Introducción
El maíz (Z. mays L.) es el segundo cereal de mayor consumo en el mundo después del trigo. Estados Unidos produce aproximadamente 41% del total a nivel mundial, China 20% y Brasil 6% (FAO, 1993). México se ubica en el séptimo lugar con aportación de alrededor de 27 169 t y rendimiento promedio anual de 3.8 t ha-1 (Ruiz et al., 2019). Las pérdidas en el rendimiento de los cultivos por las malezas son variables, pero pueden ser totales, por lo que, el uso de herbicidas se ha incrementado significativamente (Aktar et al., 2009). Entre los de mayor comercialización, mesotrione [2-(4-metilsulfonil-2 nitrobenzoilo) 1,3-ciclohexanediona] se utiliza para controlar malezas de monocotiledóneas y dicotiledóneas de hoja ancha (Ulguim et al., 2013).
El compuesto, pertenece a la familia química de las triketonas; su acción consiste en la inhibición de la enzima 4-HPPD, lo que interrumpe la biosíntesis de carotenoides y genera lesiones blanquecinas, clorosis y finalmente necrosis (Mitchell et al., 2001). La ficha técnica de mesotrione indica que ‘es altamente tóxico para organismos acuáticos, aunque manteniendo las condiciones adecuadas de manejo, no deben esperarse problemas ecológicos, con movilidad media a alta en suelo y bajo potencial de acumulación’. Sin embargo, investigaciones de sus efectos han mostrado el riesgo potencial alto de contaminación de aguas subterráneas y riesgo potencial intermedio de contaminación de aguas superficiales.
En la actualidad, la presencia de residuos de herbicidas se ha observado en suelos y aguas en diferentes países en niveles más altos de los permitidos (Echeverría-Sáenz et al., 2012; Lopez et al., 2015; Zheng et al., 2016; Herrero-Hernández et al., 2017). Amaranthus tuberculatus (var Rudis), como maleza en cultivos de maíz y soya, requirió dosis de 420 g ia. ha-1, varias veces mayor a la recomendada de 105 g ia. ha-1; esto demostró que la especie ha adquirido resistencia al herbicida (Oliveira et al., 2018). Sin embargo, el conocimiento de efectos de los herbicidas en plantas de maíz es escaso; no se han documentado los efectos de esos compuestos sobre la estabilidad de los pigmentos fotosintéticos o en la capacidad fotosintética con métodos no invasivos.
Las imágenes en rojo, verde y azul (RGB) se utilizan en métodos de análisis de fenotipo; éstos son de bajo costo y permiten analizar simultáneamente numerosos ejemplares, por lo que se reconocen como estudios de alto rendimiento o ‘High-throughput’ por su nombre en inglés (Halpering et al., 2017). Además de estos métodos, ahora se utilizan sensores que cuantifican la fluorescencia de la clorofila por medio de impulsos de amplitud modulada (PAM) que, a la vez, permiten evaluar alteraciones en la fotosíntesis y la eficiencia cuántica del fotosistema II con el índice Fv/Fm (Rosseau et al., 2013).
Las plataformas para análisis de fenotipo permiten generar cientos de imágenes que, con ciertos programas, cuantifican caracteres fenotípicos, como los del crecimiento y los cambios de color asociados a la pérdida de pigmentación en las hojas (Klukas et al., 2014; Thomas y Ougham, 2014). Esto último, con el nombre en inglés de ‘stay green’ o capacidad de mantener el color verde en las hojas, es un carácter asociado al rendimiento en condiciones estándar y de estrés por calor o sequía (Thomas y Ougham, 2014; Cayetano et al., 2021).
Entre los programas para el análisis de fenotipo se encuentran los citados por LemnaGrid (Kuklas et al., 2014), CVPlant (Gehan et al., 2017; Phenotiki (Minervini et al., 2017; OpenStart (Haselimashhadi et al., 2020), que procesan bases de datos de cientos de imágenes (Rousseau et al., 2013; Feng et al., 2018) con sensores en fluorescencia (FLUO) (Jansen et al., 2009), infrarrojo (INFRA) (Prashar y Jones., 2016) y multiespectrales (Chivasa et al., 2020). El objetivo del estudio fue evaluar los efectos de dosis 1X y 2X del herbicida mesotrione en el fenotipo y fisiología de los cultivares de maíz: Cacahuacintle, HS-2 y Vitamaíz. Establecer las bases para la identificación de daño causado por herbicidas en cultivares de maíz con métodos no invasivos, bajo costo y con alto número de repeticiones en campo o invernadero.
