Detección de Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Histophilus somni y Mycoplasma bovis en pulmón de bovinos

Cengiz, Seyda; Cemal Adıgüzel, M.; Dinç, Gökçen; Cengiz, Seyda; Cemal Adıgüzel, M.; Dinç, Gökçen

doi:10.22319/rmcp.v12i3.5469

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

Citado por SciELO
Accesos

Links relacionados

Similares en SciELO

Otros
Otros

Permalink

Revista mexicana de ciencias pecuarias

versión On-line ISSN 2448-6698versión impresa ISSN 2007-1124

Rev. mex. de cienc. pecuarias vol.12 no.3 Mérida jul./sep. 2021 Epub 14-Mar-2022

https://doi.org/10.22319/rmcp.v12i3.5469

Artículos

Detección de Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Histophilus somni y Mycoplasma bovis en pulmón de bovinos

Seyda Cengiz^a^*

M. Cemal Adıgüzel^a

Gökçen Dinç^b

^{^a} Atatürk University Faculty of Veterinary Medicine Department of Microbiology 25240 Erzurum. Turkey.

^{^b} Erciyes University Faculty of Medicine Department of Microbiology Kayseri. Turkey.

Resumen

En este estudio se tuvo como objetivo determinar P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis en pulmones de bovinos macroscópicamente sanos mediante PCR. El estudio se llevó a cabo en 82 pulmones de bovinos macroscópicamente sanos. Se realizó la extracción de ADN de las muestras pulmonares. Después, se realizó la PCR utilizando todos los cebadores específicos. Mediante evaluación molecular, se lograron resultados positivos para P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis en 4 (4.8 %), 4 (4.8 %), 6 (7.3 %) y 3 (3.6 %) de las muestras, respectivamente. Se detectaron infecciones mixtas en cinco muestras. De las muestras, dos fueron positivas tanto para P. multocida como para M. haemolytica, dos fueron positivas tanto para M. haemolytica como para H. somni y una fue positiva tanto para P. multocida como para H. somni. Sin embargo, no se detectó una muestra positiva que transportara todos los patógenos. En conclusión, P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis son los patógenos oportunistas importantes del tracto respiratorio en bovinos y estos patógenos tienen un papel importante durante las infecciones. Pero la naturaleza multifactorial de la enfermedad respiratoria bovina y el sistema inmunológico afectaron la formación de la enfermedad. Por lo tanto, en primer lugar, se debe fortalecer la inmunidad de los bovinos y se deben mantener bajo control otras condiciones.

Palabras clave Bovinos; Análisis molecular; Pulmón; Enfermedades respiratorias

Abstract

In this study, it was aimed to determine of P. multocida, M. haemolytica, H. somni and M. bovis in macroscopically healthy cattle lungs by PCR. The study was carried out on 82 macroscopically healthy cattle lung. DNA extraction was performed to the lung samples. PCR was then performed using all specific primers. By molecular evaluation, positive results were achieved for P. multocida, M. haemolytica, H. somni and M. bovis in 4 (4.8 %), 4 (4.8 %), 6 (7.3 %) and 3 (3.6 %) of the samples, respectively. Mix infections were detected in five samples. Of the samples, two were positive for both P. multocida and M. haemolytica, two were positive for both M. haemolytica and H. somni and one was positive for both P. multocida and H. somni. However, a positive sample, which carried all of pathogens, was not detected. In conclusion, P. multocida, M. haemolytica, H. somni and M. bovis are the important opportunistic pathogens of respiratory tract in cattle and these pathogens have a major role during infections. But multifactorial nature of bovine respiratory disease and immune system affected the formation of the disease. Hence, firstly cattle’s immunity should be strengthened and other conditions should be kept under control.

Key words Cattle; Molecular analysis; Lung; Respiratory disease

Introducción

La enfermedad respiratoria bovina (ERB) es uno de los principales problemas de salud en becerros y bovinos adultos, y tiene un gran impacto económico en la industria ganadera¹^-³. La ERB en los hatos causa pérdidas económicas debido al aumento de los costos de tratamiento, la disminución de la producción y el sacrificio⁴. La ERB tiene una etiología compleja, que involucra agentes bacterianos y virales. Además, algunos factores predisponentes, como las fallas de manejo, los problemas ambientales y de defensa del hospedero influyen en la ocurrencia de infecciones⁵.

