Notas de investigación

 

Actividad antagónica de filtrados de Bacillus subtilis contra Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)*

 

Antagonistic activity of Bacillus subtilis vs Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)

 

Esaú Ruiz-Sánchez¹, Miguel Ángel Mejía-Bautista¹, Jairo Cristóbal-Alejo¹, Alberto Valencia-Botín² y Arturo Reyes-Ramírez^1§

 

¹ Instituto Tecnológico de Conkal-División de Estudios de Posgrado e Investigación. Antigua carretera Mérida-Motul, Conkal, km 16.3, Yucatán, México. C. P. 97345. Tel. (999) 9124135. (esauruizmx@yahoo.com.mx, mike_221084@hotmail.com, jairoca54@hotmail.com). ^§Autor para correspondencia: areyes.itconkal@gmail.com.

² Universidad de Guadalajara-Centro Universitario de la Ciénega. Av. Universidad 1115, Col. Linda Vista, Ocotlán, Jalisco. C. P. 47810. (alberto.valencia@cuci.udg.mx)

 

* Recibido: marzo de 2014
Aceptado: junio de 2014

 

Resumen

Colletotrichum gloeosporioides es un hongo fitopatógeno que causa pérdidas considerables en frutales tropicales, principalmente por producir tizones foliares y pudrición de frutos en postcosecha. Las bacterias del género Bacillus son una alternativa para el control de enfermedades causadas por este hongo. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antagónica en pruebas de confrontación directa y mediante el uso del filtrado del cultivo de B. subtilis nativas del sureste de México. En pruebas de confrontación directa antagonista-patógeno, las cepas de Bacillus mostraron capacidad de inhibición de crecimiento de C. gloeosporioides entre 62 y 80%, con halos de inhibición de 0.20-0.88 cm. Con los filtrados de los cultivos bacterianos tratados con calor, se observó que todas las cepas de Bacillus inhibieron el crecimiento de C. gloeosporioides entre 13 y 42% y se observaron halos de inhibición de 0.13-0.26 cm. Los filtrados de cultivos bacterianos de cinco de los aislados tuvieron efecto en la inhibición de germinación de conidios, la cepa CBCC2 causó 70% de inhibición. Las cepas CBCC2, CBRF24, CBCK47 y CBMN22 tuvieron actividad inhibitoria, tanto en confrontación directa como en la evaluación de los filtrados de cultivos bacterianos, lo que indica el potencial de estas cepas en el control de C. gloeosporioides.

Palabras clave: Bacillus subtilis, Colletotrichum gloeosporioides, antagonismo, halos de inhibición.

 

Abstract

Colletotrichum gloeosporioides is a phytopathogenic fungus that causes considerable losses in tropical fruits, mainly for producing leaf blights and fruit rots in postharvest. Bacteria of the genus Bacillus are an alternative for the management of diseases caused by this fungus. The aim of this study was to evaluate the antagonistic activity in direct comparison tests and using the culture B. subtilis, native of south-eastern Mexico. For antagonist testing, pathogen direct confrontation, Bacillus strains showed growth inhibition ability of C. gloeosporioides from 62 and 80%, with inhibition zones of 0.20 to 0.88 cm. With the bacterial culture treated with heat, it was observed that all Bacillus strains inhibited the growth of C. gloeosporioides from 13 to 42%, and inhibition halos were observed from 0.13 to 0.26 cm. Bacterial culture of five isolates had inhibition effect on the germination of conidia, the CBCC2 strain caused 70% inhibition. Strains CBCC2, CBRF24, CBCK47 and CBMN22 had inhibitory activity, both in direct confrontation as in the evaluation of bacterial culture, indicating the potential of these strains in the management of C. gloeosporioides.

Keywords: Bacillus subtilis, Colletotrichum gloeosporioides, antagonism, inhibition halos.

 

Introducción

El hongo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) es uno los patógenos de plantas más comunes y de mayor distribución en el mundo, causante de la antracnosis (Chakraborty et al., 1997), que es considerada la más importante enfermedad de frutos en regiones tropicales y subtropicales. C. gloeosporioides se presenta en una amplia gama de hospedantes como chirimoya (Annona cherimola Mill) (Villanueva-Arce et al., 2008), aguacate (Persea americana Mill) (Montero-Talavera et al., 2010), mango (Mangifera indica L.) (Lakshmi et al., 2011) y papaya (Carica papaya L.) (Santamaría-Basulto et al., 2011). Este patógeno se controla con el uso de fungicidas químicos que elevan costos de producción, contaminan el ambiente, presentan riesgos de residuos en productos cosechados y ocasionan resistencia en el patógeno (Lewis y Papavizas, 1991).

