Introducción

En los países latinoamericanos, el pollo es uno de los alimentos más consumidos por su facilidad para conseguirlo, su bajo precio, su alto contenido en proteínas y su bajo contenido de lípidos: es la segunda carne favorita¹. La producción de aves de corral aumenta cada año; por eso se han empleado aditivos como los antibióticos para favorecer las condiciones de crianza, Estos aditivos aumentan las deficiencias en la composición de la microbiota intestinal. Cuando los pollos nacen, su intestino delgado es inmaduro y requiere de cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares que ocurren durante las dos primeras semanas de vida; a medida que el animal crece, se establece una comunidad microbiana que es más compleja a través del tiempo. El consumo de antibióticos hace que los trastornos digestivos sean más frecuentes y produce una baja resistencia natural a la colonización por microorganismos patógenos^2,3. Los residuos de antibióticos pueden llegar al consumidor a través de la cadena alimentaria provocando reacciones alérgicas, resistencia bacteriana y alteración de la microflora. En diversos países existen dificultades para la comercialización debido al incumplimiento de las normas establecidas en relación con las concentraciones de sustancias que se presentan en los alimentos. Asimismo, se han desarrollado varios estudios en los que se refieren patógenos bacterianos, incluyendo aislamientos resistentes que pueden ser transmitidos de los pollos a los seres humanos⁴.

En general, desde hace ya varias décadas no se utilizan ya los antibióticos como promotores del crecimiento en las dietas de los animales en todo el mundo. Su uso ha causado una gran preocupación, ya que la salud humana puede verse afectada al generarse resistencia bacteriana, pues se emplean antibióticos utilizados para tratar infecciones en los humanos. Los antibióticos betalactámicos y las fluoroquinolonas son agentes de amplio espectro comúnmente utilizados para el tratamiento de infecciones; la resistencia a este tipo de antimicrobianos ha surgido fácilmente. Los últimos informes han demostrado que la resistencia a este tipo de antibióticos puede provocar varios impactos, que dependen de las cepas bacterianas⁵. Algunos países presentan un uso restringido de antibióticos como promotores del crecimiento, por ejemplo: Suecia, desde 1986; Finlandia, desde 1995⁶, y la Unión Europea, desde el primero de enero de 2006⁷, entre otros. En Colombia, el uso de antibióticos está regulado por diferentes resoluciones y decretos; sin embargo, no hay restricciones para la comercialización de antibióticos para uso veterinario, por lo que, en algunos casos, el suministro es empírico y sin prescripción especializada⁸. Dichos impactos pueden ser causados por mutaciones en los genes cromosómicos y por la presencia de plásmidos conjugativos y no conjugativos en los genes⁹. El objetivo de este artículo era establecer los perfiles de resistencia y los genes que la codifican.

Material y métodos

Con un hisopo estéril se tomaron muestras de diferentes órganos (tráquea, intestinos, sacos aeroabdominales profundos y superficiales, pericardio, bolsa de Fabricio, intestino, contenido intestinal y páncreas) de 200 pollos de producción; estas muestras se sembraron en caldo BHI y se incubaron a 37 °C durante 24 h; posteriormente fueron sembradas en agar Mac Conkey y luego incubadas a 37 °C durante 24 h. Se aislaron 35 cepas de Escherichia coli con fenotipo de resistencia a betalactamasas de espectro extendido (BLEE) de pollos de engorda sanos provenientes de granjas de Santander (Colombia); se realizó la confirmación microbiológica de género y especie mediante el sistema BBL Crystal^®, y se llevaron a cabo las pruebas de sensibilidad mediante el método Kirby Bauer, siguiendo las directrices del CLSI (2017), utilizando la cepa Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 como control positivo y la cepa Escherichia coli ATCC 25922 como testigo negativo. Los discos de susceptibilidad empleados fueron ceftriaxona (CRO 30 µg) (Oxoid^®), cefotaxima (CTX 30 µg) (Oxoid^®), cefepima (FEP 30 µg) (Oxoid^®), ácido nalidíxico (FEP 30 µg) (Oxoid^®) ciprofloxacina (CIP 1 µg) (Oxoid^®), norfloxacina (NOR 2 µg) (Oxoid^®), piperacilina (PRL 30 µg) (Oxoid^®), aztreonam (ATM 30 µg) (Oxoid^®) y amoxicilina/ácido clavulánico (AMC 30 µg) (Oxoid^®). Las cepas se cultivaron en agar Brain Heart Infusion (BHI) a 37 °C toda la noche en agitación para realizar la extracción de ADN según las instrucciones del fabricante (kit de reactivos para extracción de ADN Wizard^®), se consideraron cepas ideales en concentración ≥100μg/μL y relación ADN/proteínas A260/280 para determinar la pureza óptima con un índice de OD entre 1,8 a 2,0 (espectrofotómetro de micro volumen MaestroNano^®). Se identificaron por PCR de punto final los genes blaTEM (700 pb), blaSHV (700 pb), blaCTX (500 pb) y Amp-C (550 pb) con el protocolo modificado por López et al¹⁰; y los genes qnrA (580 pb), qnrB (264 pb), qnrC (428 pb) con el protocolo de Aguilar et al.¹¹ Los productos amplificados se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% con TAE al 1% y Safeview classic como colorante. Los geles se visualizaron utilizando el iluminador Led Ultra Slim.

