ANTECEDENTES

La selección del género ha tenido gran interés a lo largo de la historia,^1,2 ya sea con la intención de encontrar el equilibrio familiar^3-5 o evitar alteraciones genéticas ligadas al sexo como: síndrome X frágil, distrofia muscular de Duchenne, hemofilia, síndrome de Hunter, enfermedad de Fabry, entre otras, incluso para quienes la única forma de prevenirlas era la selección del mismo. ⁶

La selección del sexo puede efectuarse en dos etapas: 1) selección del espermatozoide portador del cromosoma X o Y, según sea el caso⁷ y 2) transferencia selectiva de embriones previamente analizados y seleccionados con base en el cariotipo por diferentes técnicas de biología molecular, como el diagnóstico genético preimplantacional. ⁸ De manera empírica, las parejas recurren a cambios de alimentación, coito programado y diversas alternativas cuya eficacia no está comprobada, pero tienen la finalidad de logar un embarazo con feto del sexo deseado. ⁹ De forma poco fundamentada en evidencia, la medicina ha recurrido a diferentes técnicas (swim-up, gradiente de albúmina, gradiente de percoll, filtros de sephadex y métodos inmuno-magnéticos), desafortunadamente con tasas de éxito deficientes, relacionadas con la selección de sexo y subsiguiente desuso. ^10-14 Es, hasta hace pocos años, que las técnicas de fecundación in vitro han abierto la puerta a estudios genéticos confiables y con capacidad de permitir la selección del sexo, con un margen de error mínimo, mediante el diagnóstico genético preimplantacional. ^15-19

El diagnóstico genético preinplantacional consiste en el análisis de embriones mediante una biopsia, previo a su transferencia e implantación, para identificar anomalías cromosómicas, mutaciones génicas, concordancia de HLA, enfermedades hereditarias y selección del sexo. ²⁰ En 1990 se realizó la primera de estas técnicas, con una biopsia de blastómera por dos grupos de estudio: la primera en Inglaterra, efectuada por Handyside y sus colaboradores, con la finalidad de seleccionar el sexo fetal en una pareja con riesgo de enfermedad ligada al cromosoma X (conocida como deficiencia de ornitin- transcarbamilasa) ²¹ y la segunda en Estados Unidos, por Verlinsky, para deficiencia de alfa-1 antitripsina. ²² Sin embargo, por recurrir a un tratamiento de fertilización in vitro con fines exclusivos de selección del sexo y la necesidad de técnicas complejas e invasivas, como la biopsia de trofoectodermo, convirtieron esta técnica en una opción subóptima y, en ocasiones, de difícil acceso. ²⁰

El último intento para selección espermática con fines de selección del sexo incluye el sorter de citometría de flujo, que reporta tasas de éxito de 75-85%.²³ Respecto de su uso para selección del sexo, un punto importante a considerar es el potencial de pérdidas espermáticas durante cada paso del proceso y clasificación; así, estas pérdidas se asocian, frecuentemente, con las propiedades de la tinción utilizada y la preparación del equipo técnico que las realiza.

Entre las ventajas del sorter de citometría de flujo se encuentran su baja (inseminación intrauterina) y alta complejidad (fertilización in vitro). Esta técnica se describió por primera vez en 1983 por Pinkel D, en un modelo animal (Microtus oregoni), al observar que el espermatozoide X contenía 9% más de ADN que el Y; ²⁴ sin embargo, fue patentado por Lawrence Johnson (USDA; U.S. patent 5,135,759), para su aplicación en mamíferos. ^25,26 Johnson, en 1993, propuso un modelo teórico-práctico para el uso de un sorter de citometría de flujo en humanos, con la finalidad de prevenir enfermedades ligadas al cromosoma X²⁷; no obstante, debe considerarse la manipulación que reciben los gametos. En 1995, Levinson y su grupo reportaron el primer embarazo humano logrado mediante sorter de citometría de flujo. ²⁸ Finalmente, en 1998, Fugger reportó el sorter de citometría de flujo con la primera serie de 13 de 14 recién nacidos vivos sanos de sexo femenino, con una efectividad de 92.9%,²⁹ aprobada por la FDA en 2001, para la investigación, prevención de enfermedades genéticas y equilibrio familiar. ^25,30

