INTRODUCCIÓN

Uno de los grupos de contaminantes de mayor incidencia en los sistemas acuáticos y terrestres, lo constituyen los plaguicidas. Durante las últimas décadas, su uso se ha incrementado en todo el mundo, principalmente en países en desarrollo, con el fin de proteger los cultivos y al ser humano, de plagas y enfermedades (^{Lal et al., 2013}). Aunque algunos de ellos presentan una toxicidad selectiva en los sistemas terrestres, su uso generalizado ocasiona graves efectos nocivos en otras especies no blanco, incluyendo daño genético (^{Lal et al., 2013}; ^{Nikoloff et al., 2012}).

Los sistemas acuáticos son uno de los reservorios finales de los plaguicidas, los que, por su composición química, concentración y sus metabolitos, pueden ocasionar efectos adversos sobre las respuestas fisiológicas, retraso en el crecimiento, reproducción o incrementar la mortalidad según el período de desarrollo de los animales (^{Dobšíková 2003}; ^{Ghazala et al., 2014}). Los efectos sinérgicos o las consecuencias de las interacciones entre dos o más contaminantes en el mismo organismo acuático son todavía pobremente entendidas (^{Pelletier 1986}; ^{Arcagni et al., 2017}; ^{Amoatey et al., 2019}).

Las respuestas a los contaminantes en los organismos se han evaluado comúnmente a través de la mortalidad acumulada, medida como CL_50. En décadas recientes, se ha incorporado el uso de biomarcadores, como una alternativa útil para estimar los efectos de las sustancias tóxicas sobre los peces. Los biomarcadores son indicadores sensibles para detectar o diagnosticar efectos subletales, que demuestran que las sustancias tóxicas han ingresado a un organismo y se han distribuido en sus tejidos, produciendo daños al ADN, al sistema endócrino, cambios en la función reproductiva, en la disminución del crecimiento, que se reflejan en la sobrevivencia (^{Livingstone, 2003}; ^{Van der Oost et al., 2003}; ^{Young et al., 2005}).

El Carbofuran (2,3-dihidro-2,2-dimetil-7benzofuranol N-metil carbamato) es un insecticida carbámico sistémico de amplio espectro; se utiliza comúnmente para eliminar plagas agrícolas, presenta una toxicidad selectiva sobre insectos, ácaros y nemátodos por contacto e ingestión (^{Ensibi et al., 2012}; ^{Barbieri et al., 2017}). Sin embargo, su uso generalizado ocasiona graves efectos, que incluye daño genético en otras especies no objetivo, como peces e invertebrados acuáticos, abejas, aves y mamíferos (^{Collective SPA, 2002}; ^{Clasen et al., 2014}; ^{Moreira et al., 2015}). Debido a que es uno de los insecticidas con mayores implicaciones negativas globales sobre la vida silvestre, ha sido prohibido por la USFDA en los Estados Unidos de América y Europa (^{Gupta 2009}; ^{USFDA 2014}), pero se utiliza ampliamente en México.

El carbofuran es altamente tóxico para los peces, diversos estudios con diferentes periodos de exposición han reportado CL50 menores a 1 mg/L (^{Trotter et al., 1991}). De acuerdo con la ^{EPA (2002)}, Oncorhynchus mikiss y Cyprinos carpio presentan CL50 entre 0.8-0.9 mg/L. Por otro lado, se han obtenido CL50 de 0.2245 mg/L en Poecilia reticulata después de 96 h de exposición. En Carassius auratus no se observaron muertes después de 48 h con 0.5 mg/L de carbofuran. Sin embargo, esta concentración representa la CL50 a 96 de exposición para Cyprinus carpio (^{Bretaud et al., 2000}; ^{Dobšíková 2003}). Esto indica que la tolerancia al carbofuran es variable y específica.

