Material vegetal

En la ciudad de Parras, Coahuila, no existe un censo del número de árboles de aguacate, por lo que es difícil de estimar su abundancia, pero creemos que hay al menos tres o cuatro árboles por vivienda. Por tal motivo, la ciudad se dividió en cuatro cuadrantes y se eligieron los 13 árboles más representativos de los diferentes cuadrantes. Estos árboles se identificaron, georreferenciaron, se les tomó las mediciones y se recolectaron frutos y hojas maduras y jóvenes durante los meses de julio a septiembre del 2021 (Tabla 1). Con la relación entre tamaño de muestra y diversidad se comprobó que el tamaño de muestra fue el adecuado (ver Resultados y Discusión).

Caracterización fenotípica de los árboles

Las variables morfológicas que se evaluaron en los árboles de aguacate criollo fueron: edad, extensión, altura, forma, textura de la superficie del tronco, circunferencia del tronco, patrón de ramificación, distribución de las hojas y forma de las hojas. Todas estas medidas se basaron en los descriptores varietales para aguacates recomendados por el Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI) (^{IPGRI, 1995}). La edad de los árboles fue proporcionada por los dueños de los lotes correspondientes. Las variables cuantitativas de las características morfológicas fueron analizadas por medio de componentes principales utilizando el programa InfoGen v.2011.

Caracterización fenotípica de la fruta

Las variables morfológicas evaluadas en los aguacates criollos fueron: forma, longitud, diámetro de la fruta, peso, longitud y diámetro de la semilla, longitud y diámetro de la cavidad de acuerdo con el ^{IPGRI (1995)}. Se evaluaron cinco frutas de cada árbol. Los datos cuantitativos se analizaron mediante componentes principales y se calculó el coeficiente rho de Spearman para determinar la correlación de las variables. Para esto se utilizó el programa InfoGen v.2011.

Extracción de ADN

Se seleccionaron aquellas hojas sin lesiones ni signos de enfermedad y se limpiaron con etanol al 70%. La extracción de ADN se realizó de acuerdo con el protocolo de ^{Dellaporta (1994)}. En breve, el tejido vegetal se congeló con nitrógeno líquido y se molió utilizando un pistilo y mortero estériles. El polvo resultante se colocó en un microtubo de 2 mL. Se le agregó 600 µL de Solución de Lisis I (200 mM NaCl, 2 % SDS, 1 % polivinilpirrolidona, 25 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH8, 3 U proteinasa K y 2 % β-mercaptoetanol) se mezcló y se incubó 65 °C por 15 min. Después se agregaron 600 µL de Solución de Lisis II (2 % CTAB, 1.4 M NaCl, 2 % polivinilpirrolidona, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH8, y 2 % β-mercaptoetanol), se agregaron 600 µL de cloroformo: alcohol isoamílico (CIA) (24:1) y se mezcló por inversión. El tubo se centrifugó a 13,300 g durante 10 min. La fase acuosa se lavó de nuevo con CIA. Se precipitó el ADN utilizando 0.6 volúmenes de isopropanol y 30 µL de acetato de sodio 3 M. El ADN se lavó con etanol al 70% y se suspendió en TE (Tris- HCl 1 mM pH 6.4, EDTA 1 mM pH8). La integridad del ADN se evaluó por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y cuantificado por medio de espectrofotometría a 260/280 nm utilizando el espectrofotómetro de microplacas EPOCH (BioTek). El árbol número 13 no fue analizado genéticamente, solo morfológicamente.

Amplificación de los ISSR

Se probaron siete iniciadores (^{Escobar-Saucedo et al., 2022}) bajo condiciones estándar de la reacción de cadena de la polimerasa (PCR). Para cada reacción, los iniciadores se utilizaron a una concentración final de 2.5 µM, dNTPs a 250 µM, 2 mM MgCl₂, buffer 1x, 2 U de DNA polimerasa y 100 ng de DNA. Las condiciones de termociclador fueron las siguientes: una desnaturalización inicial a 94 °C por 1 min, seguido por diferentes temperaturas de alineación dependiendo del iniciador (Tabla 2) y una extensión a 72 °C por 2 min.

