Microorganismos y medio

La cepa de levadura S. cerevisiae (ATCC^® 2601) y la bacteria Z. mobilis (ATCC^® 8938) se obtuvieron del laboratorio Microbiologis^® y usaron para la fermentación en sistemas coinmovilizados e inmovilizados. Ambos microorganismos se cultivaron en un medio (g L^-1), según lo descrito por ^{Demirci et al. (1997)}: 20 g glucosa, 6 g extracto de levadura, 0.23 g CaCl₂•2H₂O, 4g (NH₄)₂SO₄, 1 g MgSO₄•7H₂O, y 1.5 g KH₂PO₄, esterilizado en autoclave. Las cepas se mantuvieron en 250 mL de cultivo a 30 °C, pH 4.5, y agitadas a mano tres veces al día. Las transferencias de medio fresco se realizaron cada 24 h por 3 d previo al uso en experimentos. El medio de cultivo seleccionado permite crecimiento favorable para ambos microorganismos, similar a lo reportado para el medio de cultivo (^{Ramasamy y Paramasamy, 2001}) para S. cerevisiae y Z. mobilis, y permite el ajuste de contenido de azúcares totales (20 %) respecto al jugo de mango.

Preparación de células inmovilizadas y coinmovilizadas

Para preparar de células inmovilizadas se usó la técnica descrita por ^{Tam y Wong (2000)}. Ambos microorganismos se cosecharon por centrifugación a 3500 rpm por 10 min. Las bacterias y células de levadura se resuspendieron en 50 mL de agua destilada para obtener una suspensión celular concentrada. La suspensión se mezcló con una solución de alginato de sodio al 4 % (1:1 v:v) para obtener una mezcla de suspensión de 2 % microorganismos-alginato. La mezcla se transfirió a una bureta (50 mL) y se formaron gotas cuando se tituló a una solución de cloruro de calcio (2 %). Este método produjo unas 6500 esferas de alginato de 2.5 mm de diámetro con un contenido de biomasa para las esferas de Z. mobilis-alginate de 0.0055 g y para S. cerevisiae, de 0.00317 g por esfera por cada 100 mL de la mezcla microorganismo-alginato. Las esferas se mantuvieron 4 h en la solución de CaCl₂ a 25±2 °C; para que se endurecieran, se enjuagaron con una solución salina estéril (0.85 % NaCl) y después con agua destilada. Una concentración de 2.6 esferas mL^-1 de medio (equivalente a 1:25 esefera: medio v/v) se colocó en un Chemostat Ommi Culture Plus (Virtis) con 2 L de medio de cultivo. El reactor se mantuvo a 120 rpm y 30 °C.

Un procedimiento similar se usó para la coinmovilización. La diferencia fue que el concentrado de bacterias (25 mL) y levadura (25 mL) se mezcló primero, y luego se mezcló con 50 mL de alginato. Este procedimiento permitió retener la misma concentración de células en todos los experimentos.

Diseño experimental y procedimiento

En este estudio se evaluó el crecimiento en cultivos con células libres, inmovilizadas y coinmovilizadas, así como y la producción de etanol. También se evaluó el efecto de la concentración (50-100 g L^-1) en la producción de etanol en el sistema elegido en el primer experimento, con base en la productividad de etanol. Una concentración baja de sustrato se usó para prevenir el efecto inhibitorio del sustrato y los productos.

La fermentación se realizó en un Chemostat Ommi Culture Plus (Virtis) con un volumen de operación de 2 L, ajustando la agitación a 120 rpm y 30 °C. El medio fue similar al descrito por ^{Demirci et al. (1997)}, ajustando la composición a una concentración de 200 g L^-1 glucosa (20 % azúcares totales y 4.5 % azúcares reductoras), equivalente al observado en el jugo de mango.

El diseño experimental consistió de cultivos triplicados en un reactor Chemostat Ommi Culture Plus para S. cerevisiae y Z. mobilis en un cultivo de células libres, inmovilizadas y coinmovilizadas. Para cada experimento se recolectó la biomasa, así como muestras del medio de cultivo al final de cada fase logarítmica cada 20 h.