En México, el carbofuran se utiliza ampliamente en los cultivos agrícolas y representa un riesgo de contaminación para la biota acuática. El efecto más importante ocasionado por los plaguicidas carbámicos sobre los peces, es el daño en el sistema nervioso, éste se debe principalmente a la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa (AChE) (^{Casida & Quistad, 2004}), la cual sobre estimula la actividad neurológica de los peces (^{Iannacone et al., 2011}). Por otro lado, en las sinapsis nerviosas y uniones neuromusculares, la inhibición de la enzima AChE, causa una hiper-activación de los receptores de acetilcolina (muscarínico y nicotínico) y puede causar la muerte debido a la tetanización del músculo, además de insuficiencia respiratoria (^{Ray & Ghosh, 2006}). La intoxicación aguda en virtud de la inhibición reversible (carbamilación) de la AChE es una de las alteraciones mayormente reportada para el carbofuran sobre los peces (^{Casida 1963}; ^{O›Brien, 1967}).

La peroxidación lipídica es otra forma de intoxicación por los radicales libres; en este sentido, se han estudiado algunos insecticidas y herbicidas como inductores de estrés oxidativo, que originan efectos negativos sobre los lípidos, las proteínas de las membranas celulares, inhiben la actividad y la integridad estructural de las enzimas antioxidantes, comprometiendo la eficacia del sistema inmune de los peces (^{Lushchack, 2011}; ^{Ranjbar, 2014}). Sobresalen por sus efectos, la superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT) por lo que han sido las más estudiadas; entre las no enzimáticas, el ácido ascórbico (vitamina C), el α-tocoferol (vitamina E), el glutatión (GSH), los β-caroteno (vitamina A) y los flavonoides (^{Ochoa & González, 2008}).

El género Chirostoma Swainson, 1839 es endémico de México, pertenece a la familia Atherinopsidae y conforma un conjunto de especies con un origen monofilético, que se originó en un tiempo muy corto, en un área geográfica relativamente pequeña, cuya diversificación y especiación se remonta a 0.520 millones de años en la Mesa Central de México (^{Echelle & Echelle, 1984}; ^{Bloom et al., 2013}).

Chirostoma humboldtianum (Valenciennes, 1835) es la primera especie íctica descrita por la ciencia en México. Es una de las especies de peces blancos que conserva el patrón de distribución más antiguo del género Chirostoma y se considera la especie basal de los peces blancos (^{Barbour 1973}; ^{Paulo-Maya et al., 2000}; ^{Bloom et al., 2013}; ^{Campanella et al., 2015}).

Esta especie es de hábitats lacustres y se distribuye actualmente, de manera discontinua en sistemas lénticos, desde el Estado de México hasta Nayarit, a lo largo del sistema Lerma-Santiago. Esta región se caracteriza por un alto grado de desarrollo agrícola, urbanización e industrialización. Estos procesos afectan en diferente grado, la calidad del aire, del agua, del suelo y a las comunidades naturales que habitan en el mismo (^{Hernández-Rubio et al., 2006}). Particularmente la cuenca del Sistema Lerma Santiago, se ha considerado una de las más contaminadas de México y sus efectos no sólo se restringen a las poblaciones de peces, sino que incluyen a las comunidades humanas que habitan las zonas ribereñas, entre otros (^{Priego et al., 2004}).

En algunas especies del género, como Chirostoma jordani Woolman 1894, se han registrado cambios en la actividad enzimática (^{Dzul-Caamal et al., 2014}), así como la inhibición de la acetilcolinesterasa por insecticidas organofosforados y la toxicidad del cloruro de cadmio en embriones de C. humboldtianum (^{Altamirano-Lozano et al., 2005}).

El presente trabajo aborda el análisis del efecto del Carbofuran en juveniles de C. humboldtianum, a través de la mortalidad (CL50), de biomarcadores de neurotoxicidad y de estrés oxidativo de exposición directa, sobre el cerebro, el hígado, las branquias y los músculos. Así mismo, se espera lograr conocimientos más amplios sobre el efecto de los insecticidas carbámicos sobre otras especies de peces, tomando como base a C. humboldtianum, especie con gran importancia, tanto ecológica como económica en México.