Materiales y métodos
El estudio incluyó los cultivares de maíz: Cacahuacintle, HS-2 y Vitamaíz. El Programa de Posgrado de Recursos Genéticos y Productividad del Colegio de Postgraduados donó los cv Cacahuacintle y HS-2. El Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato donó el cv Vitamaíz. La investigación se realizó en instalaciones del Programa de Posgrado en Botánica del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, México (Valles Altos, 19° 29’ latitud norte, 98° 53’ longitud oeste y 2 250 m de altitud).
Las semillas de los tres cultivares se sembraron en macetas de plástico, con 1.2 kg de turba vegetal (Pro-Mix®). En cada maceta hubo una planta y se aplicó riego con solución nutritiva de Steiner (Steiner, 1984) a capacidad de campo, hasta la etapa V3, con la tercera hoja desarrollada. Las plantas se distribuyeron en diseño experimental de bloques completos al azar con arreglo factorial (A × B), donde el primer factor (A) representó al herbicida mesotrione (Callisto® 480 SC, Suiza) y coadyuvante (aceite mineral); el segundo factor (B) quedó conformado por cultivares de maíz.
Los tratamientos estuvieron representados por los cultivares y dosis de mesotrione. El factor A incluyó tres niveles, que ejemplifica el tratamiento con coadyuvante, y los tratamientos en dosis 1X y 2X del herbicida. El factor B incluyó tres niveles o cultivares; y como tratamientos adicionales se incluyeron los testigos con agua para cada cultivar. La unidad experimental fue una planta por maceta y cuatro repeticiones por tratamiento.
Las diluciones se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante, 1 ml de mesotrione + 1 ml de coadyuvante, que corresponde a 1X o 80 g de ia. ha-1 y el doble para la concentración 2X. Ambas concentraciones se completaron con agua, a un volumen final de 1 L (v/v). Los tratamientos fueron aplicados con una aspersora de alta presión para plantas (Lalatech®), con boquilla de abanico plano TeeJet® XR 11003 (EE. UU), calibrado para liberar 1.5 L, presión de 2.5-3 bar y a 40 cm de altura respecto a la planta.
El fenotipo de las plantas se evaluó en la etapa vegetativa V3-V4, 10 días después de aplicar herbicida, con el sistema de adquisición de imágenes Scanalyzer PL (LemnaTec). Cada maceta se colocó en la cabina de la plataforma, iluminada con lámparas de luz blanca y se obtuvieron imágenes con las cámaras superior (Top view) y lateral (Side view) en la región visible del espectro (400-700 nm) RGB. La resolución de las cámaras del Scanalyzer PL (Baster AG, Ahresburg Germany) generó imágenes con 1 628 x 1 236 pixeles y 4.4 x 4.4 μm por pixel. Un total de 192 imágenes se analizaron con LemnaGrid (Figura 1) que por medio de algoritmos depuran la imagen para la extracción de información a través de una red de comandos o grid como se conoce en inglés.
El programa separó el primer plano ‘foreground’ y el fondo ‘background’ de la imagen original de las vistas superior y lateral. Con cada imagen se calculó la biomasa cuantitativa digital o área proyectada, que correspondió al volumen por pixel, que es una aproximación a la biomasa total (peso fresco) de la planta; además, con las imágenes se obtienen otras variables denominadas área envolvente convexa (convex hull área; cm2), longitud de la pinza (caliper length; mm) y compactibilidad (compactness), la que permite el cálculo del índice que genera el polígono que forma el borde de la planta dividido entre el área proyectada (Jansen et al., 2009).