Para determinar los pesos libres de ceniza, cinco esferas se disolvieron en 5 mL de solución de 0.25 M de Na₂HPO₄•7H₂O (pH 7.0) por triplicado y filtradas con un filtro GF-C de fibra de vidrio (2.5 cm de diámetro), enjuagado con agua destilada e incinerada a 470 °C por 4 h. Las muestras se secaron a 120 °C y se dejaron 2 h a un peso constante en un horno convencional, luego en un horno de mufla 3 h a 450 °C . Los sólidos solubles de cada medio de fermentación se determinaron cada 20 h tomando 1 mL de alícuota de cada reactor y probando el nivel de °Brix en un refractómetro.

El contenido de etanol (%, v:v) se obtuvo usando el instrumento Anton Paar DMA 4100M, que determina la densidad de la mezcla en relación al estándar OIML-STD-90, que puede determinar el contenido de etanol destilado (v:v, %). Según la densidad de etanol registrada, se pudo obtener el contenido de etanol (g de etanol por L de cultivo) producido por cada experimento. Antes de determinar el contenido de etanol, se realizó una destilación de cultivos con un destilador de columnas de platos PS-DA-005/ PE de cuatro platos, a pequeña escala. El flujo de agua para enfriamiento fue 3 L h^-1 a 15 °C. Una alícuota de 3 L se destiló 4 h, manteniendo las condiciones de operación a presión atmosférica, sin reflujo y con una rampa de temperatura en el chaqueta de calentamiento de 30 °C hasta 80 °C.

Análisis estadístico

STATISTICA 7.0 se usó para el análisis estadístico, y se calculó el promedio y la desviación estándar para cada tratamiento. El análisis de covarianza (ANCOVA) se usó (p≤0.05) para evaluar el crecimiento en los cultivos de células libres, inmovilizadas y coinmovilizadas; además se usó la prueba de Tukey (p≤0.05).

Crecimiento

En cultivos de células libres, el crecimiento se observó de inmediato después de la inoculación en el reactor de 2 L. La cinética del crecimiento muestra una fase exponencial para S. cerevisiae y Z. mobilis de 120 h. Luego de este período de cultivo, ambas especies mostraron una reducción en la producción de biomasa, finalizando el tratamiento después de 200 h de cultivo. Los valores máximos de concentración de biomasa peso seco fueron de 14.18 g L^-1 y 11.80 g L^-1 para S. cerevisiae y Z. mobilis, respectivamente. Ambos microorganismos crecieron de manera satisfactoria bajo las condiciones de cultivo usadas en este estudio (Figura 1A), con una tasa de crecimiento específico (𝛍) mayor para S. cerevisiae (0.0547 d^-1) que para Z. mobilis (0.0418 d^-1). Las tasas de crecimiento específicas en cultivos de células libres para ambos microorganismos no fueron diferentes (p>0.05).

Figura 1: Incremento promedio de biomasa para Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis en cultivo de células libres (A) e inmovilizadas (B). 

Para las células inmovilizadas, tanto la levadura como las bacterias presentaron crecimiento inmediato después de agregar las esferas al medio de cultivo. En ambos tratamientos la fase exponencial de crecimiento alcanzó un máximo de 80 h. Aunque ambos microorganismos fueron inmovilizados con el mismo procedimiento, el contenido de biomasa por esfera al principio del tratamiento fue más bajo para Z. mobilis (0.0031 g) que S. cerevisiae (0.0039 g). A pesar de estas diferencias, ambos microorganismos toleraron la inmovilización (Figura 1B), con valores máximos de contenido de biomasa de 0.0055 y 0.0047 g por esfera para S. cerevisiae y Z. mobilis; esto mostró una tasa de crecimiento específico similar (0.142 d^-1) al igual que S. cerevisiae (0.106 d^-1).

Extracción de sustrato de glucosa

La reducción del sustrato presentó diferencias significativas (p≤0.0001) entre tratamientos con células libres e inmovilizadas para ambas especies (Cuadro 1). Sin embargo, las dos especies en cultivo libre no fueron diferentes (prueba de Tukey; p>0.05) en 200 h de tratamiento. Para los cultivos inmovilizados y coinmovilizados, sólo Z. mobilis inmovilizada no mostró diferencias significativas (p=0.245) durante la extracción del sustrato con el sistema coinmovilizado durante 140 h de cultivo (Cuadro 1).