Análisis genético

Los productos de PCR se observaron en geles de agarosa al 1.5 % y cada banda se consideró como un locus, codificando ausencia como 0 y presencia como 1.

El porcentaje de polimorfismos de ISSR, diversidad genética, heterocigosidad esperada (He), número efectivo de alelos y la muestra mínima requerida fueron calculados utilizando InfoGen v. 2011 (^{Balzarini y Di Rienzo, 2003}). Para agrupar los diferentes genotipos evaluados, se construyó un dendrograma utilizando la distancia de Sokal Sneath 3 (sqrt(1-S)) ya que con esta se obtuvo la correlación cofenética más alta.

La estructura genética se determinó con un análisis de coordenadas principales con los datos de los patrones de bandeado de ISSR utilizando el software InfoGen v. 2011 (^{Balzarini y Di Rienzo, 2003}). Además, se realizó un análisis de conglomerados bayesiano para inferir la probabilidad de asignación individual a un número variable de conglomerados distintos, utilizando el software STRUCTURE 2.3.4 (^{Falush et al., 2003}, ²⁰⁰⁷; ^{Hubisz et al., 2009}; ^{Pritchard et al., 2000}). Se utilizó un enfoque de cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) para estimar el ajuste de datos a los grupos K. Las simulaciones se realizaron utilizando 10.000 repeticiones antes de comenzar a tomar los datos para el análisis, 100,000 iteraciones MCMC, y 10 repeticiones para cada K. Se seleccionó el número más probable de clústeres en función del valor máximo de ΔK siguiendo el método de Evanno utilizando STRUCTURE HARVESTER Web v0.6.94 (^{Earl y Vonholdt, 2012}).

Fenotipificación de los árboles

Se muestrearon un total de 13 árboles diferentes de aguacate criollo de Parras, Coahuila (Tabla 1). Las características morfológicas se presentan en la Tabla 3. El rango de edad varía de 5 a 47 años, siendo el árbol No.10 el más joven y el árbol No. 2 el más viejo. El árbol de mayor extensión es el No. 1 y el árbol de menor extensión es el No. 5. La forma de árbol predominante es de columna. La mayoría de los árboles presentaron textura de corteza lisa. La circunferencia del tronco varía de 41 a 201 cm. La mayoría de los árboles presentaron un patrón de ramificación extenso. La forma predominante de la hoja es ovalada. Todos los árboles presentaron ángulo de ramificación agudo y forma de base de hoja aguda. La mitad de los árboles tienen hojas ovaladas y la otra mitad hojas ovaladas-lanceoladas.

La forma columnar de los árboles, la altura promedio (8.27 m) y la circunferencia del tronco (112.69 m) concuerda con los árboles de aguacate criollo de Colombia evaluados por ^{López-Galé et al. (2022)}. Sin embargo, el patrón de distribución de las ramas difirió con este autor, ya que en este estudio se presentaron patrones más diversos.

La circunferencia máxima del tronco fue menor que la presentada en Norcasia, Colombia, pero la circunferencia mínima del tronco concuerda con los árboles muestreados en los tres sitios de Colombia evaluados por ^{López-Galé et al. (2022)}.