MATERIAL Y MÉTODOS

Tóxico. Se evaluó el efecto de cinco concentraciones (0.0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/L) de Carbofuran (Furadan® 350L.) (2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il metilcarbamato; pureza de 33.21%, CAS: 1563-66-2) por dilución de una solución patrón de 137 µl en 100 ml de etanol absoluto (J.T.Baker ®); la cantidad del solvente en los acuarios fue mínima, por lo tanto no se consideró un grupo control para el solvente (^{Ensibi et al., 2012}). Las concentraciones se determinaron por bioensayos previos y tomando en consideración las CL₅₀ ya establecidas para carbofuran, en otras especies de peces de agua dulce. Así mismo, se siguieron los protocolos establecidos en el marco de pruebas de toxicidad de la Agencia para la Protección Ambiental de los Estados Unidos de Norteamérica (^{USEPA 2002}) y de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (^{OECD 2012}) para el desarrollo del experimento.

Organismos de prueba. Se utilizaron juveniles de C. humboldtianum de siete meses de edad, 7.45 ± 0.3 cm y 2.76 ± 0.2 g. Se obtuvieron por fertilización in vitro, de reproductores en cautiverio, certificados morfológica y genéticamente. Para la obtención de los huevos se emplearon 6 hembras y 12 machos. Los embriones se mantuvieron en agua con una dureza de 120 ± 20 mg/L^-1 de CaCo₃, con una salinidad de 4 g/L NaCl, a 20 ± 1 ºC, pH 8 ± 0.5 y un fotoperíodo de 12:12 hasta su eclosión. Las larvas se alimentaron con Brachionus plicatilis (Müller, 1786) (Rotifera) y Artemia franciscana Kellog, 1906 (Anostraca); los juveniles se alimentaron con neonatos de Daphnia pulex Linnaeus, 1758 (Cladocera), larvas de Chironomus plumosus (Linneus, 1758) (Diptera), anfípodos Hyalella azteca (Saussure, 1858) (Amphipoda) y alimento balanceado hasta los siete meses de edad. Los juveniles de esta edad, se trasladaron a acuarios de 40 L, 24 h antes de ser utilizados en el bioensayo. No se les proporcionó alimento durante el tiempo de exposición al tóxico. Los peces fueron del tamaño adecuado para obtener la cantidad de tejidos (branquias, músculo, hígado y cerebro) necesarios para la cuantificación enzimática.

Todos los organismos se trataron de acuerdo con la guía ética de la norma oficial mexicana, que establece las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio (^{NOM-062-ZOO-1999}).

Diseño experimental. Se realizó un bioensayo agudo de tipo estático, sin recambio de agua, en acuarios de 40 L, con agua reconstituida con una dureza de 120 ± 20 mg/L^-1 de CaCO₃ (^{EPA 1993}), a 20 ± 1 °C, con aireación constante (4.0 ± 6.5 mg/L O₂), pH 8 ± 0.5 y fotoperiodo 12:12. Se emplearon diez organismos por tratamiento: 0.0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, mg/L^-1 de carbofuran, con tres réplicas. Se realizó el registro de la mortalidad y efectos visibles durante las 96 horas de exposición, retirando los individuos muertos al momento de ser detectados.

Al finalizar el tiempo de exposición, los organismos sobrevivientes en cada tratamiento se sacrificaron por bloqueo medular, vía craneal a la altura del opérculo. Se extrajeron los tejidos (branquias, cerebro, hígado y músculo) que se mantuvieron a -80°Centigrados. Para el análisis bioquímico se utilizaron los tejidos de cinco individuos, se maceraron y homogeneizaron en agua tridestilada, con un homogeneizador eléctrico (Biospecific product, Inc. Model 398.)