Resultados

Los perfiles de susceptibilidad fueron del 63 % (n= 22/35) para la ceftriaxona (Oxoid^®), del 69 % (n= 23/35) para la cefepima (Oxoid^®), del 77 % (n= 27/35) para la cefotaxima (Oxoid^®), del 86 % (n= 30/35) para la norfloxacina (Oxoid^®), del 89 % (n= 31/35) para la ciprofloxacina (Oxoid^®), del 91 % (n= 32/35) para la piperacilina (Oxoid^®), del 91 % (n =32/35) para el aztrenam (Oxoid^®), del 97 % (n= 34/35) para la amoxicilina/ácido clavulánico (Oxoid^®) y del 97 % (n= 34/35) para el ácido nalidíxico (Oxoid^®). En cuanto a los grupos de antibióticos, se presentó 70 % de resistencia de E. coli a las cefalosporinas, un 90 % de resistencia a las quinolonas y un 93 % de resistencia a las betalactamasas (Figura 1). En cuanto a los genes, se identificaron fragmentos del tamaño esperado para los genes que codifican la resistencia a las betalactamasas, y se identificó el 83 % del gen AmpC, el 86 % del gen blaCTXM, el 54 % del gen blaSHV y el 57 % del gen blaTEM (Figure 2). En cuanto a los genes que codifican la resistencia a las quinolonas, se identificó el 94 % del gen qnrB, el 9 % del gen qnrC y el 0 % del gen qnrA (Figura 2 y Cuadro 1).

Figura 1 Grupos de resistencia a los antibióticos 

C1= 1Kb, C2= Control positivo, C3= Mx1, C4= Mx2, C5=Mx3, C6= Mx4, C7= Mx5, C8=Mx6, C9= Mx7, C10= Mx8, C11= Mx9, C12= Mx10, C13= Mx11, C14= control negativo.

Figura 2 Gel de electroforesis del gen blaCTMX 

Discusión

A partir de los perfiles de susceptibilidad, se puede notar que las cepas presentaron multirresistencia, teniendo en cuenta que éstas tuvieron resistencia a más de cuatro antibióticos; el 49 % presentó resistencia a todos los antibióticos; estos resultados generan una gran preocupación. En Corea del Sur, se encontró resistencia incluso a once antibióticos, incluyendo la ciprofloxacina¹². Yurong et al. obtuvieron resultados similares al encontrar resistencia a más de cinco agentes antimicrobianos, entre los que destacan la ciprofloxacina y la levofloxacina¹³. En cuanto a los grupos de antibióticos, destaca que el 93 % presentó resistencia a los betalactámicos, seguido de las quinolonas en un 90 % y las cefalosporinas en un 70 % (Figura 3), antimicrobianos que se emplean para el uso diario de infecciones bacterianas en humanos. En Corea se registraron casos similares de resistencia a la ampicilina (75 %), seguida de la tetraciclina (69 %) y la ciprofloxacina (65 %)¹⁴. Mientras que Varga et al¹⁵ identificaron resistencia a los betalactámicos, las sulfonamidas y las tetraciclinas en las aves de corral. En Colombia, se aislaron bacterias resistentes a múltiples fármacos como el ceftiofur, la enrofloxacina, el ácido nalidíxico y la tetraciclina, en la carne de aves de corral de tiendas independientes y de un centro de distribución de la cadena principal, lo que genera una alarma para las entidades sanitarias del país¹⁶.

