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Introducción
El aborto, es una de las principales causas que afecta la economía y competitividad de la producción lechera (Selim et al. 2014), se considera normal una tasa de 2 a 6.5 % al año (Forar et al. 1995). Determinar la causa del aborto es complejo, y sólo se puede identificar entre 25 y 40 % de las veces, aun cuando se cuente con muestras del feto, pero se sabe que los agentes infecciosos pueden estar involucrados hasta en 90 % de las veces (Yang et al. 2012). En México, más del 70 % de los abortos se clasifican como de origen desconocido (Escamilla et al. 2007). Cuando no se dispone de tejido fetal para los análisis de laboratorio, el diagnóstico se realiza por medio de pruebas serológicas con las que se detectan anticuerpos circulantes contra agentes infecciosos como Neospora caninum, el virus de la diarrea viral bovina (DVB) y de la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR), brucelosis y leptospirosis. Sin embargo, una de las principales limitantes de este tipo de determinaciones es que es difícil diferenciar entre los anticuerpos producidos por la inmunización y los estimulados por la infección natural (Abas et al. 2014). A partir de información de seroprevalencias obtenidas de ganado sano y de vacas con problemas de abortos, es posible precisar la probabilidad relativa de aborto y la proporción de abortos atribuibles a una enfermedad en específico (Thrusfield 2007). En particular, se sabe que N. caninum es un protozoo de relevancia en la producción de abortos a nivel mundial y aunque se desconoce el impacto económico global que produce, existen investigaciones en las que se atribuyen pérdidas de entre 20 y 110 dólares en vacas productoras de leche infectadas durante la gestación (Reichel et al. 2013).
En México 78.6 % de las unidades de producción tienen menos de 30 vacas, las cuales representan 34.7 % del inventario de bovinos productores de leche, que a su vez aportan 25.5 % de la producción nacional (INEGI 2007). Con base en lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue estimar la seroprevalencia de neosporosis, DVB, IBR, brucelosis y leptospirosis; para determinar su asociación con el antecedente de aborto e identificar los factores de riesgo.
Materiales y métodos
Sitio de estudio
El trabajo se realizó en los municipios de Amecameca, Tlalmanalco y Ayapango en el suroriente del Estado de México, a una altura promedio de 2 420 msnm. El clima es templado subhúmedo con lluvias en verano Cb (w2), temperatura media de 12 a 18 °C y precipitación pluvial de 935 mm al año (INEGI 2008).
Selección de las unidades de producción de leche (UPL)
De 149 UPL totales, se seleccionaron 29 mediante un muestreo doble estratificado por conveniencia, el primer estrato correspondió a la representación proporcional de cada municipio y el segundo, al número de animales en lactación (I) 3-7 vacas, (II) 8-15 vacas y (III) más de 16 vacas (Espinoza-Ortega et al. 2007). El manejo reproductivo, nutricional y sanitario se efectuó de acuerdo con el productor. Para cada UPL se levantó una encuesta con el propósito de identificar factores de riesgo individual y de hato, relacionados con la presentación de aborto.
Tamaño de muestra
Se empleó un diseño de casos y controles, a partir de un total de 331 vacas; se seleccionaron 178, cada animal con antecedente de aborto fue un caso (n=57) y los controles fueron aquellas vacas sin historial de abortos (n=121) (Mateu y Casal 2003).
Muestreo
De cada animal se recolectó una muestra sanguínea por punción de la vena coccígea en tubos sin anticoagulante, posteriormente se centrifugó a 1000 x g por 15 min, se separó el suero y se colocó en viales de poliestireno para guardar a -20 °C hasta su uso.
Pruebas serológicas
Para la detección de anticuerpos específicos para N. caninum, DVB e IBR se utilizó el ensayo inmunoenzimático (ELISA), cada muestra se trabajó por duplicado empleando paquetes comerciales (HerdCheck anti-N. caninum, HerdCheck BVDB y HerdCheck IBR-gB. IDEXX TM -Laboratories Inc., Westbrook, Maine USA). Se usó un lector BIORAD con lectura de absorbancia de 650 nm para N. caninum y de 450 nm para DVB e IBR. Los procedimientos y punto de corte se efectuaron de acuerdo al fabricante. La presencia de anticuerpos para Leptospira spp. se verificó con la prueba de microaglutinación (MAT) con una batería de 10 serovariedades de referencia internacional y tres de aislamientos nacionales; se consideraron como positivos títulos mayores o iguales a 1:100 (Salgado et al. 2014). Para el diagnóstico de brucelosis se utilizó la prueba de aglutinación en placa con rosa de bengala y la de Rivanol como prueba confirmatoria (NOM-041-ZOO-1995). El criterio para considerar como aborto fue la pérdida de la preñez entre los 42 y 260 d de gestación.