Determinación bioquímica de las enzimas. La actividad enzimática se determinó en alícuotas de homogeneizados al 10% (peso/volumen) de cada uno de los órganos, por duplicado y las lecturas se realizaron con un espectrofotómetro Spectronic 20-D ®. La actividad de la acetilcolinesterasa (AChE) se cuantificó en el cerebro y el hígado, mediante la técnica de ^{Hestrin (1949)}. Se emplearon alícuotas de 1 mL del homogeneizado, al 10 % y a 4°C y se centrifugaron a 3500 revoluciones por minuto (rpm) por 15 minutos. Se tomó 1 mL del sobrenadante, se añadieron 2 mL de Tris-HCL (0.02 N, pH 7) y 1.0 mL de acetilcolina 8 mM. Se agitó y se incubó a 25 °C durante 20 minutos. Para detener la reacción, se agregó 1 mL de hidroxilamina alcalina 2 M, 1 mL de ácido clorhídrico 4 N, y 1 mL de cloruro férrico 0.37 M, disuelto en ácido clorhídrico 0.1 N. Se centrifugó a 3000 rpm por 5 min y se midió la absorbancia a 540 nm.

El nivel de lipoperoxidación (LPO) se determinó en las branquias, el hígado y el músculo, siguiendo el método de ^{Buege & Aust (1978)}. Se empleó 0.5 g. de cada tejido y se homogenizaron por separado, con 5 mL de agua tridestilada. A 300 mL de cada homogeneizado, se agregaron 700 mL de Tris-HCL 150 mM (pH 7.4) y se incubaron a 37°C por 30 minutos. Posteriormente, se agregaron 2 mL de ácido barbitúrico (TBA) al 0.375% disuelto en ácido tricloroacético al 15%, a cada muestra y se mantuvieron a ebullición durante 45 minutos. La mezcla, una vez fría, se centrifugó a 3000 rpm por 10 min y la absorbancia se leyó a 532 nm. El nivel de lipoperoxidación se midió en nanomoles de malondialdehído/miligramo de proteína (MDA/mg proteína) con un coeficiente de extinción molar de 1.56 x 10⁵ /M cm.

La actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) se determinó en las branquias, el hígado y el músculo por el método de ^{Sun et al. (1988)}. Se emplearon alícuotas de 1.5 mL del homogeneizado al 10% y a 4°C; se filtró a través de una gasa y se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos. Se tomaron 0.5 mL del sobrenadante y se agregaron 1.5 mL de agua tridestilada. Posteriormente, se añadieron 8 mL de 3:5 cloroformo/etanol. Se centrifugó a 3000 rpm durante 30 min, a 4°C. Se transfirieron 0.5 mL del sobrenadante a 2.5 mL de la mezcla compuesta de xantina 0.1 mM, ácido dietilentriaminopentaacético (DETAPAC) 1 mM, 50 mg de albúmina sérica, nitroazultetrazoilo 25 µM, ácido disulfónico bathocuproine 250 µM y carbonato de sodio 40 mM (pH 10.2). La reacción se inició con la adición de 20 U/mL de xantina oxidasa y se incubó a 25°C durante 20 minutos. Se terminó la reacción con 1 mL de cloruro cúprico 0.8 mM; la absorbancia se midió a 560 nm y la actividad de la SOD se midió en unidades totales/mg de proteína.

La actividad de la enzima glutatión peroxidasa (GPx) se determinó en las branquias, el hígado y el músculo, mediante el método de ^{Lawrence & Burk (1976)} con hidroperóxido de cumeno como sustrato. Se filtró una alícuota de 1.5 mL del homogeneizado al 10%, a 4 °C y se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos. La mezcla de reacción se conformó por 200 mL del sobrenadante del homogeneizado, 2 mL de buffer de fosfatos 75 mM (pH 7.0), 50 mL de glutatión 60 mM, 0.1 mL de la glutatión reductasa 30 U/mL, 0.1 mL de sal disódica de EDTA 15 mM, 0.1 mL del fosfato de ß-nicotinamida adenina dinucleótido (NADPH) 3 mM, y 0.45 mL de H2O, con un volumen final de 3.0 mL. La reacción se inició con 0.1 mL de hidroperóxido de cumeno 45 mM. La conversión de NADPH a NADP+ se midió continuamente a 340 nm durante 4 minutos. La actividad de la GPx se expresa en nmol NADPH oxidado a NADP+/min/mg de proteínas, con un coeficiente de extinción de 6.22x106 cm^-1M^-1. El contenido de proteínas se estimó por el método de ^{Bradford (1976)} y se utilizó albúmina sérica bovina como estándar, mismas que se emplearon en el procesamiento de la actividad enzimática.

