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Introducción
El hongo Fusarium oxysporum es un habitante ubicuo de suelos en casi todos los ecosistemas. Actualmente es considerado un complejo de especies, basado en filogenias realizadas con diferentes genes (O’Donell et al., 2009). F. oxysporum cumple con diversos roles ecológicos, aunque principalmente es considerado un saprófito (Abdul et al., 2016), tiene un papel importante como endófito benéfico (Waweru et al., 2014) y patogénico (Demers et al., 2015). Estos últimos, reciben especial atención al causar enfermedades muy destructivas en diversos cultivos.
Los endófitos patogénicos de F. oxysporum se nombran de acuerdo con su especificidad al hospedero, esto es conocido como formae speciales (Edel-Hermann y Lecomte, 2019). Al ser un habitante del suelo, la mayoría de las formae speciales de F. oxysporum invaden a la planta a través de la raíz (Olivain et al., 2006; Turrá et al., 2015; Koyyapurath et al., 2016). Por lo tanto, es esencial entender los mecanismos que el hongo usa para la degradación de los componentes principales de las paredes celulares de la raíz. Entre dichos componentes se puede mencionar a la celulosa, hemicelulosa y lignina (Pattathil et al., 2015).
El xilano es uno de los componentes estructurales de la hemicelulosa y por tanto, es primordial determinar la capacidad del patógeno para degradar dicho polisacárido (Pattathil et al., 2015). Debido a la complejidad química del xilano, una serie de enzimas son necesarias para degradarlo y romper la resistencia de la pared celular (De Vries y Visser, 2001; Kalluri et al., 2014)
Algunas cepas patogénicas de F. oxysporum contienen genes funcionales codificantes de distintas variantes de la enzima xilanasa, por ejemplo, se ha observado la expresión diferencial de los genes xyl2 y xyl3 durante la colonización de plantas de tomate por F. oxysporum f. sp. lycopersici, siendo el gen xyl3 el que demostró actividad en las raíces (Ruiz- Roldán et al., 1999). Asimismo, se determinó que el gen xyl3 se expresa diferencialmente entre razas y patotipos de F. oxysporum f. sp. ciceris en garbanzo, por lo cual, puede ser utilizado como un marcador para diferenciar entre las razas fisiológicas de esta forma especialis (Jorge et al., 2005; Gurjar et al., 2009).
Por otro lado, se demostró que la presencia y actividad de dos genes xyl3 y xyl4, no están directamente relacionadas con la capacidad patogénica de F. oxysporum f. sp. lycopersici en tomate (Gómez-Gómez et al., 2002). F. oxysporum f. sp. vanillae es causante de la pudrición de tallo y raíz en la vainilla (Vanilla planifolia), orquídea de alto valor comercial por ser la fuente natural de la vainillina (Pinaria et al., 2010; Adame-García et al., 2015; González-Oviedo et al., 2022). Para este patógeno, existe evidencia de variación en la actividad de enzimas líticas relacionadas con las diferencias patogénicas encontradas entre distintos aislamientos del hongo (Adame-García et al., 2011; Koyyappurath et al., 2015).
Análisis histológicos realizados en la zona radicular de vainilla infectada con el patógeno han demostrado que, a diferencia de otras formae speciales, F. oxysporum f. sp. vanillae invade la zona de pelos radiculares, penetra a través de células corticales, pero no coloniza el sistema vascular, lo que indica que sus mecanismos de daño en la raíz son esenciales para el establecimiento de la enfermedad (Koyyappurath et al., 2016). Sin embargo, no existe información sobre las enzimas que degradan componentes importantes de la raíz como el xilano y a la fecha no se han establecido con claridad los mecanismos que este patógeno utiliza para establecer la enfermedad.
El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia del gen xyl3 en cepas de F. oxysporum f. sp. vanillae que han mostrado diferentes niveles de patogenicidad, con el fin de determinar las relaciones filogenéticas entre las xilanasas dentro del complejo de especies F. oxysporum, así como, buscar evidencia de selección natural positiva.