La utilización de microorganismos en el control biológico del patógeno es una alternativa eficiente y ecológica que contribuye al desarrollo de una agricultura sostenible, ya que disminuye los efectos inherentes al uso de plaguicidas químicos (Whipps, 2001). Bacterias del género Bacillus presentan potencial debido a su capacidad para ejercer actividad antagónica mediante competencia, producción de antibióticos (Compant et al., 2005, Kim et al., 2010), y producción de enzimas líticas como quitinasas (Compant et al., 2005).

Las especies de Bacillus se han usado para el control de patógenos del suelo y raíces (Fernández-Larrea, 2001). Dos aislados de B. firmus inhibieron el crecimiento micelial in vitro de C. gloeosporioides aislado de papaya cv. Maradol roja en 75.32 y 69.17% a las 96 h (Baños-Guevara et al., 2004). Cinco bacterias formadoras de endosporas aisladas de rizósfera de plantas ornamentales inhibieron de 52 y 58% a C. gloeosporioides, observándose una zona de lisis interna del hongo (Orberá et al. 2009). El objetivo del presente estudio fue evaluar la capacidad antagónica in vitro de cepas nativas de Bacillus subtilis por la inhibición del crecimiento micelial y el efecto del filtrado libre de células en C. gloeosporioides.

 

Microorganismos utilizados

Se utilizaron siete cepas de B. subtilis pertenecientes a la colección del Laboratorio de Microbiología del Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán, México, las bacterias fueron aisladas de suelo de distintas localidades de Yucatán y Campeche. Las bacterias se activaron en agar nutritivo, se verificó su forma bacilar, producción de endosporas, catalasa y tinción de Gram positivo posteriormente se incubaron hasta su autólisis a 28 ºC por 4 días, el cultivo autolisado se conservó en refrigeración a 4 °C hasta su uso. El patógeno C. gloeosporioides se aisló de frutos de papaya Maradol, fue aislado por medio de siembra de cortes de tejido infectado y sano en medio agar papa-dextrosa (PDA) e incubados a 28 ºC (Herrera-Parra et al., 2011). El patógeno se resembró y se mantuvo en PDA hasta su uso.

 

Actividad antagónica in vitro por confrontación directa

Los bioensayos de confrontación antagonista-patógeno se llevaron a cabo en medio de PDA. Secciones de 0.5 cm de diámetro de crecimiento activo del hongo fitopatógeno se sembraron en el centro de cajas Petri, se inocularon suspensiones (1x10⁷ UFC) de las cepas bacterianas en cuatro puntos alrededor del hongo a una distancia de 2 cm. Como testigo se utilizó cajas Petri con el hongo patógeno sin la presencia de la cepa bacteriana todas las cajas se incubaron a 28 °C. Se midió el crecimiento micelial del hongo fitopatógeno a los siete días y se calculó el porcentaje de inhibición del patógeno mediante la fórmula PICR= (R1 - R2)/R1 * 100, donde PICR es el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial, R1 es valor promedio del radio de la colonia de referencia y R2 es el valor promedio del radio de la colonia inhibida por las bacterias (Ezziyyani et al., 2004). Se determinó el halo de inhibición, para esto se midió la zona de inhibición de crecimiento entre la colonia fúngica y las cepas bacterianas que se formaron alrededor del hongo, las mediciones se registraron en cm de inhibición.