Para llevar a cabo esta técnica, la muestra seminal se tiñe con fluorocromo (Hoechst 33342, BD Pharmingen™, USA), que se adhiere al ADN del espermatozoide, y de esta forma produce la fluorescencia al someterse a rayos ultravioleta. Mediante el citómetro de flujo se detecta la diferencia de fluorescencia entre los espermatozoides X y Y (en la especie humana el espermatozoide X contiene 2.8% más de ADN), ^27,31,32 lo que permite seleccionarlos mediante un sorter. ^33-35 Una parte de la muestra se analiza mediante fluorescencia por hibridación in situ (FISH) y se observa que 80-90% de los espermatozoides seleccionados son X y 60-70% Y. ^36-40 Este procedimiento se ha utilizado de forma segura durante 17 años como indicación médica o de balance familiar. ^41-45 De acuerdo con las estimaciones, hasta el año 2010 se reportaron 1,300 nacimientos con esta tecnología. ³⁵

Con base en lo anterior, el objetivo de este estudio consistió en revisar las repercusiones de los tratamientos de fecundación in vitro de pacientes a quienes se realizó selección espermática mediante sorter de citometría de flujo, como técnica de equilibrio familiar, para evaluar si la manipulación de gametos tiene efecto negativo o repercute negativamente en los indicadores clave de rendimiento (KPI´s) de un laboratorio de reproducción asistida, además de estimar las tasas de fecundación normal, anormal (1PN, ≥3PN) y fallida; tasas de degeneración posterior a ICSI, segmentación o división, blastocisto, implantación y recién nacido.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio descriptivo y retrospectivo, en el que se incluyeron parejas atendidas en el New Hope Fertility Center de Guadalajara (Jalisco) y de la Ciudad de México, quienes recibieron tratamiento de fecundación in vitro y selección espermática mediante sorter de citometría de flujo para selección de sexo por indicación de equilibrio familiar, entre junio de 2014 y agosto de 2017.

Para comparar los indicadores clave de rendimiento del laboratorio se seleccionaron, al azar, las parejas a las que no se les realizó el sorter (MicroSort^®, México). Se eliminaron las pacientes a quienes se les canceló el ciclo por falta de respuesta, cuando no se lograron capturar los ovocitos o, bien, de las que no se tuvo información completa.

Se utilizó el programa SPSS (Statistical Package for the Social Science Armong, NY, USA) versión 22 y se evaluaron las diferencias emparejadas de los indicadores clave de rendimiento del laboratorio de reproducción asistida, mediante la prueba t de Student para dos muestras, con y sin el uso del sorter de citometría de flujo.

RESULTADOS

En el grupo 1 (sorter de citometría de flujo) se registraron 28 parejas, en quienes se llevaron a cabo 40 ciclos, pero se cancelaron 2 por falta de respuesta; por tanto, se estudiaron 38 parejas, con un promedio de 1.43 ciclos para cada una. Respecto a la edad de la mujer, el promedio fue de 36.76 ± 4, con promedio de captura de ovocitos de 3.63 por ciclo e inyectando 138 ovocitos. En cuanto al grupo 2 (sin sorter de citometría de flujo) se incluyeron 80 parejas, en quienes se llevaron a cabo 110 ciclos, pero se cancelaron 5; de esta forma se registraron 105 ciclos totales. En promedio se efectuaron 1.37 ciclos por pareja. Respecto a la edad de la mujer, el promedio fue de 36.1 ± 4, con captura de 3.28 ovocitos por ciclo e inyectando 345 ovocitos. Cuadro 1

Al comparar los indicadores clave de rendimiento de un laboratorio de reproducción asistida del grupo 1 (sorter de citometría de flujo) versus grupo 2 (sin sorter de citometría de flujo) se encontraron los siguientes resultados:

Tasa de fecundación: se obtuvieron valores significativamente mayores en el grupo 1 para fecundación normal 80.4 vs 79.1%. Por el contario, se obtuvieron valores significativamente mayores en el grupo 2 para tasa de fecundación fallida (7.8 vs 9.42%), ≥ 3 pronúcleo (4.9 vs 5.07%) y mayores no significativos para tasa de fecundación anormal 1 pronúcleo (1.7 vs 2.89).Cuadro 2y3

Tasa de desarrollo embrionario: la tasa de segmentación o división fue mayor, sin significación estadística, en el grupo 1 vs el grupo 2: 98.19 vs 93.7%. Por el contrario, la tasa de blastocisto fue significativamente mayor en el grupo 2: 59.8 vs 42.34%, respectivamente. Cuadro 2y3

Tasa de implantación: En el grupo 2 existieron las tasas significativamente mayores de manera general 68 vs 56%, para segmentación 60 vs 50% y blastocisto sin diagnóstico genético preimplantacional para aneuploidias (PGT-a) 72.1 vs 57.89%. Cuadro 2y3

Tasa de recién nacido: En el grupo 2 fue significativamente mayor 46.5 vs 32%.Cuadro 2y3

Las diferencias entre los indicadores clave de rendimiento, con y sin sorter de citometría de flujo se resumen en la Figura 1.

ICSI: inyección intracitoplasmática de espermatozoides, PN: pronúcleo.

Figura 1. Comparación de los indicadores clave de rendimiento (KPI ́s) del New Hope Fertility Center (NHFC) de la Ciudad de México, con y sin el uso de Microsort® 

Sexo seleccionado: El grupo 1 tuvo coincidencia con el sexo seleccionado en general de 80.4%, para sexo femenino 82.6% y masculino 78.2%, por debajo de lo que reporta el sorter de citometría de flujo (MicroSort^®, México), de 88, 90 y 78%, respectivamente. ²⁹ Figura 2

Figura 2. Comparación del porcentaje de certeza estimado en el New Hope Fertility Center (NHFC) de la Ciudad de México y lo reportado por Microsort®. 

La Figura 3 muestra la comparación de los indicadores clave de rendimiento del New Hope Fertility Center de México (NHFC) con los que sugirió el Consenso de Viena de 2017. ⁵²

Figura 3A. Comparación de los indicadores clave de rendimiento (KPI ́s) del New Hope Fertility Center (NHFC) de la Ciudad de México versus los que sugiere el Consenso de Vienna.⁵² 

ICSI: inyección intracitoplasmática de espermatozoides, PN: pronúcleo.

Figura 3B. Comparación de los indicadores clave de rendimiento (KPI ́s) del New Hope Fertility Center (NHFC) de la Ciudad de México con los que sugiere el Consenso de Vienna.⁵² 

En relación con el diagnóstico genético preimplantacional para aneuploidias (PGT-a) de las 28 parejas del grupo 1 (con sorter de citometría de flujo), se analizaron 39 embriones, de los que 51.2% fueron euploides y 48.7% no euploides. Se trasfirieron 16 embriones y se obtuvo una tasa de implantación de 62.5%. Al compararlos con los resultados publicados, donde se analizaron 404 embriones de mujeres de 39 ± 4, 33.16% fueron euploides y 60.89% no euploides, con transferencia de 69 embriones, se obtuvo una tasa de implantación de 73.9%.⁵³ Cuadro 4y5

DISCUSIÓN

Es importante analizar la repercusión de las técnicas de selección de sexo relacionadas con los resultados clínicos y la perspectiva que debe ofrecerse a las pacientes en cuanto a su uso y aplicación. La selección del sexo del futuro hijo ofrece la posibilidad de disminuir el riesgo de trasmitir enfermedades ligadas al sexo. En condiciones normales, la mayor parte de las muestras de semen contienen alrededor de 50% del cromosoma sexual X/Y, respectivamente. El sorter de citometría de flujo (MicroSort^®) ha demostrado incrementar la posibilidad de obtener un hijo del sexo deseado: femenino en 82.6% y masculino en 78.3%, ambos por debajo de lo reportado en la bibliografía. ³⁵