Análisis estadístico. Una vez obtenida la relación de organismos muertos y vivos en cada concentración, se determinó la concentración letal media (CL₅₀) con la mortalidad acumulada en cada concentración, mediante el método probit XLstat v.101(^{Addinsoft, 2014}). El efecto del carbofuran sobre la sobrevivencia final de los juveniles se evaluó a través de un ANOVA de una vía, tipo I ( α = 0,05), previa normalización de los resultados (arcoseno Öpi).

Para determinar el efecto del carbofuran sobre la actividad enzimática en cada tejido, se aplicó un ANOVA de una vía (p < 0.05) y posteriormente, una comparación múltiple de medias, por el método de Tukey (^{Zar 1984}).

Los resultados de la actividad de la AChE se expresaron en porcentajes de inhibición/estimulación de la Acetilcolinesterasa vs. el control y se calculó con base en la tasa de crecimiento específica (µ), de la muestra de prueba y el control, siguiendo la ecuación:

Un valor negativo de Iµi significa estimulación de la actividad de AChE; un valor positivo significa inhibición de la actividad de la AChE.

RESULTADOS

Concentración letal media CL50. La CL50 fue de 0.077 mg/L (0.028 - 0.118 mg/_L^-1, α = 0.05) a 96-h (Tabla 1). Se presentó el 100% de mortalidad en la concentración más alta de carbofuran (0.4 mg/L), por lo que estos individuos no se consideraron para el análisis enzimático. En el grupo control no se presentó muerte de organismos, no se observaron cambios en el nado ni lesiones musculares o en las aletas.

Inhibición/Estimulación de la Acetilcolinesterasa (AChE). El efecto neurotóxico del carbofuran en el cerebro de C. humboldtianum, evaluado mediante la inhibición/estimulación de la enzima acetilcolinesterasa, presentó un patrón inverso con respecto a las concentraciones de carbofuran. La mayor inhibición (41.30 %, 37.90%) se observó en las concentraciones de 0.025 mg/L y 0.05 mg/L. En las concentraciones más altas (0.1 mg/L y 0.2 mg/L), la inhibición fue de 28.22% y 5.62%, respectivamente (ANOVA p<0.05). En el hígado, la respuesta de la AChE se incrementó con el aumento en la concentración del tóxico (ANOVA p < 0.05). Se observó una estimulación de -21.77% de la AChE en la concentración 0.2 mg/L de carbofuran; en las concentraciones de 0.025 mg/L y 0.1 mg/L, la estimulación de la AChE fue de -0.073% y -3.002%. Sin embargo, en la concentración de 0.05 mg/L se presentó una inhibición en la actividad de acetilcolinesterasa de 7.48% (Fig. 1).

Figura 1 Inhibición/Estimulación de la acetilcolinesterasa (%) en el cerebro y el hígado de juveniles de Chirostoma humboldtianum, expuestos a diferentes concentraciones de carbofuran por 96 h. n=5, las barras muestran el error estándar, * diferencias significativas (p < 0.05). 