♦ Promedios con letras diferentes son diferentes estadísticamente (Tukey; p≤0.05).

Cuadro 1: Tasa de remoción, productividad (Y) y mole de etanol producido por mole de glucosa para Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis en cultivo libre, inmovilizado y coinmovilizado. 

El sustrato consumido fue mayor en el cultivo libre para S. cerevisiae y Z. mobilis de 200 g L^-1 a 80 g L^-1 (60 % remoción) después del período de tratamiento de 200 h (Tabla 1), en comparación con el sistema inmovilizado con remoción del 40 % para S. cerevisiae (120 a 200 g L^-1) y 30 % de sustrato removido para Z. mobilis (140 a 200 g L^-1). En los cultivos de células coinmovilizadas, el consumo varió de 130 a 200 g L^-1 (35 % remoción) (Cuadro 1).

El análisis del consumo promedio basado en tasas de remoción determinadas durante el crecimiento exponencial para ambas especies mostró que el cultivo libre S. cerevisiae y Z. mobilis alcanzó tasas de remoción de 2.0 y 2.7 g sustrato g^-1 biomasa d^-1. Esto sugirió una mayor productividad para las bacterias (5.76 g h^-1) que la levadura (5.29 g h^-1) (Cuadro 1).

En cultivos con células inmovilizadas, la tasa de remoción en la fase exponencial (80 h) fue mayor para S. cerevisiae (0.165 g sustrato g^-1 biomasa d^-1) que para Z. mobilis (0.056 g sustrato g^-1 biomasa d^-1), pero en el cultivo coinmovilizado fue mayor (0.235 g sustrato g^-1 biomasa d^-1), ya que ambas especies contribuyeron a reducir la glucosa y a aumentar la tasa de remoción. En la productividad los resultados fueron similares: el cultivo de células coinmovilizadas tuvo valores mayores (8.80 g L^-1 h^-1) que las células inmovilizadas de S. cerevisiae y Z. mobilis (Tabla 1). Los mayores niveles de productividad se observaron en cultivos coinmovilizados e inmovilizados, debido al menor tiempo de producción de etanol (80 h) que en los cultivos libres (120 h).

Efecto de concentración inicial de glucosa sobre la producción de etanol

Para los coinmovilizados de Z. mobilis y S. cerevisiae dentro de las esferas de alginato hubo un aumento inmediato en la concentración de la biomasa. La concentración de la biomasa para ambos tratamientos presentó diferencias significativas (p≤0.002), pero los resultados sugieren que ambas concentraciones de sustrato permitieron el crecimiento favorable de bacterias y de levadura (Figura 2). La concentración mayor de biomasa en el tratamiento de glucosa a 50 g L^-1 (Gl₅₀) se obtuvo en las primeras 100 h de cultivo con 0.0063 g por esferas; mientras que para el tratamiento de 200 g L^-1 glucosa (Gl₂₀₀) fue 0.053 g por esfera durante 80 h (Figura 2).

Figura 2: Crecimiento (g biomasa esfera^‒1) en el sistema coinmovilizado a diferentes concentraciones de sustrato. 

El alcohol producido (%, v:v) no tuvo diferencias significativas (p>0.05) respecto a la concentración de glucosa. Sin embargo, las tasas de remoción muestran un declive al bajar el contenido de glucosa en el reactor (Cuadro 2). La tasa de remoción más alta fue con una concentración de 200 g L^-1 de glucosa con una remoción de 76.5 %, comparado con 50 g L^-1 de glucosa. La producción de alcohol fue similar en ambos tratamientos, pero la proporción mol-etanol producida por mol-glucosa consumida fue mayor en cultivos de 50 g L^-1 glucosa con un valor de 6.91, comparado con 200 g L^-1 glucosa con una proporción de 5.82 mol etanol producida por mol glucosa consumida (Cuadro 2). De manera similar, la productividad fue mayor con una concentración menor de glucosa, comparada con los medios con una concentración alta de glucosa.

