.