Material vegetal

Se recolectaron muestras de follaje y de estróbilos femeninos maduros (conos) de la parte superior de la copa en 153 árboles de varias localidades (Figura 1). Se muestrearon 66 individuos de la variedad típica P. pseudostrobus var. pseudostrobus (Chiapas, México, Oaxaca, Puebla, Tlaxcala y Veracruz), 60 de oaxacana (Chiapas, Oaxaca, Puebla y Veracruz), 17 de coatepecensis (Veracruz) y 10 de apulcensis (Hidalgo).

Figura 1 Localización geográfica de los árboles muestreados en cada variedad de Pinus pseudostrobus . 

Características morfológicas y anatómicas analizadas

Cinco fascículos sanos y desarrollados (i. e., formados el año anterior) y cinco conos maduros, bien desarrollados, sin defectos o malformaciones aparentes se seleccionaron de cada árbol. Se obtuvo información de 20 características de acículas y 12 de conos con la metodología descrita por ^{Stead (1983}).

En follaje se midió el número de acículas por fascículo (NA), longitud de vaina (LV, cm), longitud (LA, cm) y grosor (GA, mm) de la acícula más larga del fascículo, coeficiente de forma de la acícula (CF_A = GA/LA, mm∙cm^-1) y la relación vaina-acícula (RV = LV/LA). Asimismo, en la sección media de la acícula más larga, en 5 mm de la cara dorsal, se contaron las serraciones o ‘dientes’ (ND), líneas con estomas (LE), estomas por línea (NE) y estomas totales (ET = LE x NE). En cortes transversales de la sección media de la misma acícula se contó el número total de canales resiníferos (CR_T) con posición externa (CR_E), interna (CR_I), media (CR_M) y septal (CR_S), y se calculó la proporción de canales resiníferos con posición media (PCR_M = CR_M/CR_T). Del mismo modo se contó el número de intrusiones de la hipodermis en el endodermo, el número de células hipodérmicas que tocan el endodermo (CH_E), el número de células endodérmicas en la superficie dorsal del haz vascular (CE) y la relación RC_H (CH_E/CE).

En conos cerrados se midió la longitud del pedúnculo (mm), la longitud (LC_C, mm) y diámetro máximo (DC_C, mm) del cono y se calculó su coeficiente de forma (CF_C = LC_C/DC_C); después se secaron a temperatura ambiente para abrir las escamas y extraer las semillas. Una vez abiertos los conos, se midió el diámetro máximo (DC_A) y se calculó su grado de apertura (GA_C = DC_A/DC_C). De la parte central de cada cono se separaron tres escamas fértiles a las cuales se midió el ancho (A_A, mm), profundidad (P_A, mm) y altura (Alt_A, mm) de la apófisis y con estos datos se calcularon las relaciones entre ellas (R_AP = A_A/P_A, R_AAlt = A_A/Alt_A y R_PAlt = P_A/Alt_A).

Análisis estadístico

Se realizó análisis de varianza univariado y multivariado para determinar la magnitud de variación de las características entre y dentro de las UTO, y evaluar su capacidad para la discriminación de las variedades putativas de P. pseudostrobus. En el análisis univariado se utilizó el procedimiento MIXED de SAS^® versión 9.4 (^{Statistical Analysis Software Inc., 2015}) para estimar los valores promedio de cada variedad putativa y, en los casos donde hubo diferencias significativas (α = 0.05), se hicieron comparaciones entre variedades con la prueba de Tukey. Las variables discretas se transformaron con la función raíz cuadrada para cumplir con los criterios de normalidad y homocedasticidad; sin embargo, los resultados fueron similares a los de las variables originales, por lo que se decidió presentar los análisis de los valores sin transformación. En el análisis multivariado, realizado con el procedimiento GLM de SAS, se determinó la significancia estadística del efecto de la variedad y se compararon las variedades oaxacana y apulcensis por medio de un contraste y el uso de características de acículas y conos por separado.

Para evaluar el efecto de las variedades oaxacana y apulcensis como UTO distintas, se estimaron los componentes de varianza en las variables que resultaron significativas en el análisis univariado. Se utilizó el procedimiento VARCOMP de SAS^® (2015) con dos modelos alternativos: el primero consideró las cuatro UTO putativas, mientras que el segundo agrupó las muestras de las var. oaxacana y apulcensis en la misma UTO.

La capacidad de discriminación de las características de acículas y conos se determinó con un análisis discriminante canónico (ADC) con cada grupo de variables por separado y en conjunto. Se utilizó la función ‘candisc’ (^{Friendly, Fox, & Friendly, 2021}) del software R v. 3.6.1 (^{R Core Team, 2020}) para estimar las variables canónicas (VC) y la representación gráfica de la estructura canónica. Las funciones lineales (criterio de discriminación) y su validación cruzada se calcularon con las funciones ‘lda’ y ‘predict’ del paquete MASS con la misma probabilidad (25 %) a priori de pertenencia (R Core Team, 2020; ^{Ripley et al., 2021}). Previo al ADC se utilizó el procedimiento STEPDISC (^{SAS, 2015}) para la selección de las variables de cada grupo con aportación significativa (P ( 0.05) al modelo de discriminación.