Nivel de Lipoperoxidación (LPO). En el nivel de LPO se observó un incremento proporcional al incremento de las concentraciones del carbofuran, en los tejidos analizados de C. humboldtianum. En las branquias se registraron los niveles más altos (0.33, 0.32, 0.49 y 0.84 nmol MDA/mg de proteína) respectivamente (ANOVA p<0.05). En el tejido de los músculos el nivel de LPO fue de (0.20, 0.29, 0.17 y 0.16 nmol de MDA/mg de proteína) (ANOVA p<0.05), lo cual indica que el nivel de LPO disminuye ligeramente en las concentraciones más bajas de carbofuran. Mientras que en el hígado, el nivel de peroxidación lipídica fue de 0.07 nmol de MDA/mg de proteína en la concentración de 0.2 mg/L; en las concentraciones menores de carbofuran, el nivel de LPO fue inferior a los valores registrados para el hígado de los organismos control (ANOVA p < 0.05) (Fig. 2).

Figura 2 Nivel de lipoperoxidación en músculo, branquias e hígado de Chirostoma humboldtianum. n=5, las barras muestran el error estándar, *diferencias significativas (p < 0.05). 

Actividad de la Superóxido dismutasa (SOD). La respuesta antioxidante de la enzima SOD presentó una tendencia a aumentar con el incremento de las concentraciones del carbofuran (ANOVA p < 0.05). En las branquias se observó la mayor actividad de la enzima (0.0027, 0.0019, 0.0024 y 0.0024 Unidades/mg proteína); el hígado fue el segundo órgano en donde la actividad de la SOD fue de 0.0018, 0.0019, 0.0021 y 0.0024 Unidades/mg proteína. Finalmente, en el músculo se determinó una actividad menor: 0.0017, 0.0009, 0.0017 y 0.0019 Unidades/mg proteína (Fig. 3).

Figura 3 Actividad de la SOD en músculo, branquias e hígado de Chirostoma humboldtianum. n=5, las barras muestran el error estándar, *diferencias significativas (p<0.05). 

Actividad de la Glutatión peroxidasa (GPx). En el hígado, se presentó un incremento notable en la actividad de la GPx, con respecto al testigo, pero en relación inversa a las concentraciones del carbofuran (4.41, 3.10, 4.30, y 3.80 n mol NADPH/min mg de proteína, respectivamente). Una respuesta semejante se registró en los músculos con respecto al grupo control, aunque en las concentraciones menores del tratamiento (0.21, 0.26, 0.18, y 0.11 nmol NADPH/min mg de proteína). La actividad de la Gpx en las branquias, se observó un ligero incremento en relación al aumento de las concentraciones del carbofuran (0.56, 0.91, 0.60, 0.75 nmol NADPH/min mg de proteína) (ANOVA p<0.05) (Fig. 4).

Figura 4 Actividad de la GPx en músculo, branquias e hígado de juveniles de Chirostoma humboldtianum. n=5, las barras muestran el error estándar, *diferencias significativas (p<0.05). 

DISCUSIÓN

Los plaguicidas son los compuestos que se encuentran en mayor concentración en los sistemas acuáticos, con mayor frecuencia, debido a su extenso uso en las actividades agrícolas, industriales y domésticas. Sin embargo, poco se sabe del efecto que estos agroquímicos ocasionan en las especies de peces endémicas de México. Los resultados obtenidos en este trabajo constituyen el primer estudio sobre la toxicidad del carbofuran en C. humboldtianum.

Los juveniles mostraron una sensibilidad muy alta al carbofuran, ya que la C^L₅₀, (0.077 mg/L/96 h) se encuentra por debajo de los valores de CL₅₀ determinados para otras especies de peces, como en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) (22-29 mg/L/96 horas) y en la carpa dorada (Carassius auratus) (1.75 mg/L/96 h) (^{Yi et al., 2006}).

Los resultados en la acetilcolinesterasa muestran que los carbamatos poseen la capacidad de inhibir o estimular la actividad de la enzima tanto en el cerebro como en el hígado de C. humboldtianum, cuyo efecto se expresa de forma distinta en cada órgano, lo cual se relaciona con las funciones que cada uno de ellos desempeña.