La vista superior de las imágenes de la lámina foliar, se determinó la toxicidad del herbicida en las plantas, mediante la cuantificación de los síntomas como clorosis y lesiones blanquecinas. El programa clasificó los colores mediante la eliminación del fondo, categorizando con un color verde el tejido fotosintético sano, con amarillo el tejido afectado por el herbicida y produjo imágenes binarias, con lo que se cuantificó la senescencia de las hojas.
Además, mediante la eficiencia fotoquímica del fotosistema II (PSII) se evaluó la capacidad fotosintética. Esto mediante el índice Fv/Fm, donde Fv es la fluorescencia variable de la clorofila (Fm-F0), Fm es la fluorescencia máxima y F0 la fluorescencia inicial. La diferencia entre la fluorescencia generada con el primer estímulo con luz y la máxima estimulación con luz, es la fluorescencia emitida cuando los electrones son ocupados en la fotosíntesis por ‘cantidad’ de luz absorbida (Goltsev et al., 2009). Para estas evaluaciones se utilizaron fragmentos de 16 cm2 de la región central de la hoja o áreas que evidenciaran los efectos tóxicos del herbicida.
Inicialmente los fragmentos de las hojas se mantuvieron en oscuridad por 30 min y se introdujeron en una cámara cerrada (PhotoSystem Instruments Open FluorCam FC-800, República Checa) para cuantificar la fluorescencia con el programa FluorCam (versión 7), configurado para una lectura con la curva Kaustky y pulsos de luz constante. Los valores de F0 y Fm se obtuvieron, junto con las imágenes con la fluorescencia de las hojas. Los resultados se analizaron con Andeva y comparación múltiple de medias de Tukey (p≤ 0.05), con el programa estadístico Minitab® 19 y SAS® 13. Las figuras se procesaron en GraphPad Prism8.
Resultados y discusión
El efecto de mesotrione en plantas de los tres cultivares de maíz se evaluó con la plataforma de fenotipeo y el programa LemnaGrid en 384 imágenes en vistas superior y lateral. Inicialmente, la separación del fondo o ‘foreground’ y ‘background’ se realizó en imágenes originales (Figura 1 A-E), transformadas a escala de grises (Figura 1 B-F) y posteriormente en imágenes binarias en blanco y negro (Figura 1 C-G), las cuales se segmentaron en trazos (Figura 1 D-H).
El resultado final se muestra en imágenes, en vista frontal, de una planta representativa, área proyectada (Figura 2A), envolvente convexa (Figura 2B), compactación (Figura 2C) y longitud de la pinza o longitud máxima (Figura 2D). Estas variables se han utilizado en estudios de fenotipeo de plantas con estrés abiótico (Kuklas et al., 2014) que demostraron su utilidad para evaluar índices de productividad. Fue el caso de un estudio en sorgo (Sorghum bicolor y Sorghum sudanense (Piper) Stapf.) que demostró el efecto negativo en crecimiento por la restricción de nitrógeno en el suelo (Neilson et al., 2015).
La evaluación del fenotipo también se describió en cebada (Hordeum vulgare L.), Arabidopsis (Acosta Gamboa et al., 2016) y frijol (Phaseolus vulgaris L.) con estrés por déficit de humedad (Padilla-Chacón et al., 2019). En este estudio se evidenció que el fenotipeo no destructivo es una herramienta útil para la evaluación de plantas con daño por herbicidas.
En el análisis cuantitativo de las variables morfométricas, en las imágenes con vista superior no mostró diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 3). Esto indicó que el herbicida mesotrione no afectó negativamente el desarrollo y crecimiento de los tres cultivares. Sin embargo, en las imágenes con vista frontal se observaron diferencias entre los cultivares independientemente de los compuestos asperjados.
Estas observaciones indicaron que, en la variable de área proyectada, envolvente convexa y longitud de la pinza en el cv Cacahuacintle fueron entre 10 y 15% superiores a los cultivares HS-2 y Vitamaíz (Figura 3) y que este último fue 15% más compacto que los otros dos. Las imágenes con vista superior no mostraron diferencias significativas en las variables de área proyectada, envolvente convexa y longitud de la pinza, excepto compactación que con el análisis estadístico, el crecimiento de HS-2 y Vitamaíz fue menor entre 5 y 7% respecto al Cacahacintle (Figura 3).