Los agentes bacterianos más frecuentemente aislados de la enfermedad respiratoria son Pasteurella multocida (P. multocida), Mannheimia haemolytica (M. haemolytica), Histophilus somni (H. somni) y Mycoplasma bovis (M. bovis)⁶^-⁷. Pasteurella multocida es uno de los principales patógenos bacterianos y conduce a síntomas clínicos durante la ERB en becerros neonatales y bovinos. La bacteria, que se detecta no solo en bovinos infectados sino también en los sanos, se aísla de hisopos pulmonares, nasofaríngeos y nasales y de los lavados transtraqueales. Por lo tanto, el diagnóstico de P. multocida se convierte en un problema si se detectan síntomas clínicos asociados con neumonía en bovinos⁸.

Del mismo modo, M. haemolytica se presenta normalmente en la mucosa nasal faríngea en bovinos sanos. Sin embargo, la bacteria se convierte en un patógeno en condiciones inadecuadas, como deficiencia nutricional y estabulación sobrepoblada e infecciones virales. Tras la rápida proliferación de M. haemolytica dentro del pulmón infectado, se presenta bronconeumonía fibrinopurulenta grave. Además, produce una potente leucotoxina que destruye los macrófagos y los neutrófilos⁹^,¹⁰. Debido a estas propiedades, esta bacteria se acepta como el patógeno más dañino para el pulmón.

H. somni es una bacteria que normalmente se presenta no solo en el tracto respiratorio sino también en el tracto reproductivo. Al igual que con los patógenos mencionados anteriormente, H. somni también está causando infecciones como meningoencefalitis trombótica (MET), neumonía, septicemia, mastitis, artritis, miocarditis e infecciones reproductivas bajo condiciones inapropiadas con síntomas clínicos⁵^,¹¹^-¹³.

M. bovis no es sólo enfermedad respiratoria sino también produce artritis, mastitis, infecciones genitales y abortos³. Infecciones moderadas en bovinos que tienen el potencial de causar una infección con manifestaciones clínicas graves de bacterias, así como dificultad de diagnóstico, resistencia a penicilina y sus derivados; también existe un problema importante en las explotaciones de cría de ganado con el mecanismo de resistencia de los antibióticos¹⁴. Al mismo tiempo, la rápida propagación de bacterias en el hato bovino fue un resultado de M. bovis que lo hace importante¹⁵.

La ERB se conoce como infección polimicrobiana en hatos bovinos y se registra principalmente en vacas más jóvenes¹³. Por lo tanto, el diagnóstico de la ERB requiere el uso de diferentes métodos (convencionales y moleculares) para determinar las bacterias que son efectivas en la etiología. En particular, el uso de diferentes medios, las condiciones de incubación (temperatura y relación O₂) y las diferencias entre los métodos de diagnóstico convencionales requieren el uso de métodos más rápidos. El diagnóstico molecular de los patógenos basado en técnicas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) se puede utilizar para la identificación y evaluaciones detalladas. Las técnicas moleculares, que son más sensibles que los métodos bacteriológicos, son preferidas, especialmente para la identificación directa de patógenos a partir de muestras de tejido⁸^,⁹^,¹⁵^,¹⁶.

El objetivo de este estudio fue determinar P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis de pulmones de bovinos macroscópicamente sanos mediante PCR.

Material y métodos

Procedimiento de muestreo

Se recogieron un total de 83 muestras de pulmón de diferentes mataderos. Se tomó una pieza de muestra de pulmón de los pulmones sin lesiones y se colocó en tubos estériles transportados al laboratorio con cadena de frío.