Materiales y métodos
Cepas de Fusarium oxysporum f. sp. vanillae
Se emplearon nueve cepas de F. oxysporum f. sp. vanillae previamente reportadas como patogénicas a vainilla (Adame-García et al., 2015), pertenecientes a la colección de patógenos de vainilla bajo el resguardo del Laboratorio de Genética e Interacciones Planta- Microorganismo de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Veracruzana. Cada resguardo fúngico consistía en discos de agar PDA con micelio sumergido en agua destilada estéril almacenado a 4 °C. Para su uso, las cepas fueron reactivadas en medio PDA a partir de la inoculación de 10 µl de la suspensión fúngica de la cepa en resguardo, incubadas durante siete días a 27 °C, con un periodo de 16 h de luz y ocho de oscuridad.
Extracción de ADN y amplificación del gen xyl3
La extracción de ADN se realizó de acuerdo con el protocolo establecido por Adame-García et al. (2016). Las condiciones para la amplificación del gen xyl3 fueron basadas en el protocolo descrito por Gurjar et al. (2009), usando los oligonucleótidos XYL3-F (5’- GAC AAY AGC ATG AAG TGG GAT- 3’) y XYL3-R (5’- ACA CCC CAD ACR GTR ATD CC-3’). La mezcla de reacción consistió en 1X PCR buffer, 2.5 mM de MgCl2, 1 U de Taq DNA polimerasa (marca Promega), 0.25 mM de dNTPs, 25 pmol de cada oligonucleótido y 50 ng de ADN genómico, en un volumen final de 25 µl.
El ciclo térmico utilizado para la amplificación fue el siguiente: una fase de desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineamiento a 50 °C por 30 s y polimerización a 72 °C por 30 s y extensión final a 72 °C durante 10 min. Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador T100 (Bio-Rad®). Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de 1.8% de agarosa en tampón TAE (80 V, 60 min), teñido en bromuro de etidio al 2% (Promega ®) bajo luz UV en un fotodocumentador Gel Doc EZ Imager (Bio-Rad®), para comparar el tamaño del producto de amplificación se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (Promega®).
Posteriormente, los productos de amplificación se purificaron mediante el protocolo del kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) y secuenciados mediante el método de secuenciación de Sanger. Las amplificaciones se repitieron por triplicado.
Búsqueda de secuencias homólogas al gen xyl3
Las secuencias fueron analizadas y editadas en el software Bioedit 7.2.5 (Hall, 1999) para realizar un análisis Blast (parámetros ofrecidos por default) en la base de datos genbank del NCBI. Para esto, se incluyó en el análisis, genomas de diferentes formae speciales de F. oxysporum, así como, genomas de otras especies del género Fusarium obtenidas desde diferentes bases electrónicas de datos de acceso libre.
Alineamiento de secuencias y análisis filogenético
Se utilizó un grupo de 81 de secuencias de genes codificantes de la enzima xilanasa, alineadas mediante el algoritmo ClustalW (gap open= 15; gap extend= 3). La base de datos se compuso de 76 secuencias de diferentes formae speciales y cinco de otras especies del género Fusarium. El alineamiento se realizó en el software Bioedit 7.2.5 (Hall, 1999). Los análisis de parsimonia no ponderados se realizaron con el software TNT 1.1 (Goloboff et al., 2008) empleando la interfaz Winclada (1.94.1). La búsqueda del árbol más parsimonioso se ejecutó con 1 000 réplicas para cada caso, utilizando una combinación de algoritmos (Ratchet + Drift + Sectorial Fusion + TBR-max). Las inferencias sobre la robustez del clado se derivaron con remuestreo Bootstrap (1 000 repeticiones con las mismas características de búsqueda).