 

Actividad antagónica in vitro del filtrado bacteriano

Las cepas de B. subtilis se cultivaron en caldo papa dextrosa, se utilizaron 24 g de medio de cultivo por litro de extracto de papa (300 g de papa cruda por L de agua, hervida por 15 min). Para el cultivo de cada bacteria se inoculó 1 ml de una suspensión bacteriana (1*10⁸ UFC) a 100 ml del medio en matraces Erlenmeyer de 250 ml de capacidad. Los matraces inoculados se mantuvieron en un agitador orbital a 150 rpm por 72 h a 27 °C. Al término de la incubación, los cultivos se colocaron en tubos de centrífuga de 50 mL y se centrifugaron a 8765 x g por 10 min. El sobrenadante libre de células bacterianas se esterilizó a 120 °C por 15 min para las pruebas de la actividad antifúngica (Pusey y Wilson, 1984). Para determinar la actividad de los filtrados se utilizó el método de difusión en agar en discos de papel filtro (Lagunas-Lagunas et al., 2001). Tomando secciones de 0.5 cm de diámetro de crecimiento activo del patógeno se sembraron en el centro de la caja Petri colocando cuatro discos de 6 mm de diámetro de papel filtro estéril (Whatman Núm.1) que previamente fueron sumergidos en el filtrado bacteriano. Los discos de papel filtro tratados, se colocaron en cuatro puntos alrededor del hongo a una distancia de 2 cm. Las siembras se incubaron a 29 °C y se midió el crecimiento micelial y los halos de inhibición de los hongos fitopatógenos como se describe anteriormente.

 

Inhibición de germinación de conidios

Los conidios de C. gloeosporioides se obtuvieron mediante raspado ligero de una colonia fúngica con un bisturí, adicionando 10 ml de agua destilada estéril al medio PDA. La suspensión se filtró con gasas estériles para eliminar micelio y fragmentos de medio de cultivo. Una suspensión de 1*10⁸ conidios ml^–1 se mezcló con filtrado bacteriano (1:1 v/v). La mezcla se sembró en una caja Petri con PDA. Para la observación, a cada punto de siembra se le colocó un cubreobjetos y se registró el porcentaje de germinación de conidios con ayuda de un microscopio compuesto (LEICA DM500^®) con un objetivo de 100 x, después de 3, 5, 8 y 10 h. La germinación en este contexto se definió como un tubo germinativo que se extienda más de la mitad de la longitud de la célula. El porcentaje de germinación del hongo se determinó contando al azar 100 conidios de cada punto de siembra y determinando la proporción de germinados con respecto al total observado (Mahadtanapuk et al., 2007).

 

Diseño experimental y análisis de datos

Los tratamientos se establecieron en un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones. Los datos obtenidos del porcentaje de inhibición se transformaron mediante la función del arcoseno: y= arsin[sqrt(y/100)]. Todos los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANDEVA), la comparación de medias se realizó mediante el método de Tukey (p≤ 0.05), usando el paquete estadístico SAS ver. 8.1 para Windows (SAS Institute, 2000).

 

Actividad antagónica en confrontación directa

Inhibición de crecimiento micelial

La capacidad antagónica de las cepas nativas de Bacillus sobre el crecimiento micelial de C. gloeosporioides mostró diferencias significativas (p≤ 0.05). Las cepas que causaron mayor inhibición de crecimiento micelial correspondieron a, CBCC2, CBK47, CBCK36 y CBRF24 que mostraron entre 74.4 y 80.6% de inhibición (Cuadro 1).

La actividad de estas cepas es mayor con lo que reportan otros autores, como Orberá et al. (2009), quienes obtuvieron porcentajes de inhibición inferiores en evaluaciones de cinco cepas de Bacillus spp. aisladas a partir de rizósfera de plantas ornamentales, mostrando entre 52 y 58% de inhibición de crecimiento micelial para este hongo, además también observaron zona de lisis interna y un engrosamiento del borde en la zona de inhibición. Se ha reportado el efecto de B. subtilis en la tasa de crecimiento micelial de G. gloeosporioides aislado en mango de 5.1 a 0.6 mm día^-1 (Gutiérrez et al., 2003).

 

Halos de inhibición

La cepa CBMT51 causó mayor halo de inhibición, con 0.88 cm, seguido de las cepas CBCK36 y CBMT2, cuyos valores fueron 0.62 y 0.70 cm, respectivamente, no siendo significativamente diferentes (Cuadro 1). Los halos de inhibición en la actividad de algunas cepas son comunes en este tipo de bioensayos. Gutiérrez et al. (2003), usando las bacterias antagonistas Bacillus licheniformis y B. subtilis contra C. gloeosporioides observaron formación de halos de inhibición color blanco debidos a la estimulación de la densidad de esporulación y con una clara delimitación de la colonia fúngica.

