Bioensayos

Cuatro bioensayos se ejecutaron, utilizando los extractos acuoso pH 7 y pH 5, con la especie aceptora A. hypochondriacus o P. oleracea en placas de Petri. El papel absorbente (sanitas) sirvió para formar una cámara húmeda. Se usaron 24 semillas por placa y se les asperjó 5 mL del extracto, o solo agua en el caso del control absoluto. Se mantuvieron entre 3 - 4 días (72 horas) para garantizar la germinación de las semillas y si formaban plantas de buen tamaño. A cada placa se les añadió 1.0 mL de agua destilada estéril cada día para humedecer el papel absorbente. Se estableció el control del fotoperiodo con un sensor ajustando 16 h luz y 8 h oscuridad a temperatura ambiente de 25 ºC ± 2. Los otros dos bioensayos fueron usando extracto etanólicos pH 5.0, con las mismas especies de A. hypochondriacus o P. oleracea en placas de Petri, aplicado las dosis (0,1,2 y 3.33 %) y un control positivo.

Actividad alelopática del extracto acuoso de I. batatas con un pH ligeramente alcalino sobre semillas de A. hypochondriacus.

La germinación de A. hypochondriacus no se vio afectada por ninguna de las concentraciones, no hubo diferencia significativa entre los tratamientos (p > 0.05), el extracto no influyó en el proceso fisiológico de germinación (GT) (Tabla 2). Por otro lado, el índice de velocidad de germinación (IVG), evidenció un ligero retraso en la cantidad de semillas germinadas/día de un tratamiento a otro, se demostró algunas diferencias significativas entre los tratamientos (p< 0.05).

Fue más notable el efecto alelopático positivo sobre la longitud radicular de la misma especie aceptora, en el tratamiento 3.33 % donde se aplicó una concentración de (3.33 %) de extracto acuoso. Lo que influyó relativamente mejor en esta variable. Aunque en realidad el tratamiento (2 %), donde se aplicó una concentración de (2 %) y el tratamiento (3,33 %) no difirieron, por lo que ambas concentraciones estimularon considerablemente la longitud de la radícula (LR) en comparación con el tratamiento control, aunque de hecho el efecto estimulante se evidenció a partir de la menor dosis (1 %).

Resultados similares obtuvo ^{Silva (2013)} cuando utilizó lixiviados acuosos (pH 7.2) a partir de diferentes tejidos secos de zacate (P. ciliare). Tales lixiviados no generaron inhibición en la germinación de A. hypochondriacus entre 24 y 48 horas, con germinación cercana al 100 %. Solo hubo efecto en el tamaño de la radícula en la misma especie, durante las primeras 24 horas, pero no se mantuvo al llegar a las 48 horas. ^{González (2011)}, quien aplicó extracto acuoso de E. gomphocephala a concentraciones de (10, 30, 50 y 100 %) sobre semillas de A. hybridus, observó efectos significativos entre los tratamientos en cuanto a la germinación: Sin embargo, registró un incremento de la germinación de A. hybridus, cuando se aplicó extracto en concentraciones altas (50 y 100 %). Según ^{Torres et al. (2003)}, I. batatas aplicada directamente al suelo en concentraciones (0, 75 y 100 %) sobre A. crassipes Schlecht), mostraron solo una mayor concentración inhibitoria significativamente sobre la germinación, pero sin efecto alguno sobre la altura de las plantas.

Actividad alelopática del extracto acuoso de I. batatas con un pH ligeramente ácido sobre semillas de A. hypochondriacus y P. oleracea

La germinación (GT), el IVG y longitud radicular (LR) de ambas especies fueron afectadas, conforme aumentaba la concentración del extracto, el efecto inhibitorio fue más drástico, sobre todo con la concentración de extracto acuoso más alta (3.33 %), la que correspondió al tratamiento (3.33 %) y al control (C+). Para ambos tratamientos, no hubo diferencias significativas respecto a las variables respuesta (Tabla 3). Sin embargo, se puede inferir, que la dosis (3.33 %) obtuvo mejores resultados de inhibición, debido a que el extracto acuoso de ese mismo tratamiento, fue obtenido con partes vegetativas del camote, mientras que el extracto acuso del control positivo se obtuvo a parir de hojas y tallos.

Este efecto pudo atribuirse a compuestos fenólicos presentes en el camote. Al respecto, estudios realizados por ^{Hernández et al. (2015)}, afirmaron que el efecto inhibitorio del camote, está estrechamente relacionado con la parte de la planta que se utilice y el tipo de extracto. Sus resultados, fueron con extracto acuoso de camote I. batatas (L.) Lam. (CEMSA 78-354). Cuando aplicaron el extracto sobre semillas de A. spinosus y P. oleracea a 1 % y el control, obtuvieron efectos tanto de estimulación como de inhibición en dependencia de la parte de la planta utilizada. En el tamizaje fitoquímico los aleloquímicos presentes en camote, como los compuestos fenólicos, estaban concentrados en la inflorecías, seguido del follaje (Figura 1).