Los resultados del presente estudio coinciden con Bibi et al. (2019). Estos autores evaluaron plantas de maíz tratadas con atrazina, éstas no presentan alteraciones en el crecimiento, incluso con dosis mayores a las recomendadas, aunque el herbicida no alteró el crecimiento, los autores demostraron que en las hojas las concentraciones de azúcares solubles y prolina si incrementaron. En otro estudio, mediante análisis de variables morfométricas, se comparó el efecto de atrazina y mesotrione en cultivares de maíz en post-emergencia y en malezas, como Chenopodium album L., Polygonum pensylvanicum L. y Capsella bursa-pastoris L. (Creech et al., 2004).
Asimismo, indican que el estudio mostró que ninguno de los herbicidas alteró la acumulación de biomasa seca de las plantas de maíz en el vástago (Creech et al., 2004). Los resultados parciales del presente estudio y de los ya citados permiten sugerir que las plantas de maíz poseen mecanismos de tolerancia o eliminación de los herbicidas que impiden que se altere el crecimiento.
La información sobre los mecanismos de degradación de los herbicidas que permiten a las plantas de maíz evitar los efectos de los herbicidas es escasa. Sin embargo, se descubrió que, en plantas de maíz, el paraquat estimuló la cascada de señalización mitógena-activada proteína cinasas, que tiene un papel en la ruta de señalización por estrés, la cual es mediada por ácido abscísico (ABA) asociado con MAPK y MAPK5 (Ding et al., 2009).
En otro estudio se observó que ciertos tratamientos con la citoquinina benzyladenina promovieron la disminución de la toxicidad de paraquat en plantas de maíz (Durmuş y Kadioğlu, 2005). Debido a la falta de algún efecto de mesotrione en el crecimiento de las plantas de maíz de los tres cultivares en el presente estudio, no se descarta la presencia de un mecanismo de detoxificación del herbicida, similar a los documentados en otros estudios con otros herbicidas. Por lo que, la continuación del presente estudio incluirá evaluaciones bioquímicas enfocadas al conocimiento del o los mecanismos de respuesta de las plantas jóvenes de maíz a mesotrione.
A partir de imágenes con vista superior se evaluó la pérdida de color verde por el efecto de la mesotrione con el programa LemnaGrid. Para esto, el color verde (saludable) y amarillo (clorosis) de la imagen fue segmentando en porcentaje (Figura 4A). Los resultados mostraron que la pérdida de color verde en los tres genotipos fue de 10 a 15% en la lámina de maíz con la dosis 1X de mesotrione. La dosis 2X incrementó los síntomas de pérdida de color verde; el efecto se observó con mayor variabilidad en los cultivares Cacahuacintle y HS-2. Estos cultivares mostraron pérdida de 30% del color verde y en Vitamaíz fue de 20% (Figura 4B, 4C).
El nivel de daño de mesotrione en la tercera hoja, con el haz frontalmente expuesto, se evaluó con el programa LemnaGrid (Figura 5). Aunque las hojas jóvenes cubren a las inferiores en las imágenes en vista superior, los resultados mostraron que la pérdida de color verde con ambas dosis representó entre 40 y 50% en los tres cultivares. Sin embargo, el análisis de segmentación mostró que la pérdida de color verde fue diferente a lo largo de la lámina, ya que la pérdida mayor, entre 60 y 75%, de color se presentó en la mitad de la hoja a partir de la base (Figura 5). En contraste, la pérdida de color verde en la mitad apical fue entre 15 y 30% (Figura 5) y con algunas zonas con daño. Este resultado indicó que el herbicida afecta principalmente los tejidos jóvenes de la lámina.
En la actualidad no existen reportes sobre la distribución del daño por herbicidas en las láminas de plantas de maíz. Los cambios anatómicos relacionados con la pérdida de color verde tampoco se han documentado. Los resultados del presente estudio mostraron que las plantas de maíz disminuyeron significativamente su capacidad fotosintética e inhibieron la síntesis de pigmentos fotosintéticos, aceleraron su degradación, en zonas específicas de la lámina dependientes de la edad del tejido y el crecimiento no se vio alterado por efecto de la toxicidad con mesotrione.