Las frutas de aguacate criollo también fueron evaluadas. Dos árboles presentaron aguacate blanco y once, aguacate negro (Tabla 4). El color de la piel de la fruta no determinó las otras variables. La longitud promedio de la fruta fue de 6.88 ± 1.21 cm, el diámetro promedio de la fruta fue de 4.45 ± 0.64 cm, y el peso promedio del aguacate fue de 75.06 ± 23.66. La longitud de la fruta coincide con los aguacates procedentes de Guerrero, México, y fueron más pequeños que los colombianos y los de Nuevo León; asimismo, el diámetro de la fruta de Parras fue menor comparada con la de Guerrero y Nuevo León (^{Acosta Díaz et al., 2018}; ^{Damián-Nava et al., 2017}; ^{López-Galé et al., 2022}). Las semillas fueron más pequeñas que las de los aguacates criollos mencionados por ^{Damián-Nava et al. (2017)}. El peso promedio de la fruta fue menor que el reportado por ^{Acosta Díaz et al. (2018)} para la región de Nuevo León.

Se realizó un análisis de componentes principales utilizando las variables evaluadas y estandarizadas (Figura 1). Para esto, se utilizó una matriz de correlación para que las variables involucradas tuvieran la misma importancia (^{Van Hintum et al., 2003}). Se encontraron asociaciones positivas fuertes en algunas variables. Por ejemplo, la longitud de la cavidad, la longitud de la semilla y la longitud de la fruta indicando que, aunque las frutas tienen una gran longitud, también poseen semillas grandes, las cuales cubren toda la cavidad. Una situación similar sucede con respecto al diámetro de la fruta, el diámetro de la semilla y el diámetro de la cavidad.

Figura 1 Análisis de componentes principales basado en variables morfológicas cuantitativas de árboles de aguacates criollos (en número de identificación). 

Figure 1. Principal components analysis based on quantitative morphological variables of creole avocado trees (by ID number). 

Por otro lado, los árboles de aguacate fueron agrupados de acuerdo con sus características morfológicas cuantitativas a través de un análisis de conglomerados. Éste mostró que los árboles 8 y 9, 13 y 12, y 10 y 3, se encuentran estrechamente relacionados (Figura 2).

Figura 2 Análisis de conglomerados de los árboles de aguacate criollo (en número de identificación) basado en características morfológicas cuantitativas.  

Figure 2. Cluster analysis of criollo avocado trees (in number ID) based on quantitative morphological characteristics. 

Variabilidad genética

En este estudio se utilizaron siete iniciadores, pero solo cinco amplificaron con el ADN de los árboles de aguacate criollos muestreados (Tabla 2). Se amplificaron un total de 50 loci, 10 bandas por iniciador. Este número fue similar al obtenido por ^{López-Guzmán y Palomino (2021)} en árboles de aguacate criollo de Nayarit, donde amplificaron de 12 a 17 bandas por ISSR. De la misma manera, los resultados son similares a los presentados por ^{Gutiérrez-Díez et al. (2015)} para los árboles de aguacate criollo en Nuevo León; pero se identificaron menos loci que los reportados por ^{Reyes-Alemán et al. (2018)} para árboles de aguacate de diferentes partes de México, en los cuales obtuvieron de 20 a 34 loci por ISSR, sin embargo, en este estudio se utilizaron iniciadores degenerados, lo cual aumenta la probabilidad de obtener más amplicones.

El análisis genético mostró que el 78 % de los loci presentaron polimorfismos, con un promedio de alelos de 1.78, un número efectivo de alelos de 1.46 y 87 alelos en total. Este nivel de polimorfismo es similar al presentado en árboles de aguacate criollo de Tecuala, Nayarit, con un polimorfismo de 78.05 % (^{López-Guzmán y Palomino, 2021}). La población de árboles de aguacate criollo de este estudio presentó una diversidad genética de Nei de 0.27, un índice de Shannon de 0.40 y una heterocigosidad esperada (He) de 0.29. Estos valores se encuentran dentro de lo esperado para aguacates criollos ya que los árboles de aguacate criollo de Nayarit tienen una He promedio de 0.25 utilizando marcadores moleculares ISSR (^{López-Guzmán y Palomino, 2021}). No obstante, la He en este estudio es menor que la de árboles de aguacate criollo de Nuevo León, ya que presentaron una He de 0.48 (^{Sánchez-González y Gutiérrez-Díez, 2020}).