Diagnóstico molecular para neosporosis
Para el diagnóstico se emplearon tres fetos de los cuales se obtuvieron 25 mg de tejido cerebral, renal e hígado fetal; se realizó la extracción del ADN con un paquete comercial (Ultra Clean, MoBio Lab TM , USA). Se practicó el ensayo de PCR semianidado con secuencias iniciadoras publicadas previamente Np4 (5'CCTCCCAATGCGAACGAAA3´), Np7 (5'GGGTGAACCGAGGGAGTTG3') y en el formato semianidado se incluyeron Np6 (5´CAGTCAACCTACGTCTTCT3´) y Np7. Por cada muestra se emplearon 43 μL de la mezcla comercial (PCR Master Mix, Promega TM , USA), a la que se le agregaron 5 μL de ADN blanco y 1 μL de cada iniciador. El protocolo de amplificación fue de 95°C por 2 min para pre desnaturalización; 95°C por 30 s para desnaturalización, 57°C por 30 s para alineamiento y 72°C por 60 s para la extensión por 35 ciclos y la extensión final a 72°C por 3 min. Los productos de la amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1.8 % teñido con bromuro de etidio y se visualizaron con luz ultravioleta (UV). El tamaño esperado del amplicón fue de 275 pares de bases (pb) (Bazler et al. 1999).
Análisis estadístico
Los valores de prevalencia del grupo de vacas con aborto y del grupo control fueron comparados mediante Ji cuadrada con corrección de Yates. Para medir la fuerza de asociación entre seropositividad y antecedente de aborto se calculó la oportunidad relativa con intervalos de confianza (IC) del 95 %, donde valores mayores a uno indicaron asociación (Thrusfield 2007). La fracción atribuible poblacional (λfap) se determinó usando el método para estudios de casos y controles, asumiendo que el grupo control fue representativo para la población en estudio (Gordis 2005). Los factores evaluados de riesgo individual y de hato se consideraron como variables dicotómicas, excepto en las que se hizo descripción de la variable. Los factores individuales fueron: resultado serológico de positividad o negatividad a neosporosis, DVB, IBR, brucelosis y leptospirosis; número de enfermedades a las que fueron positivos los animales (1, 2, > 3); antecedente de aborto, número de abortos y número de partos (1, 2, > 3). Los factores de hato fueron: procedencia de los reemplazos, presencia de perros en el establo, antecedentes de vacunación, encharcamientos en las instalaciones y tipo de servicio. El análisis inicial se realizó mediante Ji cuadrada y en aquellas en que el factor de riesgo fue significativo (p < 0.05), se procesaron con regresión logística por el procedimiento LOGISTIC del programa SAS versión 9.0.
Resultados y discusión
El número de hembras en edad reproductiva en las UPL fue de 4 a 49, promedio de 11.4; con rango de edad de 1 a 13 años (4.7 ± 2.4 años), con 0 a1010 partos con media de 2.3 ± 1.8 partos. El reducido tamaño del hato indica que las UPL pertenecen al sistema de producción de leche de pequeña escala. En ninguna de las UPL se realizan programas preventivos de inmunización contra los principales agentes etiológicos relacionados con abortos.
Se detectó la presencia de anticuerpos de agentes relacionados con la producción de abortos en bovinos (Tabla 1); sin embargo, es conveniente considerar que en este tipo de estudios, los resultados serológicos dependen de la prevalencia de la infección en un contexto de temporalidad y distribución espacial definida, así como de la persistencia de anticuerpos circulantes en el animal, las tasas de sensibilidad y especificidad epidemiológicas de las pruebas empleadas. La prevalencia de N. caninum fue de 51.7 %, lo cual es similar a lo reportado por Morales et al. (2001). En sistemas especializados, también, se ha encontrado alta prevalencia en ganado lechero de los estados de Coahuila y Aguascalientes (Salinas et al. 2005, Meléndez et al. 2010); lo que difiere de lo encontrado en ganado Bos indicus en el trópico húmedo en el que se reporta una prevalencia de 8 a 15 % (García-Vázquez et al. 2009); mientras que en vacas con antecedentes de aborto se reporta una prevalencia del 20 % (Montiel-Peña et al. 2011). Lo encontrado en el presente estudio para N. caninum evidencia un comportamiento similar entre el sistema de producción en pequeña escala e intensivos (Morales et al. 2001, Gavrea et al. 2011). La prevalencia de 46.6 % para DVB, contrasta con lo reportado por Moles et al. (2002), quienes reportan una prevalencia del 72.3 % en bovinos lecheros, al respecto se sabe que este virus induce inmunosupresión y se asocia con la disminución en la productividad, pérdidas reproductivas y predisposición a la infección por otros agentes como lo es el caso de la neosporosis (Dubey et al. 2007); asimismo puede ocurrir muerte fetal, aborto, momificación y nacimiento de becerros inmunotolerantes (Brodersen 2014). En el presente estudio se observó que 11.8 % de las vacas fueron seropositivas para N. caninum y DVB, presentando 100 % de estas vacas con al menos un aborto. Para IBR, 18 % de los animales fueron seropositivos, lo cual coincide con Magaña-Urbina et al. (2005) quienes reportan una tasa del 22 % en bovinos de traspatio. En el caso de Leptospira spp. se estimó una prevalencia del 11.8 %, lo que es similar a lo reportado por León et al. (2008); mientras que el 47.6 % de las vacas positivas presentaron anticuerpos contra la serovariedad L. hardjo; también se detectó la presencia de las serovares L. canícola, L. icterohemorragiae, L. wolffi y L. pyrogenes. No se encontraron anticuerpos contra B. abortus en las vacas muestreadas, aunque existe un programa nacional para su control, en el ganado estudiado no se realizan actividades preventivas, ni de control contra la brucelosis, lo cual contrasta con lo reportado a nivel nacional y para el Estado por el Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) (2013).