Cultivo y extracción de ADN

Se tomó una pieza de muestra y se colocó en el tubo Eppendorf. Brevemente, cada muestra se colocó en placas de Petri estériles y luego las muestras se dividieron en partes utilizando bisturís y bolígrafos estériles. El cultivo en caldo solo se usó para M. bovis. Una pieza de muestra de pulmón para el aislamiento de M. bovis inoculada en un medio de caldo PPLO e incubada a 37 ^oC en %5 de CO₂ durante 5 días. Se utilizaron cultivos en caldo PPLO para la extracción de ADN de M. bovis, se utilizaron muestras de pulmón lisadas para la extracción de ADN de otras bacterias. El ADN se extrajo de las muestras de pulmón mediante el uso de un kit para purificación de ADN genómico (Qiagen-DNeasy Blood and Tissue Kit-EE. UU.). Se siguieron las instrucciones del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa

Los procedimientos de PCR, que involucraron condiciones de ciclo y mezcla de reacción, se realizaron de acuerdo con informes anteriores¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ (Cuadro 1). La mezcla de reacción se preparó con un volumen total de 50 μl que contenía 3 mM de MgCl₂, 200 μl de dNTP, 0.5 μM de cada cebador y 1.25 unidades de ADN polimerasa Taq (Vivantis, MY) con revisiones menores para patógenos. Se utilizó ADN extraído (1 μL) como molde. La amplificación se llevó a cabo mediante un termociclador (The SuperCycler Trinity, Kyratech, AU). Todas las muestras de los productos de la amplificación por PCR (10 μL) fueron sometidas a electroforesis. El ADN se visualizó mediante fluorescencia UV después de la tinción con bromuro de etidio.

Cuadro 1 Condiciones de PCR y secuencias de oligonucleótidos

Patógeno	Condición del ciclo (°C/min)	Oligonucleótidos	Par de bases (bp)	Referencia
P. multocida	94/1 69/1 30 cic 72/1	F:GGCTGGGAAGCCAAATCAAAG R:CGAGGGACTACAATTACTGTAA	1432	Miflin y Blackall, 2001
M. haemolytica	94/1 55/1 30 cic 72/1	F:TGTGGATGCGTTTGAAGAAGG R:ACTTGCTTTGAGGTGATCCG	1145	Akan et al., 2006
H. somni	94/1 55/1 35 cic 72/1	F:GAAGGCGATTAGTTTAAGAG R:TTCGGGCACCAAGTRTTCA	400	Angen et al., 1998
M. bovis	94/1 54/1 30 cic 72/1	F: TATTGGATCAACTGCTGGAT R: AGATGCTCCACTTATCTTAG	447	Foddai et al., 2005

Resultados

En la evaluación molecular, se obtuvieron resultados positivos para P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis en 4 (4.8 %), 4 (4.8 %), 6 (7.3 %) y 3 (3.6 %) de las muestras, respectivamente (Figura 1-3). Se detectaron infecciones mixtas en cinco muestras. De las muestras, dos fueron positivas tanto para P. multocida como para M. haemolytica, dos fueron positivas tanto para M. haemolytica como para H. somni y una fue positiva tanto para P. multocida como para H. somni. No obstante, no se detectó una muestra positiva que transportara todos los patógenos.