Detección de selección positiva por codón
Se aplicó el modelo de Nei-Gojobori modificado para determinar los parámetros dN y dS (Nei y Gojobori, 1986). Los cálculos se realizaron mediante un método de máxima verosimilitud basada en el árbol filogenético obtenido previamente. Se aplicó el modelo general reversible en el tiempo general time reversible (GTR) como modelo de sustitución de nucleótidos y se seleccionó un código genético estándar, este análisis se realizó con el software MEGA 7 (Kumar et al., 2016).
Resultados y discusión
Amplificación del gen xyl3 en F. oxysporum f. sp. vanillae
Sólo tres de las nueve cepas de F. oxysporum f. sp. vanillae (JAGH5, JAGH10, JAGH12) fueron positivas para la amplificación del gen xyl3. Se observó un producto único de 0.7 kb sin bandas inespecíficas. El proceso de secuenciación permitió obtener tres secuencias con alta definición en el electroferograma. El análisis Blast unió todas las secuencias al gen xilanasa xyl3 de F. oxysporum f. sp. lycopersici (número de acceso AF052582.1) con 99% de similitud.
Estos resultados permitieron una división genotipada de F. oxysporum f. sp. vanillae en dos grupos, uno en que el gen xyl3 está presente y otro en que está ausente. Dado que hasta el momento no había reportes de algún tipo de xilanasa en F. oxysporum f. sp. vanillae, en el presente estudio se informa por primera vez la detección del gen xyl3 en esta forma especialis. En adición, puesto que las reacciones de amplificación del gen no generaron productos en todas las cepas previamente estudiadas por Adame-García et al. (2015), se afirma que existen diferentes genotipos dentro de esta forma specialis y que entre estas diferencias se encuentran la enzima xilanasa 3 (XYL3).
El gen xyl3 ha sido utilizado para distinguir razas de F. oxysporum f. sp. ciceris (Gurjar et al., 2009) y su actividad diferencial ha apoyado la diferenciación de patotipos (Jorge et al., 2005). Es destacable que las cepas de F. oxysporum f. sp. vanillae que generaron productos de amplificación del gen xyl3 pertenecen al grupo de virulencia moderada para la vainilla (Adame-García et al., 2015), en tanto que, se ha demostrado que varios motivos estructurales de xilano han cambiado durante la evolución de los grupos vegetales (Peña et al., 2016).
Dicha información será valiosa para determinar que tanto la diversidad de enzimas xilanasas de F. oxysporum f. sp. vanillae está relacionada con cepas que presentan un mayor grado de patogenicidad, considerando la composición estructural de xilanos de la pared celular de las raíces de V. planifolia y en comparación con Vanilla pompona, que cuenta con la característica de ser una de las especies del género más resistente a patógenos (Soto-Arenas y Solano Gómez, 2007).
Búsqueda del gen xilanasa xyl3 en genomas de Fusarium spp. y formae speciales de F. oxysporum
El análisis Blast en cada genoma encontrado en la base de datos de NCBI permitió identificar algunas copias del gen xilanasa xyl3 en diferentes especies y formae speciales de F. oxysporum. En el Cuadro 1 muestra los porcentajes de similitud alcanzados con las secuencias de este estudio.
Cuadro 1 Resultados del análisis Blast del gen xyl3 de F. oxysporum f. sp. vanillae realizado contra genomas de formae speciales de F. oxysporum y Fusarium spp.