Tabla 1. Estatus serológico de algunas enfermedades asociadas con aborto en vacas lecheras de tres municipios del Estado de México.
N. caninum, (DVB) diarrea viral bovina, (IBR) rinotraqueítis infecciosa bovina, (Br) brucelosis y (Lept) leptospirosis; n número de vacas positivas.
Al comparar las vacas con antecedente de aborto y el grupo control para N. caninum, DVB, IBR, brucelosis y leptospirosis, sólo se encontraron diferencias significativas para N. caninum (P = 0.00001) con un OR = 5.15 (IC 95 %: 2.06, 12.86) y la fracción poblacional (λfap) de 0.232 (Tabla 2); el OR indicó que el ganado seropositivo a N. caninum y con antecedente de aborto, tuvo 5.1 veces más posibilidad de abortar que el ganado no infectado (García-Vázquez et al. 2005, González-Warleta et al. 2007). La fracción atribuible poblacional para N. caninum indicó que 23.2 % de los abortos en el ganado bajo estudio pueden ser atribuídos a este parásito, por lo que este porcentaje de abortos puede disminuir si el parásito se controla o erradica.
Tabla 2. Estimación de la asociación entre seropositividad y antecedente de aborto por neosporosis, DVB, IBR, brucelosis y leptospirosis en vacas de los Municipios de Amecameca, Tlalmanalco y Ayapango del Estado de México.
λfap fracción atribuible poblacional; DVB diarrea viral bovina; IBR rinotraqueítis infecciosa bovina.
El análisis de los factores de riesgo individual, mediante Ji cuadrada mostró asociación entre las vacas con antecedente de aborto y la presencia de anticuerpos para N. caninum (p <0.05). De forma similar, entre la seropositividad simultánea a N. caninum y DVB, para los factores de riesgo de hato, se encontró asociación entre antecedente de aborto y la presencia de perros en el establo OR = 13.07 (IC 95 %: 4.7; 36) (p = 0); o bien, con la presencia de encharcamientos en las instalaciones OR = 0.46 (IC 95 %: 0.91; 1.07) (p = 0.0315). El análisis de regresión logística, no detectó asociación entre los factores individuales y de hato con la presentación de aborto, lo cual coincide con lo reportado (Bartels et al. 2007, Meléndez et al. 2010).
Durante el estudio se registraron 43 abortos, la mayor proporción ocurrió en el segundo tercio de gestación, seguido por el primero y último tercio (60.5 %, 20.9 %, 18.6 %, respectivamente). De tres fetos abortados de vacas seropositivas a N. caninum, se obtuvieron porciones de encéfalo, riñón e hígado; en el encéfalo de uno de ellos se identificó el ADN de N. caninum (Figura 1); lo que sugiere una infección activa por la transmisión vertical de la vaca a la cría y horizontal del perro a la vaca, lo cual permite mantener el ciclo del parásito, por lo que es necesario realizar más investigación sobre este tema (Bartels et al. 2007, Montiel-Peña et al. 2011).
Figura 1. Productos amplificados por PCR con iniciadores de n. caninum. Carriles: M) marcador molecular de 100 pb; 1) cerebro feto control G3PDH; 2) cerebro de feto; 3) Control negativo; 4) Control positivo).
Se concluye que existe la presencia de los agentes etiológicos de DVB, IBR, neosporosis, y leptospirosis, con amplia distribución en las UPL del sistema familiar de producción de leche, en los municipios bajo estudio del Estado de México. La presencia de N. caninum es una causa determinante en la presentación de aborto infeccioso al encontrar un alto porcentaje de vacas seropositivas, al descubrir la presencia de ADN del parásito en un feto abortado. Este tipo de estudios pueden facilitar la implementación y diseño de programas de prevención y/o control de enfermedades infecciosas para mejorar la competitividad de la actividad pecuaria del sistema familiar de producción de leche.