Aun cuando de manera general la técnica de selección de sexo mediante algún sorter de citometría de flujo se interpreta como no invasiva, la técnica descrita incluye la tinción de espermas con Hoechst 33342, ³⁵ y como cualquier método de manipulación de gametos, existe riesgo de alterar los resultados esperados en los indicadores clave de rendimiento de un laboratorio de reproducción asistida. ^52,54

Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que, efectivamente, la manipulación de gametos con algún sorter de citometría de flujo tiene efecto negativo en la tasa de fertilización y específicamente de blastocisto generado por ciclo iniciado de 42.3%, menor a lo reportado en esta investigación (59.8%), incluso en el resultado de 2016 (47% miniFIV^® - 60.5% estimulación convencional). ⁴⁶

Si se efectúa el ejercicio con una pareja joven (menor de 35 años) que requiere el protocolo de selección de sexo, en un estudio con sorter de citometría de flujo, considerando el efecto negativo de la manipulación de gametos, al disminuir la tasa de blastocisto a 42.3% y tomando en cuenta que es capaz de seleccionar 80.4% de embriones del sexo deseado, será necesario disponer de nueve óvulos para obtener tres blastocistos y dos embriones del sexo deseado, mientras que al utilizar otra técnica de selección de sexo (swim up o gradientes de concentración), que no afecte los resultados de laboratorio, con una tasa de blastocisto generado por ciclo iniciado cercano al 60% y considerando que son capaces de seleccionar 50% de embriones del sexo deseado, habría que obtener ocho óvulos, para de esta forma rescatar cuatro blastocistos y dos embriones del sexo deseado; es decir, sería necesario contar con mayor número de óvulos en el sorter de citometría de flujo para obtener el mismo número de embriones del sexo seleccionado con otra técnica no invasiva, con menor costo.

Si a lo anterior se suma que la probabilidad de euploidia promedio en pacientes menores de 35 años es de 48.2%,⁵⁵ en ambos casos se tendría un embrión euploide, por lo que no existiría ventaja al realizar el sorter de citometría de flujo como técnica de selección de sexo en mujeres jóvenes. Sin embargo, en pacientes mayores de 37 años, en quienes se espera obtener un menor número de óvulos, con mayor número de embriones aneuploides, la manipulación invasiva de gametos tendría mayor efecto negativo en el pronóstico reproductivo, por lo que no estaría justificado su uso.

Por último, no se evaluó el sorter de citometría de flujo como una técnica de equilibrio familiar en baja complejidad, que aunque se supone que el efecto negativo del laboratorio en la manipulación de gametos puede provocar alteraciones en la fertilización en la salpinge, no hay elementos para comprobarlo y permanece fuera del alcance del estudio.

Al término del estudio se habían efectuado 25 transferencias y de estas 56% tuvieron hGC-b positiva y 32% de recién nacidos; sin embargo, deben considerarse todos los factores implicados en lograr un embarazo exitoso como: edad materna, calidad de la muestra espermática, tipo de procedimiento, entre otros que deben tomarse en cuenta para lograr un embarazo.

CONCLUSIONES

El sorter de citometría de flujo tiene como objetivo clasificar a los espermatozoides en X o Y, para de esta forma incrementar la proporción de espermatozoides, según sea el caso, y emplearse en técnicas de reproducción como: inseminación intrauterina (IUI), fertilización in vitro (FIV) e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Esto representa una opción reproductiva para los padres que desean reducir el riesgo de enfermedades relacionadas con el sexo. Sin embargo, de acuerdo con los datos obtenidos en este estudio se demuestra que la manipulación de gametos con el sorter de citometría de flujo repercute negativamente en los resultados de laboratorio, específicamente en las tasas de blastocisto generado por ciclo iniciado, de implantación de blastocisto y de recién nacido.