M= Marcador (100 pb ADN Ladder Plus), 1-3= P. multocida

Figura 1 Evaluación molecular de P.multocida

M= Marcador (100 pb ADN Ladder Plus), 1-2= M. haemolytica

Figura 2 Evaluación molecular de M. haemolytica

M= Marcador (100 pb ADN Ladder Plus), 1-2= H. somni, 3= M. bovis

Figura 3 Evaluación molecular de H. somni y M.bovis

Discusión

Las enfermedades respiratorias bovinas, que causan pérdidas económicas debido a la disminución de la producción y el sacrificio, tienen una gran importancia en los hatos bovinos. Aunque, bovinos de todas las edades y sexos es susceptible a la enfermedad, es más perjudicial para los becerros⁶^,²⁰^,²¹. Las bacterias que causan infecciones respiratorias pueden transmitirse de animales curados o inmunológicamente fuertes (sin signos clínicos) a animales sensibles²^,²². Además de los patógenos, algunos factores predisponentes como los establos sobrepoblados y mal ventilados, la alimentación inadecuada y otras enfermedades infecciosas aumentaron el riesgo de infección. En estos hatos, la transmisión suele producirse de forma horizontal⁷^,⁹^,²³. Los estudios previos generalmente se centraron en la detección de P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis en las amígdalas, nasofaringe y el tracto respiratoria superior en animales portadores²^,²⁴^,²⁵. En los reportes se obtuvieron varios resultados sobre la presencia de patógenos en las vacas. La positividad de P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis en bovinos varió entre 0.4-57.4 %, 1.6-35 %, 2-45 % y 14-59 % en reportes anteriores (Figura 4)⁹^,¹⁹^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰.

Figura 4 Cambio proporcional de patógenos según estudios⁹^,²⁰^,²⁴^,²⁷^,²⁹^,³⁰^,³¹

En el presente estudio, se encontró que el número de animales positivos identificados para P. multocida fue menor que el descrito por Onat et al²⁸, pero fue más alto que en otros²⁴^,²⁷. Se encontró que la positividad de M. haemolytica fue más baja que otros trabajos²^,²⁷^,²⁹, pero fue más alta que lo encontrado por Hajikolaei et al²⁰. En cuanto a la positividad, se encontró que H. somni y M. bovis fueron diferentes de otros estudios. En los estudios, en ambas bacterias, se evaluaron diferentes métodos de diagnóstico en vacas neumónicas¹⁵^,³⁰^,³¹. Además, la variación entre los resultados puede estar asociada con la diferencia en los métodos de diagnóstico, la vacunación y las propiedades bacterianas²^,²³^,²⁹. Por ejemplo, los métodos de cultivo convencionales pueden ser inadecuados en la detección de patógenos en vacas sanas debido a un menor recuento bacteriano en las muestras. Asimismo, la vacunación puede reducir el transporte de bacterias y lesiones¹⁶^,³²^,³³. Además, la detección de algunos patógenos del sistema respiratorio como H. somni y M. bovis en medios de cultivo es difícil aunque las muestras se recojan de vacas infectadas⁹^,¹⁹. Así, se sugieren pruebas de PCR, que implican cebadores específicos para el ARNr 16S, para la identificación de esta bacteria durante las infecciones respiratorias mixtas⁵^,¹³. Por lo tanto, las técnicas moleculares basadas en material genético, que permiten la detección de los patógenos a pesar de un recuento bacteriano menor, serían preferibles en lugar de los métodos de cultivo en la determinación de las vacas portadoras¹⁶^,³⁴.

La presencia de estas bacterias en ausencia de síntomas clínicos en animales o lesiones macroscópicas en la necropsia respalda el carácter oportunista de estas bacterias. Sin embargo, en estos casos, se deben realizar exámenes histopatológicos y se debe cuestionar el estado de salud del animal. Además, debido a que la aparición de la enfermedad tiene asociación con el transporte²²^,²⁴^,²⁷^,³⁵, la detección de animales reservorios es importante para la reducción del riesgo en los hatos. De modo que, la detección de vacas portadoras, que tienen riesgo potencial de contaminación, es un enfoque para el control²².

Conclusiones e implicaciones

En conclusión, P. multocida, M. haemolytica, H. somni y M. bovis, que causan pérdidas económicas y muerte en animales, también son patógenos oportunistas importantes. Por lo tanto, el sistema inmunológico debe desarrollarse mediante la vacunación en animales. Además, se deben mejorar las condiciones de estabulación y el manejo, la conciencia del personal (propietario) para establecer un programa de control efectivo y sostenible de las enfermedades del sistema respiratorio.