Wang et al. (2019) propusieron un método que sustituye la evaluación por el índice de vegetación de diferencia normalizada o NDVI por sus siglas en inglés, en las hojas completas de plantas de maíz por medio de imágenes analizadas con algoritmos que permiten identificar en las hojas las deficiencias en nutrimentos en escala de color. Plantas de maíz completas se han evaluado en campo con métodos que combinan el uso de otros sensores de NDVI (RGB y NIR), índice de contenido de clorofila (SPAD) y de segmentación de color, se han analizado con el objetivo de evaluar numerosos cultivares en poco tiempo (Wu et al., 2015).
Los resultados cualitativos del índice Fv/Fm de los tres cultivares mostraron que en las plantas testigo, asperjadas con agua y con coadyuvante, el color rojo predominó en la mayor parte del tejido con valores de Fv/Fm igual a 0.8 (Figura 6A). Con la dosis 1X de mesotrione el color rojo disminuyó y cambió a amarillo verde en los tres cultivares, según la escala de color representada con valores de Fv/Fm entre 0.6 y 0.7, así fue posible detectar diferencias en la proporción de color amarillo y verde. El cv HS-2 disminuyó el color amarillo casi totalmente y cambió a verde; en contraste en los cultivares Cacahuacintle y Vitamaíz, el color amarillo se mantuvo sólo en algunas regiones de la hoja.
Con la dosis 2X, los fragmentos de las hojas mantuvieron los efectos que a la dosis 1X, incluso con ligero aumento del color amarillo. Los resultados fueron validados cuantitativamente con el programa FluorCam7 (Figura 6B), mediante este método, se determinó que los valores promedios de Fv/Fm no mostraron diferencias significativas en el cultivar Cacahuacintle en las dosis 1X y 2X respecto a los controles. Este resultado coincidió con el mayor color amarillo en las imágenes (Fv/Fm= 0.7). En contraste, en los cultivares HS-2 y Vitamaíz se observó disminución de los valores de Fv/Fm a 0.6 y 0.7, en las imágenes el color amarillo tuvo menos intensidad de color (Figura 6B).
Entre las variables de mayor uso para el fenotipeo de plantas, la fluorescencia de la clorofila tiene ventajas porque su medición es rápida y no es invasiva (Feng et al., 2018). Los resultados obtenidos en este estudio indicaron, que las imágenes en RGB y los valores de Fv/Fm mostraron que mesotrione no afectó la capacidad fotosintética de los cultivares Cacahuacintle y Vitamaíz, en contraste, en el cv HS-2 disminuyó el índice Fv/Fm.
Las diferencias en los valores de Fv/Fm por el efecto de mesotrione entre los tres cultivares pueden deberse, en parte a los mecanismos de formación/eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los tejidos foliares. Este aspecto se expuso en un estudio del efecto del glifosato en plantas transgénicas de maíz tolerantes al herbicida (Feng et al., 2018). Las imágenes de fluorescencia de la clorofila exhibieron heterogeneidad en la respuesta de las hojas al herbicida y variación temporal en la planta completa. Los resultados de este estudio también presentaron que el daño por mesotrione varia en intensidad y entre las zonas de cada hoja; lo que demostró el efecto mayor del herbicida en los tejidos foliares más jóvenes.
Los métodos utilizados en el presente estudio permiten el desarrollo de investigaciones con mayor número de plantas (cultivares) y productos químicos (herbicidas), que proporcionen información confiable de la susceptibilidad de una cultivar a este tipo de estrés, que podría ser usado como un parámetro para el screening a bajo costo en mayor número de cultivares o material genético, además, determinar cuándo una especie es tolerante o susceptible a algún tipo de herbicida.
Conclusiones
Los síntomas de clorosis de mesotrione en dosis 1X y 2X, no alteran el fenotipo ni las variables de crecimiento de las plantas de los tres cultivares de maíz. Los síntomas en las láminas foliares se distribuyen heterogéneamente, son mayores en la base e irregular hacia el ápice. La eficiencia química del fotosistema II es dependiente del cultivar.