Figura 1 Semillas de A. hypochondriacus tratadas con extracto acuoso ligeramente ácido a diferentes concentraciones. Longitud radicular (LR) y velocidad de germinación (IVG), indicadores del efecto inhibidor. a) Semillas sin tratar: b) dosis 1 % p/v, c) dosis 2% /v ,d) dosis 3.33 % p/v, e) tratamiento Control (+ 3.33 % p/v) .  

Figure 1. Seeds of A. hypochondriacus treated with slightly acid aqueous extract at different concentrations. Root length (LR) and germination speed (IVG), indicators of the inhibitory effect. a) Untreated seeds: b) dose 1% p/v, c) dose 2 % /v, d) dose 3.33 % p/v, e) Control treatment (+ 3.33 % p/v). 

De acuerdo con ^{Latif et al. (2017)}, la actividad alelopática positiva o negativa de los compuestos fenólicos o en general de los aleloquímicos, depende directamente de su concentración, en especial con dosis bajas, que suelen presentar efecto estimulativo. Lo que coincide con los resultados obtenidos para A. hypochondriacus y P. oleracea, en el caso de germinación, obtenidos a concentraciones de (1 y 2 %), muy cercanos al tratamiento control.

No hubo diferencias significativas entre esos tratamientos, el mejor efecto inhibitorio se mostró hasta la mayor concentración, lo mismo paso con la longitud radicular, en general hubo diferencias significativas entre los tratamientos de ambas especies. En A. hypochondriacus la longitud radicular del control fue muy similar a las de dosis menores (1 y 2 %) ya que los valores fueron muy cercanos y en efecto lo fueron, entre el tratamiento (control) y al (1 %) no hubo diferencia ni entre el control y la dosis (2 %), sin embargo, el mejor efecto estimulatorio se evidenció con la concentración de 2 %, pero la longitud radicular fue inhibida con el tratamiento aplicado a 3,3 % y el control (Tabla 4).

En el caso de P. oleracea el mejor efecto positivo radicular ocurrió, con la menor dosis (1 %). La dosis de 2 %, promovió la inhibición considerablemente, en cuanto a la longitud radicular, mientras que de la misma forma se expresó el mejor efecto inhibitorio, con la mayor concentración del extracto.

En cuanto al índice de velocidad de germinación (IVG) para ambas especies, fue muy notorio el retraso de germinación, la cantidad de semillas/día disminuía paulatinamente conforme aumentaba la concentración del extracto y de igual manera hubo diferencias significativas entre los tratamientos. A grandes rasgos, los resultados indicaron que P. oleracea fue la especie de arvense más sensible frente al efecto alelopático del extracto acuoso de I. batatas. En relación con esto, ^{Torres et al. (2003)} mencionó que algunos de los aleloquímicos responsables de los efectos estimulantes y de inhibición se deben a compuestos fenólicos como el ácido cafeico y los flavonoides epigenina y naringenina, encontrados en partes de la planta del camote. Mismos que son estimulantes de las AIA- oxidasa, por lo que reducen los niveles de auxina (AIA) y por ende disminuye el crecimiento.

Por el contrario, derivados fenólicos como el ácido clorogénico y flavonoides como la quercetina y rutina, poseen la capacidad de estimular el crecimiento al inhibir la actividad de las AIA oxidasa. Otros investigadores también han afirmado que en el extracto acuoso de I. batatas, están presentes ácidos fenólicos, los cuales son conocidos por inhibir tanto la síntesis de proteínas como de hormonas inclusive tienen la capacidad de modificar la composición ultraestructural celular, la división celular, la estabilidad de la membrana celular, la biosíntesis de clorofila y la absorción de iones (^{Soni et al., 2019}).

Mientras que ^{Hernández et al. (2017)} comprobaron que la actividad alelopática de esta especie fue detectada mediante un microensayos, lo que corrobora los resultados en estos experimentos.

Por otra parte, recientemente ^{Pérez-Peralta et al. (2019)} informó también el efecto alelopático de Ipomoea purpurea L. Roth una especie cercana a la usada en estos experimentos.

^{Scavo et al. (2019)} obtuvieron efecto alelopático similares, con extractos acuosos de hojas de tres variedades de Cynara cardunculus L. (alcachofa, cardo cultivado y silvestre), sobre el crecimiento de plántulas de A. retroflexus y P. oleracea. Estos también, mencionaron que los efectos alelopáticos fueron diferentes en relación al genotipo de las especies aceptoras, siendo P. oleracea la más susceptible.