| Especie | Cepa | Acceso Genebank | Similitud (%) |
|---|---|---|---|
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | 4287 | NC_030997 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | MN25 | JH650838 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. pisi | HDV247 | JH651390 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici | 26 381 | JH650976 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. vasinfectum | 25 433 | JH657940 | 98 |
| F. oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 | 54 006 | JH658292 | 92 |
| F. oxysporum f. sp. conglutinans race 2 | 54 008 | KK033209 | 98 |
| F. oxysporum f. sp. raphani | 54 005 | JH658394 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | 26 406 | JH659333 | 99 |
| F. oxysporum | Fo47 | JH717908 | 99 |
| F. oxysporum | FOSC 3-a | JH717848 | 98 |
| F. oxysporum f. sp. cubense race 1 | race 1 | KB730516 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. cubense race 4 | race 4 | KB726570 | 96 |
| F. oxysporum f.sp. medicaginis | KV442496 | 99 | |
| F. oxysporum | Fo5176 | AFQF01000985 | 98 |
| F. oxysporum | UASWSAC1 | JNNQ01001126 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. cubense | C1HIR-9889 | MBFV01000633 | 91 |
| F. oxysporum f. sp. conglutinans | 1 | LPZQ01011374 | 98 |
| F. oxysporum | JCM 11502 | BCHB01000008 | 96 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc013 | MABJ01000473 | 91 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon005 | MAKY01000369 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc001 | MAKZ01000123 | 98 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc018 | MABM01000088 | 98 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc021 | MABL01000269 | 98 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc015 | MABK01000132 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc030 | MABN01001749 | 98 |
| F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum | Forc031 | MABS01000137 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc035 | MABO01000683 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum | Forc016 | MABQ01000104 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon019 | MAMH01001256 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum | Forc024 | MABR01000083 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon002 | MALA01000310 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon013 | MALC01000494 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon010 | MALB01000085 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon015 | MALD01000061 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon020 | MALE01000131 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon037 | MALF01000365 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | Fon021 | MALG01000164 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol004 | MALH01000304 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol007 | MALI01000160 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol026 | MALK01000267 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol014 | MALJ01000177 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol018 | MALL01000293 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol016 | MALM01000304 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol038 | MALO01000385 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol029 | MALN01000525 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol069 | MALP01000090 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol072 | MALQ01000181 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol073 | MALR01000973 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol074 | MALS01000346 | 99 |
| F. oxysporum | FoMN14 | MALU01000082 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol075 | MALT01000042 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | 4 287 | MALW01000519 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom005 | MALY01000333 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom004 | MALX01000210 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom006 | MALZ01000374 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom009 | MAMA01000314 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom011 | MAMC01000335 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom010 | MAMB01000159 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom013 | MAME01000015 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom012 | MAMD01000050 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | Fol002 | MAMG01000077 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melonis | Fom016 | MAMF01000406 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. cucumerinum | Foc011 | MABT01000535 | 91 |
| F. oxysporum f. sp. ciceris | 38-1 | MEHF01000035 | 99 |
| F. oxysporum f. sp. melongenae | 14 004 | MPIL01001435 | 93 |
| F. verticilliodes | 7 600 | XM-018901170 | 88 |
| F. fujikuroi | 58 289 | HF679026 | 88 |
| F. culmorum | LT598661 | 80 | |
| F. graminearum | NC-026476 | 80 | |
| F. pseudograminearum | CS309 | NC-031953 | 80 |
Filogenia del gen xyl3
El análisis de parsimonia generó un árbol más parsimonioso único (Figura 1). En esta topología, se recuperaron ocho clados con apropiado soporte bootstrap. El clado 3 contiene la secuencia correspondiente a F. oxysporum f. sp. lycopersici xyl3 (AF052582) y las tres secuencias del gen xilanasa de F. oxysporum f. sp. vanillae, esto corrobora que estas cepas contienen un gen homólogo de xyl3. Es destacable resaltar que este clado contiene la mayoría de las cepas de F. oxysporum f. sp. lycopersici y solo una cepa de F. oxysporum f. sp. medicaginis.
Figura 1 Árbol más parsimonioso (L= 1825; Ci=73; Ri= 96). Obtenido de la base de datos de secuencias codificantes de xilanasas de F. oxysporum y Fusarium spp.