El primer paso en el proceso de inhibición de la AChE por un éster de un organofosforado o un carbamato, involucra la formación del complejo enzima-inhibidor, con la posterior carbamilación del hidroxilo de serina (^{Fukuto, 1990}). Cuando se inhibe la actividad de la enzima, la acetilcolina no se descompone en colina y ácido acético, lo que ocasiona que se acumule en las uniones sinápticas o neuromusculares y altera el funcionamiento del sistema nervioso y, en consecuencia, afecta la locomoción y el equilibrio de los peces (^{Dutta & Arends, 2003}). En C. humboldtianum se observó que la inhibición/estimulación de la acetilcolinesterasa no sólo causa la pérdida del equilibrio en el nado de los peces; sino que, como efecto de la tetanización y contracciones musculares, se producen lesiones en el músculo y las aletas que conlleva a necrosis del pedúnculo caudal.

Así mismo, se ha registrado que el carbofuran inhibe la actividad de la AChE en cerebro y en músculo de peces de agua dulce y de agua salobre (Carassius auratus, ^{Bretaud et al., 2000}; Ciprinus carpio,^{Dembelé et al., 2000}; Channa punctatus, ^{Jash & Bhattacharya, 1983}). Por otro lado, ^{Favari et al. (2003)}, reportan inhibición de la AChE en el hígado y el músculo de Xiphophorus helleri expuestos al efecto toxico del agua de un embalse contaminado por compuestos de uso agrícola y desechos municipales.

Otros estudios también han reportado variaciones en la actividad de AChE en diferentes órganos de peces expuestos a diferentes insecticidas en Cyprinus carpio con paraquat (^{Nemcsók et al., 1984}), en Ictaluros puntactus con clorpirifos y paration (^{Straus & Chambers, 1995}), en Rhamdia quelen con glifosato (^{Glusczak et al., 2007}), en Prochilodus lineatus con el herbicida Roundupâ, un organofosforado (^{Modesto & Martínez, 2010}).

La peroxidación lipídica es uno de los mecanismos más importantes de la acción toxica de los insecticidas ya sea organofosforados o carbamatos (^{Glusczak et al., 2007}). La lipoperoxidación se inicia por las especies reactivas de oxígeno (ROS) que atacan a todas las moléculas biológicas; incluyen a los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares, ya que extraen un hidrogeno y los convierten, por una serie de reacciones posteriores, en aldehídos reactivos como el malondialdehído (MDA), el principal producto de la peroxidación. Al presentarse en los lípidos de las membranas celulares, se altera su cohesión, fluidez, permeabilidad y función metabólica, que conduce a una inestabilidad de la membrana y causa daño y muerte celular (^{Halliwell & Chirico, 1993}; ^{Ochoa & González, 2008}). Los resultados obtenidos en el presente estudio indican daño peroxidativo debido al carbofuran, el cual se reflejó en el incremento del nivel de la peroxidación lipídica en branquias y músculo, dos de los principales órganos afectados por las especies reactivas de oxígeno. Esto se debe a que la exposición directa de las branquias a los plaguicidas disueltos durante el intercambio gaseoso altera su función celular. Por otro lado, el tejido muscular de los peces puede ser afectado por la absorción cutánea al estar en contacto directo con el insecticida disuelto (^{Heath, 1995}).

Sin embargo, en el hígado debido a su función de desintoxicación no se presentaron diferencias significativas en el nivel de LPO con respecto a los valores del control. Esto confirma la eficiencia de este órgano, para contrarrestar el impacto de los peróxidos y especies reactivas generados por la exposición a los contaminantes. En el hígado se genera la mayor cantidad de radicales libres, debido a las reacciones oxidativas y por consiguiente, presenta la mayor actividad enzimática antioxidante (^{Güll et al., 2004}, ^{Avci et al., 2005}). Además, el hígado es el órgano más resistente al daño por radicales libres (^{Atli & Canli, 2010}). De acuerdo con esto, la actividad enzimática hepática de la SOD y la GPx se incrementó posiblemente, como una reacción ante la presencia de peróxidos y las especies reactivas, lo cual evitó un nivel mayor de peroxidación lipídica en este órgano. Sin embargo, se debe considerar que cada una de las enzimas antioxidantes presenta mecanismos de reacción, en los que intervienen procesos de activación e inactivación de las enzimas, además de la carbonilación de las proteínas, debido a la acción directa de la formación de radicales libres que pueden causar la pérdida en la actividad de las enzimas y la alteración de las proteínas de las membranas (^{Modesto & Martínez, 2010}).