La longitud radicular (LR) fue la variable más afectada en el bioensayo (- 32.6 %). Es importante resaltar que se utilizó una única concentración de los extractos (80 %) y solo se comparó su actividad alelopática respecto al control que fue agua bidestilada (Figura 2).

Sobre los metabolitos secundarios que se identificaron y al que se atribuyó el efecto alelopático fueron: apigenin y luteolin 7-O-glucorodine (solo detectado en el cardo silvestre), apigenin 7-O-glucoside presente en alcachofa, así como también 11,13-dyhidro-deacylcynaropicrin y 11,13-dihydroxi-8-deoxygrosheimin (característicos del cardo cultivado) (^{Scavo et al., 2019}).

Figura 2 Semillas de P. oleracea tratadas con extracto acuoso ligeramente ácido a diferentes concentraciones. Lon-gitud radicular (LR) y velocidad de germinación (IVG), indicadores del efecto inhibidor. a) Semillas sin tratar: b) dosis 1 % p/v, c) dosis 2 % /v ,d) dosis 3.33 % p/v, e) tratamiento Control (+ 3.33 % p/v) . Figure 2. P. oleracea seeds treated with slightly acidic aqueous extract at different concentrations. Root length (LR) and velocity indicators of the inhibitory effect. a) Untreated seeds: b) dose 1% p/v, c) dose 2 % /v, d) dose 3.33 % p/v, e) Control treatment (+ 3.33 % p/v). 

También ^{El-Shora y El-Gawad (2014)}, en bioensayos de germinación para evaluar el efecto alelopático de extracto acuoso de (Lipinus termis L.) sobre P. oleracea, señalaron que el porcentaje de germinación de P. oleracea se redujo considerablemente cuando aumentaba la concentración del extracto, las concentraciones que se aplicaron fueron (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1 mg/mL), encontraron que el (%) de germinación se redujo alrededor del 78.8 % respectivamente después de aplicar la concentración más alta de extracto acuoso. Sin embargo, los autores no identificaron los aleloquímicos responsables de tal efecto. Resultados similares obtuvo ^{Al-Harbi (2018)}, al estudiar el efecto alelopático de extractos acuosos de hojas de Rhanterium epapposum y Salsola imbricata a distintas concentraciones (0, 20, 40 y 60 %) sobre la germinación y longitud radicular y de brotes de dos especies de arvenses (P. oleracea y C. murale). Se demostró un mayor efecto alelopático negativo en la germinación de C. murale cuando se aplicaron los extractos de mayor concentración (40 y 60 %) sin embargo fue más notorio el efecto alelopático negativo a la mayor concentración (60 %) sobre la germinación de semillas de ambas arvenses. También se evidencio que tanto la longitud radicular como la de los brotes de P.oleracea fueron más sensibles a la alelopatía del extracto de hoja de R. epapposum en comparación con el extracto de hoja de S. imbricata.

Actividad alelopática del extracto etanólico de I. batatas sobre semillas de A. hypochondriacus y P. oleracea.

En este último bioensayo se pudo determinar que A. hypochondriacus fue mucho más sensible que P. oleracea respecto con el extracto etanólico, con evidente efecto alelopático negativo (inhibición) total, en la germinación desde la dosis de (1 %). Solo hubo germinación (GT) en el tratamiento control que fue de 98.61 % (Figura 3).

Figura 3 Semillas de A. hypochondriacus tratadas con extracto etanólico a diferentes concentraciones. Radículas no visibles en semillas, indican que hubo efecto. a) Semillas sin tratar: b) dosis 1 % p/v, c) dosis 2 % p/v, d) dosis 3.33 % p/v, e) tratamiento Control (+ 3.33 % p/v). Figure 3. A. hypochondriacus seeds treated with ethanol extract at different concentrations. Radicles not visible in seeds indicate that there was an effect. a) Untreated seeds: b) dose 1 % p/v, c) dose 2% /v, d) dose 3.33 % p/v, e) Control + (3.33 % p/v). 

Sin embargo, para P. oleracea el efecto que la inhibición sobre la germinación, tuvo un aumento conforme aumentó la concentración del extracto etanólico, con diferencias significativas entre los tratamientos (p < 0.05) (Tabla 5).

Al igual que para el IVG el efecto fue inversamente proporcional a la concentración del extracto. La cantidad de semillas germinadas por día, fue disminuyendo conforme aumentaba la concentración del extracto, en cuanto a la longitud radicular (LR) de esa misma especie de arvense.

También se mostró diferencias significativas entre los tratamientos, con efecto inhibitorio que comenzó a notarse desde la dosis de 2 %, a 3.33 %, con aumento ligero del tamaño, pero sin diferencias entre los dos tratamientos mencionados (Figura 4).