♦ C₀: Concentración inicial de glucosa (g L^-1). Medias con letras diferentes son diferentes estadísticamente (Tukey; p≤0.05).

Cuadro 2: Productividad (Y), tasa de remoción y mol de etanol producido por glucosa con un contenido mínimo de glucosa para Zymomonas mobilis y Saccharomyces cerevisiase coinmovilizadas. 

Los sistemas inmovilizados tienen capacidad mayor de crecimiento celular y una alta actividad metabólica (^{Cohen, 2000}; ^{Mallick, 2002}); esto es consistente con los resultados de nuestro estudio. El resultado mostró tasa alta de crecimiento específica para Z. mobilis y S. cerevisiae inmovilizados con respecto a cultivos de células libres. Esto sugiere que la inmovilización afecta de forma positiva el crecimiento de ambos microorganismos y aumenta las concentraciones de biomasa. Además, la alta actividad metabólica en células inmovilizadas se observó con una reducción en la concentración de sustrato en un tiempo menor de tratamiento, comparado con otros cultivos de células libres. El tiempo breve de tratamiento para el cultivo de células inmovilizadas puede atribuirse al aumento de biomasa dentro de las esferas y, en consecuencia, un consumo inmediato del sustrato. Sin embargo, esto indica que con el aumento de la población celular, dentro de las esferas, los nutrientes pueden ser limitados, en especial para las células localizadas en el centro de las esferas, causando una reducción de la actividad celular (^{Uemoto y Saiki, 2000}; ^{Mallick, 2002}).

La rápida caída en la densidad celular para el cultivo de células inmovilizadas se podría atribuir a la producción de CO₂ debido a la actividad de fermentación. El efecto adverso del CO₂ se debe a que su difusión es menor que su producción y se acumula dentro de las esferas de alginato (^{Kim y Choi, 1984}). En nuestro estudio, el CO₂ observado en el reactor como burbujas en la superficie de las esferas sugiere que la difusión de CO₂ en las primeras 80 h no inhibió el crecimiento ni la producción de alcohol. Aunque la concentración de CO₂ no se determinó en nuestro estudio, después de este tiempo la saturación de gas en el reactor probablemente fue alta y afectó la difusión de CO₂. Esto quizá se deba a una limitación en el transporte de nutrientes y la inhibición subsecuente del crecimiento y causó un menor consumo de glucosa, comparado con las células libres (Cuadro 1).

Para el cultivo de células libres, el porcentaje bajo de alcohol obtenido por la levadura durante el período de cultivo de fermentación puede atribuirse a que esto es afectado (inhibición de metabolismo y reducción de eficiencia) por la concentración de etanol en el medio de cultivo, como lo reporta ^{Nuwamanya et al. (2012)}; a diferencia de la bacteria Z. mobilis según ^{Kim y Choi (1984)}.

En nuestro estudio, la biomasa menor producida por la bacteria (0.0047 g L^-1) con respecto a la levadura (0.0055 g L^-1) puede ser práctica desde el punto de vista de la generación de desechos. Este resultado es similar al reportados por ^{Amin y Verachtert (1982)} para Z. mobilis y S. bayanus inmovilizadas en carragenano con 5.6 g L^-1 y 9.9 g L^-1, respectivamente.

La producción de etanol no se inhibió en sistemas inmovilizados o coinmovilizados, e incluso presentó una mayor productividad que las células libres (Cuadro 1), lo que sugiere una eficiencia alta de conversión de azúcar para el sistema de células inmovilizadas. La productividad (Y) obtenida para Z. mobilis inmovilizada en alginato (8.7 g L^-1 h^-1) fue mayor a 1.6 g L^-1 h^-1 reportados para Z. mobilis inmovilizada en carragenano (^{Krishnan et al., 2000}). Esta diferencia podría atribuirse a la menor concentración de glucosa en el medio de cultivo (32 g L^-1) que los 200 g L^-1 usados. El resultado sugiere una mayor conversión de sustrato para los sistemas inmovilizados que para las células libres de levadura y bacteria. Estos resultados fueron mayores que los reportados por ^{Amin y Verachtert (1982)} para Z. mobilis y S. bayanus inmovilizadas en carragenano, con 1.8 a 1.9 moles de etanol producidos por mole de glucosa consumida. ^{Gunasekaran et al. (1986)} y ^{Krishnan et al. (2000)} sugieren que Z. mobilis es un buen candidato para obtener alcohol con 1.9 moles de etanol por mol de glucosa. Según ^{Rogers et al. (1979)}, la productividad específica de etanol (g etanol g^-1 peso seco de biomasa) es mayor para Zymomonas que para S. uvarum.