Figura 3 Prevalencia de genes 

Dentro del ámbito de la resistencia, es necesario confirmar los fenotipos de resistencia mediante PCR identificando los genes que la codifican para las betalactamasas; entre éstos se pueden encontrar los genes blaTEM, blaSHV, blaCTX y Amp-C¹⁷; y para las fluoroquinolonas, los genes son qnrA, qnrB y qnrC¹¹. Con base en los perfiles analizados arriba, se puede notar la similitud con lo reportado por otros autores. Investigaciones realizadas en Brasil expusieron que los aislamientos que presentan los genes blaCTX-M-2 o blaCMY-2 tienden a acumular resistencia a un mayor rango de antimicrobianos no betalactámicos⁴. En China, los genes que predominaron en los aislamientos fueron blaCTXM y blaTEM; asimismo, se encontraron variantes de blaCMY. Por otra parte, no se identificó blaSHV¹³, como tampoco en los estudios realizados en Pakistán¹⁸, mientras que en la presente investigación éste se presentó en un 57 %. Alonso et al refieren que la diseminación del blaSHV puede ocurrir por transferencia horizontal, principalmente causada por plásmidos, lo que podría facilitar la diseminación de este gen¹⁹. En cuanto a AmpC, en el Reino Unido, se analizaron pollos importados, encontrando un 23 % de este gen, y también se identificaron mutaciones de éste²⁰. Sin embargo, en países como Ecuador se obtuvo una alta prevalencia del gen blaCTXM, resultado que difiere del obtenido en el presente estudio²¹.

El uso de antibióticos como promotores del crecimiento en los animales genera una gran preocupación debido a la propagación de bacterias resistentes, ya que el pollo tiene una fácil comercialización. En el presente estudio se observa que el 26 % de las cepas presentaron los cuatro genes; el 46 % presentaron tres genes; el 14 %, dos genes; el 3 %, un gen, y en el 4 % no se observó ningún gen. Las técnicas de biología molecular tienen una gran relevancia, ya que a través de ellas se confirman los fenotipos de resistencia por mutaciones puntuales en los genes objetivo en el caso de las bacterias susceptibles²².

Los genes qnr están mediados por plásmidos, transmisibles por conjugación, lo que se relaciona con su potencial de circulación. El cebador se reportó en 1998, y desde entonces se han reportado cinco tipos de genes qnr (qnrA, qnrB, qnrS, qnrC, and qnrD), con más de 30 alelos²³. Los animales pueden actuar como reservorios de una serie de infecciones zoonóticas, que pueden transmitirse al ser humano por contacto directo o a través de la cadena alimentaria²⁴. Kilani et al identificaron en muestras de animales un 17.6 % de genes de tipo qnr, así como genes de betalactamasas, por lo que son similares a los identificados en el presente estudio²⁵. Clemente et al²⁶ detectaron en aislamientos de E. coli el gen gyrA en animales productores de alimentos que en conjunto expresaban el gen blaCMY-2. En la investigación realizada por Montes et al se reportó sólo el 1% del gen gyrB y del gen gyrA 0%¹¹, mientras que en Quito se observó la presencia del gen qnrB en el 36 % de los aislamientos de pollos de engorda: resultados similares a los reportados en Brasil, en los que se pudieron identificar variantes del gen gyr en aislados de alimentos y humanos, observando una menor susceptibilidad a la ciprofloxacina²⁷. Según los resultados obtenidos en la presente investigación sobre la presencia de genes que codifican para la resistencia a las quinolinas, ésta es alta en comparación con otras investigaciones realizadas por otros autores; diversos estudios han encontrado que los genes qnr están altamente distribuidos en bacterias E. coli aisladas de humanos sanos y de animales domésticos y de granja⁹.

Conclusiones e implicaciones

La coexistencia de genes que codifican la resistencia a los antibióticos es un problema grave que requiere vigilancia. Ante esta situación se deben generar estrategias de control para evitar la propagación a través de la cadena alimentaria, ya que el pollo es uno de los alimentos que con mayor frecuencia forma parte de la canasta del mercado. Estos resultados reflejan la resistencia hallada principalmente para los antimicrobianos que actúan inhibiendo la síntesis de la pared y la síntesis de proteínas, como las cefalosporinas y la gentamicina respectivamente. Esto parece demostrar la teoría de la producción de betalactamasas de espectro extendido, mecanismo que puede ser mediado por plásmidos y que representa un problema de resistencia emergente. Las limitaciones de este estudio incluyen un sesgo de muestreo, ya que sólo se trabajó en una granja, además de que no se obtuvieron muestras de heces. Por lo tanto, el estudio podría sobrestimar la frecuencia de la resistencia en las muestras procedentes de aves que pueden haber sido tratadas con antimicrobianos.