Figura 4 Experimento 5- Semillas de P. oleracea tratadas con extracto etanólico a diferentes concentraciones. Radículas visibles en semillas, indican que no hubo efecto. a) Semillas sin tratar: b) dosis 1 % p/v, c) dosis 2 % /v ,d) dosis 3.33 % p/v, e) tratamiento Control (+ 3.33 % p/v) . Figure 4. Experiment 5. P. oleracea seeds treated with ethanol extract at different concentrations. Visible radicles in seeds, indicate that there was no effect. a) Untreated seeds: b) dose 1 % p/v, c) dose 2 % /v, d) dose 3.33 % p/v, e) Control + (3.33 % p/v). 

El mejor efecto inhibitorio resultó cuando se aplicó el tratamiento control (3,33 %), aunque no hubo diferencia con la dosis 2%, mucho mejor tal efecto alelopático negativo, por otro lado, el tratamiento control, evidenció mejor efecto inhibitorio que el tratamiento (3,33 %), aunque se refiere a una misma dosis, pero con posibles diferencias, con las partes de la planta que se utilizaron para obtener cada extracto.

Los metabolitos implicados con este efecto, posiblemente se encuentren en mayor abundancia en las hojas y tallos, pero en general los resultados del efecto alelopático negativo fueron satisfactorios.

Resultados similares obtuvo ^{Hernández (2016)}, al evaluar los efectos alelopáticos de extractos acuosos y etanólicos de I. batatas (hojas, tallos raíces e inflorencias) sobre P. oleracea y A. spinosus a concentraciones de (5 y 10 %). Este mostró un efecto inhibitorio sobre P. oleracea con extracto etanólico (5 %) a partir de hojas, al (10 %) con tallos y (10 %) con hojas de camote mostraron diferencias significativas respecto al control y testigo. Por otro lado, no hubo germinación de las semillas de A. spinosus (inhibición total) al aplicar las concentraciones (1,5 y 10 %) de extracto etanólico obtenido a partir de hojas, así como también a la concentración de 10 %, a partir de inflorencias, tallos, corteza y follaje.

Por otro lado, se han empleado extractos etanólicos de Tagetes lucida (pericón) a concentraciones de 100, 630 y 1000 ppm para evaluar la germinación y crecimiento radicular de A. hypochondriacus a partir de un bioensayo en placas de Petri, encontrándose que dicho extracto a la mayor concentración (1000 ppm) inhibió al 100 % la germinación de la arvense antes mencionada (^{Torres, 2021}).

En condición in vitro el efecto fitotóxico de extractos de fruto de chile manzano (C. pubescens) a diferentes concentraciones sobre A. hybridus, mostraron inhibición sobre la germinación, a partir de dosis de 5 % hasta 20 %, con evidente reducción entre 98 - 99 % respectivamente (^{García et al., 2013}), en este caso fueron identificados un alcaloide (capsaicina), implicado en el efecto inhibitorio, junto a la acción sinérgica de diferentes alcaloides.

Según ^{Motmainna et al. (2021)} los alcaloides actúan inhibiendo la germinación de semillas, así como el crecimiento de algunas plantas, la toxicidad de estos compuestos depende específicamente como en todos los aleloquímicos, de la dosis, además de la sensibilidad de la especie diana, del sitio de acción y sin duda también tiene mucho que ver la etapa de desarrollo del organismo, lo que corrobora los resultados expuestos en los bionesayos etanolicos y acusos.

En cuanto a P. oleracea,^{Erez y Fidan (2015)} obtuvieron resultados muy similares, con el efecto alelopático detectado en extracto etanólico de Salvia macrochlamys (hojas y tallos), sobre la germinación de la arvense antes mencionada. En este se informó también, que la germinación fue inhibida cuando se expuso sobre las semillas extracto a concentraciones mayores a 2.5 %, con efecto alelopático negativo, que fue significativamente mayor con el aumento de la concentración (^{García et al., 2013}). Estos infirieron que los esto podía deberse a la alta concentración de compuestos fenólicos y flavonoides, pero atribuyeron los efectos principalmente, a ácidos grasos presentes en el extracto de S. macrochlamys. Y mencionan que los ácidos grasos, podría estar vinculado con la absorción de las semillas, que interfieren enzimas como las lipasas y otras como isocitrato liasa en los cotiledones.

El efecto de un extracto etanólico de Paspalum maritimum, obtenido a partir del tallo y raíz de esta contribuyeron a una disminución en la germinación y longitud radicular (LR) en P. oleracea (^{Pereira et al., 2019}). Indicando tuvo un efecto específicamente sobre la elongación y división celular, cuanto menor sea el IVG, el tiempo necesario para germinar será mayor. Estos llegaron a la conclusión que el extracto etanólico crudo y las fracciones obtenidas con cloroformo y hexano presentaron mayor capacidad extractiva de los alelo- químico, sin embargo, aunque determinaron el potencial osmótico del extracto etanólico, entre -0.015 y -0.126 MPa, no mencionaron nada respecto al pH.