La inmovilización y la coinmovilización tuvieron tasa menor de remoción que las células libres, lo que muestra un consumo menor de sustrato (Cuadro 1). Sin embargo, la productividad mayor indica que es posible obtener un contenido alto de alcohol con un requerimiento menor de sustrato, pero la desventaja es la glucosa residual en el medio. Esto se puede resolver con sistemas secuenciados, según ^{Demirci et al. (1997)}. Otra alternativa para solucionar este problema es aumentar el número de células o el tamaño del inóculo dentro del reactor. Esto es razonable porque un número alto de células podría crear una absorción mayor de sustrato (glucosa) dentro de la célula y el sustrato podría ser consumido. Sin embargo, ^{Siripattanakul-Ratpukdi (2012)} sugirieron que con diferentes cargas de células de levadura se obtiene la misma reducción (>90 %) de sustrato al final de un tratamiento de 10 h.

La baja disminución de glucosa en nuestro estudio en esferas de alginato se puede deber a la reducción en densidad celular y difusión de sustrato dentro de la matriz de alginato. La adsorción del sustrato por la matriz se observó en las primeras horas del tratamiento, con una posible reducción de difusión de sustrato dentro de la matriz en un proceso continuo (^{Siripattanakul y Khan, 2010}).

^{Robinson et al. (1989)} sugieren que la tasa de difusión dentro de la matriz de alginato depende del gradiente de concentración entre el medio de cultivo y la matriz; es decir, cuando se reduce la concentración de nutrientes en el medio de cultivo, la tasa de difusión ocurre dentro de la matriz y por lo tanto la tasa de extracción. En nuestro estudio, durante las primeras horas de tratamiento el sustrato se redujo y es probable que la matriz tuviese saturación parcial con glucosa; pero esto no tuvo efecto negativo en el crecimiento de ambos microorganismos. Así, el sistema celular inmovilizado redujo la glucosa exitosamente por adsorción de la matriz (glucosa inmovilizada) y biodegradación (bioconversión de glucosa), y la biodegradación fue el proceso principal. Esto sugiere que el factor principal que pudo limitar la extracción de glucosa pudo ser la concentración alta de CO₂ en el reactor. Para cultivos inmovilizados, la concentración alta de glucosa disuelta en el medio de cultivo (200 g L^-1) causó reducción inmediata del crecimiento, comparado a cultivos con 50 mg L^-1. Sin embargo, esto no inhibió el crecimiento ni tuvo efectos negativos sobre la productividad ni el etanol producido (Cuadro 2).

La tasa alta de absorción para cultivos con 200 g L^-1 confirma que la concentración alta de glucosa satura las esferas más rápido, y permite una disponibilidad rápida de sustrato para los microorganismos dentro de las esferas (Cuadro 2). Sin embargo, los cultivos con concentración alta de sustrato no necesariamente sugiere una alta conversión de sustrato; a menor tasa de absorción (concentración mínima de sustrato), es posible obtener conversión mayor comparado con cultivos enriquecidos. Así, la concentración baja de sustrato del medio de cultivo indica la presencia de un transporte suave y acumulación de sustrato dentro de la matriz, y permite un consumo y crecimiento adecuados de las bacterias y la levadura. Por lo tanto, esto incluso podría aumentar la producción de alcohol con glucosa residual mínima, y alcanzar 6.91 moles de etanol por mol de glucosa, comparado con alta concentración de glucosa (Cuadro 2).