Literature cited

1. Headley SA, Alfieri AF, Oliveira VHS, Beuttemmüller EA, Alfieri AA. Histophilus somni is a potential threat to beef cattle feedlots in Brazil. Vet Rec 2014;175:249-250. [ Links ]

2. Jaramillo-Arango CJ, Hernandez-Castro R, Suarez-Guemes F, Martinez-Maya JJ, Aguilar-Romero F, Jaramillo-Meza L, Trigo FJ. Characterisation of Mannheimia spp. strains isolated from bovine nasal exudate and factors associated to isolates, in dairy farms in the Central Valley of Mexico. Res Vet Sci 2008;84:7-13. [ Links ]

3. Margineda GA, Zielinski GO, Jurado S, Alejandra F, Mozgovoj M, Alcaraz AC, López A. Mycoplasma bovis pneumonia in feedlot cattle and dairy calves in Argentina. Braz J Vet Pathol 2017;10(2):79 - 86. [ Links ]

4. Angen Ø, Thomsen J, Larsen LE, Larsen J, Kokotovic B, Heegaard PMH, Enemark JMD. Respiratory disease in calves: Microbiological investigations on trans-tracheally aspirated bronchoalveolar fluid and acute phase protein respons. Vet Microbiol 2009;137:165-171. [ Links ]

5. Tegtmeier C, Angen SNG, Riber U, Friis NF. Aerosol challenge of calves with Haemophilus somnus and Mycoplasma dispar. Vet Microbiol 2000;72:229-239. [ Links ]

6. Klima CL. Characterization of the genetic diversity and antimicrobial resistance in Mannheimia haemolytica from feedlot cattle [Thesis]. Alberta, Canada: University of Lethbridge; 2009. [ Links ]

7. Kurćubić VS, Đoković RD, Ilić ZŽ, Stojković JS, Petrović MP, Petrović VC. Modern approach to the enigma of bovine respiratory disease complex: A review. Pak Vet J 2014; 34:11-17. [ Links ]

8. Dabo SM, Taylor JD, Confer AW. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease. Anim Health Res Rev 2008;8:129-150. [ Links ]

9. Tegtmeier C, Angen Ø, Ahrens P. Comparison of bacterial cultivation, PCR, in situ hybridisation and immunohistochemistry as tools for diagnosis of Haemophilus somnus pneumonia in cattle. Vet Microbiol 2000;76:385-394. [ Links ]

10. Bielsa JM. New solution for the control of the bovine respiratory complex. Congress of the Mediterranean Federation for Health and Production of Ruminants (FeMeSPrum) Zadar, Croatia, 2008;35-42. [ Links ]

11. Humphrey JD, Stephens LR. Haemophilus somnus: a review. Vet Bull 1983;53:987-1004. [ Links ]

12. Corbeil LB, Widders PR, Gogolewski RP, Arthur JE, Inzana TJ, Ward ASC. Haemophilus somnus: bovine reproductive and respiratory disease. Can Vet J 1986;27: 90-93. [ Links ]

13. Angen Q, Ahrens P, Tegtmeier C. Development of a PCR test for identification of Haemophilus somnus in pure and mixed cultures. Vet Microbiol 1998;63:39-48. [ Links ]

14. Nicholas RAJ. Recent developments in the diagnosis and control of mycoplasma infections in cattle. 23rd. World Buiatric Congress, Canada. 2004. [ Links ]

15. Petersen MB. Mycoplasma bovis in dairy cattle. [PhD Thesis] Denmark, Department of Veterinary and Animal Sciences Faculty of Health and Medical Sciences. University of Copenhagen; 2018. [ Links ]

16. Casademunt S. The role of Histophilus somni in bovine respiratory disease: An update. 2011. http://www.hipra.com . Accesed 30 May, 2018. [ Links ]

17. Miflin JK, Blackall P. Development of a 23S rRNA-based PCR assay for the identification of Pasteurella multocida. Lett App Microbiol 2001;33:216-221. [ Links ]

18. Akan M, Oncel T, Sareyyupoglu B, Hazıroglu R, Tel OY, Cantekin Z. Vaccination studies of lambs against experimental Mannheimia (Pasteurella) haemolytica infection. Small Ruminant Res 2006;65:44-50. [ Links ]

19. Foddai A, Idini G, Fusco M, Rosa N, Fe A, Zinellu S, Corona L, Tola S. Rapid differential diagnosis of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis based on a multiplex-PCR and a PCR-RFLP. Mol Cell Prob 2005;19:207-212. [ Links ]