 

Actividad antagónica de los filtrados bacterianos mediante difusión en agar con la técnica de papel filtro

Inhibición del crecimiento micelial de Colletotrichum gloeosporioides

Los valores de inhibición de crecimiento micelial con los filtrados bacterianos fueron entre 13.2 y 42.8%, las cinco cepas más activas estuvieron entre 33.9 y 42.8%. (Cuadro 2). Rahman et al. (2007), utilizando la bacteria Burkholderia cepacia para el control in vitro de C. gloeosporioides, describen que al esterilizar el filtrado del cultivo bacteriano se obtenía inhibición 59.2% en el crecimiento micelial del fitopatógeno. Gutiérrez et al. (2003), usando las bacterias antagonistas B. licheniformis y B. subtilis contra de C. gloeosporioides, observaron reducción de tasa de crecimiento micelial de 5.7 a 0.26 mm d^-1 por efecto de los metabolitos que fueron sometidos a una alta presión y temperatura. La termoestabilidad de los metabolitos antifúngicos producidos por B. subtilis fue reportada por Pusey y Wilson (1984) al confirmar la reducción del crecimiento micelial de C. gloeosporioides.

 

Halos de inhibición

Al comparar los halos de inhibición con la técnica de papel filtro, se observó que cinco de las siete cepas produjeron halos entre 0.13 y 0.26 cm (Cuadro 2), datos similares reportaron Kim et al. (2003) al utilizar cepas de Bacillus spp. mediante el método de discos en difusión en agar que generaron halos de inhibición contra varios patógenos incluyendo C. gloeosporioides, donde la actividad de las sustancias antifúngicas se mantuvo estable al tratamiento de 80 °C durante 1 h. Se ha reportado que fracciones de iturina A y fengicina producidas por Bacillus subtilis CMB32 producen halos de inhibición en C. gloeosporioides (Kim et al., 2010). Las pruebas de difusión en agar se usan para determinar y establecer de forma cuantitativa el efecto de un conjunto de sustancias difusibles en un medio de cultivo que puedan inhibir la actividad de un microorganismo formando halos de inhibición de crecimiento (Ramírez y Marín, 2009).

 

Inhibición de germinación de conidios

Las cepas que mostraron mayor porcentaje de inhibición de germinación de conidios de C. gloeosporioides de fueron CBMN22 y CBCC2, con valores de 57.3 y 70.6%, respectivamente (Cuadro 3). Las cepas CBMT51 y CBMT2 no mostraron efecto para este hongo. Rahman et al. (2007), observaron 100% de inhibición de germinación utilizando filtrados de B. cepacia.

Se observaron cambios morfológicos y deformación de los tubos germinativos, provocando de las células hinchamiento por las cinco cepas que inhibieron la germinación de conidios, el efecto fue más visible en la cepa CBCC2 (Figura 1). Estos resultados concuerdan con lo reportado por Gutiérrez et al. (2003) con B. licheniformis y B. subtilis, donde se observó que los conidios germinados de C. gloeosporioides presentaron deformaciones a manera de bulbos o esferas con pequeñas remanentes de tubo germinativo. También Mahadtanapuk et al. (2007) encontraron distintos cambios morfológicos como la inflamación de los conidios y los tubos germinales se visualizaron fácilmente. Los resultados mostraron que el tratamiento de esterilización (121 °C, 15 min.) no afectó los compuestos fungitóxicos y el efecto inhibitorio, demostrando la termoestabilidad de los metabolitos antifúngicos.

 

Conclusiones

Las cepas B. subtilis presentaron actividad in vitro contra el patógeno C. gloeosporioides, mostrando capacidad de inhibición de crecimiento y presencia de halos de inhibición en confrontación directa. Los filtrados de los cultivos bacterianos de cinco de las cepas, después de haber sido sometidos a tratamiento con calor no perdieron actividad inhibitoria. B. subtilis CBCC2 mostro tener la mejor capacidad antagónica ya que los filtrados mostraron mayor deformación del tubo germinativo del patógeno, los resultados permitieron seleccionar asilados promisorios para el control biológico de C. gloeosporioides.

 

Literatura citada

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