Para asegurar que el número de árboles muestreados fue el suficiente para determinar la variabilidad genética de la población se determinó el número mínimo de muestra requerida. La Figura 3 muestra que la cantidad de árboles analizados fue suficiente para determinar la diversidad genética de la población, y que un número mayor de árboles muestreados no alteraría el resultado obtenido.

Figura 3 Determinación de la muestra mínima con un re-muestreo de 100 árboles. 

Figure 3. Determination of the minimum sample with a re-sampling of 100 trees. 

Con los datos de los loci identificados se generó un dendrograma para encontrar semejanzas y diferencias entre los árboles de aguacate. La distancia utilizada fue Sokal Sneath 3, ya que con esta se obtuvo la correlación cofenética más alta (0.866) (Figura 4). Se pueden identificar tres grupos, sin embargo, la distancia entre ellos es mayor al 60 % indicando que los árboles son genéticamente diferentes entre sí (^{Balzarini et al., 2006}). Esto discrepa del agrupamiento generado con las características morfológicas. Lo anterior podría deberse a que las características morfológicas se encuentran codificadas en loci específicos mientras que los ISSR son multilocus, distribuidos a lo largo de todo el genoma. Además, es posible que los ISSR utilizados no estén vinculados a genes codificantes para características morfológicas. Este tipo de discrepancia ya se había observado antes en árboles de aguacate de Tanzania donde los agrupamientos por morfología y genotipo determinados por SSR fueron diferentes (^{Juma et al., 2021}).

Figura 4 Dendograma obtenido de la matriz de distancia basado en el índice de similitud Sokal Sneath 3. Transformación: raíz cuadrada del complemento a uno de la semejanza. 

Figure 4. Dendrogram obtained from the distance matrix based on Sokal Sneath 3 similarity index. Transformation: square root of the complement to one of the similarity. 

Inferencia de la estructura poblacional

Se realizó un análisis de coordenadas principales para mostrar las relaciones definidas por las distancias o similitudes en un espacio de baja dimensión. El análisis del biplot explicó el 52 % de la variabilidad, la coordenada principal 1 explicó el 35.1 % de la variabilidad, mientras que la coordenada 2 explicó el 17.6 % (Figura 5). En general, se pueden observar dos grupos de genotipos. No obstante, estos agrupamientos no son específicos por lo que se realizó un análisis de conglomerados bayesiano para asignar los árboles de aguacate a un conglomerado específico.

Figura 5 Análisis de coordenadas principales de árboles de aguacates criollos, la clasificación se realizó utilizando los marcadores moleculares ISSR. El algoritmo utilizado fue emparejamiento positivo. 

Figure 5. Analysis of principal coordinates of creole avocado trees, the classification was carried out using the ISSR molecular markers. The algorithm used was positive matching. 

La inferencia de distintas subpoblaciones dentro de la población de estudio utilizando el programa STRUCTURE mostró que la población de árboles de aguacate criollo de Parras, Coahuila, se divide en dos grupos (Figura 6), donde el 80.91% de los árboles fueron asignados a un grupo con 95 % de confianza. Estos resultados indican que a pesar de que los árboles presentan grandes diferencias genéticas (Figura 4), se pueden clasificar en dos grupos diferentes.

Figura 6 Asignación de los árboles de aguacate criollo de Parras, Coahuila a una población. Cada individuo está representado por una sola línea vertical dividida en conjuntos de colores. La longitud del color en líneas verticales representa la proporción de pertenencia a cada uno de los dos grupos inferidos en cada individuo. Cada número corresponde a la identificación del árbol.  

Figure 6. Population assignment of creole avocado trees from Parras, Coahuila. Each individual is represented by a single vertical line divided into sets of colors. The length of the color in vertical lines represents the proportion of belonging to each of the two groups inferred in each individual. Each number corresponds to the identification of the tree.