20. Hajikolaei HMR, Ghorbanpour M, Sayfi-Abadshapouri MR, Rasooli A, Ebrahimkhani D, Jabbari AR. Bacteriological and serological studies on Mannheimia haemolytica infection in cattle slaughtered at Ahvaz (southwestern Iran) abattoir. Iranian J Vet Res 2010;11:84-87. [ Links ]

21. Headley SA, Oliveira VH, Figueira GF, Bronkhorst DE, Alfieri AF, Okano W, Alfieri AA. Histophilus somni-induced infections in cattle from southern Brazil. Trop Anim Health Prod 2013;45:1579-1588. [ Links ]

22. Dziva F, Muhairwa A, Bisgaard M, Christensen H. Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida. Vet Microbiol 2007;128:1-22. [ Links ]

23. Taylor JD, Fulton RW, Mady DS, Lehenbauer TW, Confer AW. Comparison of genotypic and phenotypic characterization methods for Pasteurella multocida isolates from fatal cases of bovine respiratory disease. J Vet Diagn Invest 2010;22:366-375. [ Links ]

24. Hajikolaei HMR, Ghorbanpour M, Seyfi-Abadshapouri MR, Rasooli A, Moazeni Jula GR, Ebrahimkhani D. Study on the Prevalence of Pasteurella multocida carriers in slaughtered cattle and relationship with their immunity status at Ahvaz Abattoir. J Vet Res 2008;63:31-35. [ Links ]

25. Aebi M, Borne BHP, Raemy A, Steiner A, Pilo P, Bodmer M. Mycoplasma bovis infections in Swiss dairy cattle: a clinical investigation. Acta Vet Scan 2015;57:1-11. [ Links ]

26. Hajikolaei HMR, Ghorbanpour M, Sayfi-Abadshapouri MR, Rasooli A, Jahferian H. Occurrence of Pasteurella multocida in the nasopharynx of healthy buffaloes and their immunity status. Bull Vet Inst Pulawy 2006;50:435-438. [ Links ]

27. Barbour EK, Nabbut NH, Hamadeh SK, Al-Nakhli HM. Bacterial identity and characteristics in healthy and unhealthy respiratory tracts of sheep and calves. Vet Res Commun 1997;21:421- 430. [ Links ]

28. Onat K, Kahyaoğlu S, Çarlı KT. Frequency and antibiotic susceptibility of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica isolates from nasal cavities of cattle. Turk J Vet Anim Sci 2010;34:91-94. [ Links ]

29. Alexander TW, Cook S, Klima CL, Topp E, McAllister TA. Susceptibility to tulathromycin in Mannheimia haemolytica isolated from feedlot cattle over a 3-year period. Front Microbio 2013;4:1-8. [ Links ]

30. Tenk M. Examination of Mycoplasma bovis infection in cattle [PhD Thesis]. Budapest: Szent Istvan University; 2005. [ Links ]

31. D’Amours GH, Ward TI, Mulvey MR, Read RR, Morck DW. Genetic diversity and tetracycline resistance genes of Histophilus somni. Vet Microbiol 2011;150:362-372. [ Links ]

32. Pérez DS, Pérez FA, Bretschneider G. Histophilus Somni: Pathogenicity in cattle. An update. An Vet (Murcia) 2010;26:5-21. [ Links ]

33. Lipsitch M. Vaccination against colonizing bacteria with multiple serotypes. Proc Natl Acad Sci 1997;94:6571-6576. [ Links ]

34. Deressa A, Asfaw Y, Lubke B, Kyule MW, Tefera G, Zessin KH. Molecular Detection of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica in sheep respiratory infections in Ethiopia. Intern J Appl Res Vet Med 2010;8:101-108. [ Links ]

35. Derosa DC, Mechor GD, Staats JJ, Chengappa MM, Shryock TR. Comparison of Pasteurella spp. simultaneously isolated from nasal and transtracheal swabs from cattle with clinical signs of bovine respiratory disease. J Clin Microbiol 2000;38:327-332. [ Links ]

Recibido: 07 de Agosto de 2019; Aprobado: 07 de Diciembre de 2020

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License