La peroxidación lipídica está asociada a la presencia de radicales libres y un exceso de éstos, puede activar o inactivar a las enzimas antioxidantes como la SOD y la GPx, entre otras (^{Modesto & Martínez, 2010}). La SOD es la responsable de catalizar al radical superóxido reactivo (O2-) en peróxido de hidrógeno (H2O2) y la GPx participa en la reducción de peróxido de hidrógeno, en oxígeno y agua (^{Atli & Canli, 2010}).

La actividad de la SOD y la GPx indica la presencia de especies reactivas, generadas durante los procesos de biotransformación de los metabolitos y reaccionan de manera diferente en los tejidos. La SOD es la primera barrera del mecanismo de defensa antioxidante ante la presencia de iones superóxidos. Un abatimiento en la actividad de la SOD indica que la capacidad antioxidante de la enzima fue superada por productos superóxidos, como se observó en el músculo y en el hígado de C. humboldtianum. Lo anterior coincide con la disminución en la actividad de la SOD en tejidos de tilapias expuestas a oxyfluorfen y en Carassius auratus a triclorofenol señalados por (^{Peixoto et al., 2006}, ^{Li et al., 2007}) respectivamente.

Así mismo, el aumento de la actividad de la GPx y la disminución en el nivel de LPO en el hígado de C. humboldtianum, muestra la eficacia de este órgano en la neutralización y transformación de los peróxidos e hidroperóxidos orgánicos para su fácil eliminación. Sin embargo, las branquias y el músculo no respondieron de la misma manera, ya que la baja actividad de la glutatión peroxidasa demuestra la incapacidad del sistema antioxidante en estos órganos, para la neutralización y detoxificación de los peróxidos, dando como resultado un aumento en el nivel de lipoperoxidación. Lo anterior coincide con los resultados de ^{Ahmad et al., 2000}, donde señalan una capacidad menor de las branquias y los riñones para neutralizar el impacto de los peróxidos y especies reactivas generadas por contaminantes industriales en Channa punctatus.

El presente trabajo es uno de los primeros registros de la evaluación de la toxicidad por insecticidas en especies de peces nativos de México. Aún cuando todas las especies de Chirostoma presentan un alto grado de irritabilidad durante su manejo, que pudiera alterar su respuesta fisiológica ante el estrés, los resultados demuestran que las concentraciones probadas de carbofuran causan la muerte, además de daño neurotóxico y oxidativo en juveniles de C. humboldtianum, en concentraciones inferiores a las probadas en otras especies de peces.

Por otro lado, en este trabajo se analizaron los efectos del carbofuran sobre juveniles debido a que, en tallas menores, la cantidad de tejido no permite cuantificar el efecto, pero es de esperarse un efecto negativo mayor en larvas y juveniles más pequeños. Durante mucho tiempo, se ha argumentado que la disminución del tamaño de las poblaciones del género Chirostoma y su estatus en peligro de extinción, se debe a la falta de regulación de sus pesquerías y a la contaminación de los cuerpos de agua donde habitan. Sin embargo, no existen estudios que permitan demostrar lo segundo. En este caso, se demuestra la alta sensibilidad de C. humboldtianum al carbofuran y el efecto negativo de uno de los insecticidas de mayor uso en la agricultura en México y en el mundo. Las lesiones graves de este tóxico a los órganos blanco-probados demuestran la necesidad de desarrollar programas que permitan evaluar los efectos de los insecticidas sobre las especies de peces nativas y endémicas de importancia ecológica y económica, así como también, analizar exhaustivamente la calidad del agua de los sitios de distribución de las especies.