Otras isoformas del gen de xilanasa de F. oxysporum f. sp. lycopersici (xyl1, xyl4, xyl5) y xyl4 de F. oxysporum f. sp. ciceris se agrupan en el clado 4 y son hermanas de un linaje con solo la isoforma xyl2 de F. oxysporum f. sp. lycopersici. Junto a este clado, existen dos pequeños clados, el primero compuesto por xilanasa de F. graminearum (NC026476) y F. pseudograminearum (NC031953) y el segundo compuesto por xilanasa de F. verticillioides (NC031678), F. fujikuroi (NC031678) y una cepa de F. oxysporum f. sp. cubense RT4 (KB726570).
Estos dos clados son muy distintivos porque estas secuencias se utilizaron como grupos externos junto con F. culmorum (LT598661). Los clados 1, 2 y 8 no tienen secuencias de F. oxysporum f. sp. lycopersici; esos clados están compuestos por cepas patógenas de cucurbitáceas, banano y otras plantas. Algunos linajes individuales no se resolvieron adecuadamente. Se obtuvieron ocho clados bien soportados para la filogenia del gen xilanasa. Se propuso una clasificación previa para los genes de la enzima xilanasa, se clasificaron como xyl1 (Ruiz et al., 1999), xyl2 y xyl3 (Ruiz et al., 1999), xyl4 y xyl5 (Gómez-Gómez et al., 2002). Sin embargo, en la filogenia mostrada en el presente estudio, todos los genes xyl, excepto xyl3, están situados en el mismo clado (Clado 2; Figura 1).
Detección de selección positiva en cada codón
Se utilizó el modelo Nei-Gojobori (1986) para determinar si algunos codones de la secuencia del gen xilanasa xyl3 se ven afectados por la selección positiva. Para tal efecto, se analizaron 108 codones en busca de mutaciones sinónimas y no sinónimas. El aminoácido más común encontrado fue glicina, con cuatro codones diferentes, GGC (ocho veces), GGG (cinco veces), GGA (dos veces), GGT (una vez). Esto muestra que las mutaciones sinónimas están frecuentemente presentes en las secuencias de xilanasa xyl3. No se observaron resultados significativos respecto a selección positiva para otros aminoácidos.
Para evaluar las diferencias entre los genes de xilanasa conforme a la división de clados se realizaron pruebas de selección natural basadas en codones entre los diferentes linajes que señala el árbol genético. Se encontró que las mutaciones sinónimas fueron más abundantes y comunes que las mutaciones no sinónimas, lo que a su vez es evidencia de mutaciones neutrales (Nei y Gojobori, 1986). Este enfoque se ha utilizado en otros genes para detectar la selección positiva; es decir, evidencia de que la selección natural da origen a la diversidad de algún gen (Zhang et al., 2005; Hughes y Friedman, 2008; Metzger y Thomas, 2010). De acuerdo con una exhaustiva búsqueda en la literatura científica, este es el primer estudio con un enfoque de pruebas de selección positiva en codones utilizado para el análisis de genes en relación con la patogenicidad en F. oxysporum.
Las diferencias en la amplificación del gen de la xilanasa xyl3 en cepas de F. oxysporum f. sp. vanillae se puede explicar sobre la base de la distribución polifilética de esta formae specialis entre el Complejo de Especies de F. oxysporum (Pinaria et al., 2015; Flores-de la Rosa et al., 2018). Algunos efectores de patogenicidad se movilizan horizontalmente entre diferentes linajes de F. oxysporum, otorgando capacidad patogénica a estos linajes. Parte de estos nuevos linajes patogénicos contienen el gen xyl3 en sus genomas, mientras que otros no, por lo que existen cepas patógenas con y sin actividad del gen (Laurence et al., 2015).
Conclusiones
Esta investigación mostró que la presencia del gen xyl3 no es una característica de todas las cepas de F. oxysporum f. sp. vanillae, incluso la presencia del gen podría estar asociada a una virulencia moderada. La filogenia sugiere diferentes tipos de genes xyl; sin embargo, no se observó evidencia de selección positiva en las secuencias codificantes para este gen en F. oxysporum.