Diferenciación morfológica en acículas y conos

El Cuadro 1 muestra que las cuatro UTO estudiadas de P. pseudostrobus se diferencian por la morfología de acículas, ya que en 13 de las 20 características evaluadas se encontraron diferencias (P ≤ 0.05); las variables relacionadas con canales resiníferos y células hipodérmicas no fueron significativas (P > 0.1617). Aunque el coeficiente de forma de la acícula, longitud de vaina, número de acículas, número de intrusiones de la hipodermis en el endodermo y la proporción de canales resiníferos con posición media resultaron significativas (P ( 0.05), la prueba de comparación de medias no mostró diferencias en los valores promedio de las variedades, posiblemente debido al desbalance en el tamaño de muestra de las variedades comparadas. En el caso de estomas por línea y totales, los valores resultaron mayores para la variedad apulcensis en comparación con oaxacana.

El Cuadro 1 indica que la morfología en conos también mostró diferencias entre las variantes de la especie. La variedad tuvo efecto significativo en todas las variables evaluadas en conos (P ( 0.0110). Con excepción de la longitud de cono cerrado, en todos los casos se encontraron diferencias significativas entre oaxacana y apulcensis con valores promedio contrastantes en longitud del pedúnculo, diámetro de cono abierto, coeficiente de forma de cono, profundidad y altura de la apófisis. El análisis multivariado en acículas y conos mostró diferencias significativas entre variedades de acuerdo con los estadísticos de Lambda de Wilks, traza de Pillai y traza de Hotelling (P < 0.0001), así como el contraste entre oaxacana y apulcensis, con una Lambda de Wilks de 0.0411 en los caracteres de acículas y <0.0001 en los de conos.

Estructura de variación entre y dentro de variedades

La estructura de la varianza cambió al distinguir a la var. oaxacana de apulcensis. De acuerdo con el Cuadro 2, al considerar las cuatro variedades, la varianza entre UTO (σ² _var) aumentó entre 0.1 y 14.7 % (promedio 6.8 %) con mayor incremento en las variables estomas por línea y totales en acícula, y en altura de la apófisis, longitud de pedúnculo y diámetro de cono abierto. El aumento fue más evidente en las características con variación significativa entre variedades (Cuadro 1). El aumento en la varianza entre grupos y la reducción de la varianza dentro de grupos (σ² _arb(var)) (i. e., mayor homogeneidad dentro de variedades) al subdividir uno o más grupos, se interpreta como una evidencia de la diferenciación morfológica de acículas y conos entre las dos UTO que se separaron en el modelo. ^{Perry (1991}) discriminó las variedades basado en que oaxacana tiene el umbo de los conos más largo, prominente y erecto que la var. apulcensis; además, menciona que las hojas son más cortas y los conos más largos en apulcensis, aunque en este estudio no se encontraron diferencias (Cuadro 1).

Características importantes en la discriminación de variedades

De acuerdo con el Cuadro 3, el análisis STEPDISC consideró siete características de acículas y ocho de conos como las más importantes para la discriminación de las UTO putativas. En las características seleccionadas de conos resalta la altura de la apófisis, importante en la identificación taxonómica de las UTO, en especial para la var. oaxacana (^{Farjon, Pérez de la Rosa, & Styles, 1997}; ^{Perry, 1991}); sin embargo, la longitud del pedúnculo, coeficiente de forma y grado de apertura de cono, profundidad y relación profundidad/altura de la apófisis, longitud de cono cerrado y diámetro de cono abierto también fueron importantes en la distinción de las variedades, las cuales no habían sido reportadas en otros estudios.

En el análisis conjunto, 11 variables se seleccionaron, las ocho de conos y tres de acículas: estomas totales, canales resiníferos medios y células endodérmicas, esta última no resultó seleccionada en el análisis por separado (Cuadro 3). A pesar de que LA no fue importante en el análisis conjunto, esta variable y las relacionadas con canales resiníferos fueron útiles en el estudio de ^{Delgado et al. (2007}) para distinguir entre híbridos putativos de P. pseudostrobus; de igual manera, el número y longitud de acícula y los canales resiníferos medios mostraron amplia variación con un patrón clinal en P. patula (^{Dvorak, Jordan, Romero, Hodge, & Furman, 2001}). La varianza explicada por las características de acículas no seleccionadas en el análisis conjunto, en especial la longitud, puede estar contenida en las variables de conos por las correlaciones observadas con la relación profundidad/altura de la apófisis (r = -0.42), altura de la apófisis (r = 0.41) y diámetro de cono abierto (r = 0.37).

Análisis de discriminación canónica

Acorde con el Cuadro 4, la correlación canónica (r_c) resultó significativa (P ≤ 0.0271 para todas las variables canónicas (VC). En las de acículas, VC₁ explica 58 % de la varianza entre variedades, mientras que en las de conos VC₁ explica 72 %, y 68 % en el análisis conjunto (Cuadro 4; Figura 2). El valor de r_c entre los valores canónicos de los individuos y las dos primeras variables canónicas fueron mayores (0.64 ≤ r_c ≤ 0.87) en el análisis de conos y conjunto que en el de acículas (0.48 ≤ r_c ≤ 0.59). Esto es, las características de acículas mostraron menor capacidad de discriminación entre variedades (Figura 2a). En cambio, las dos primeras VC de las características de conos separan tres de las variedades, pero existe traslape entre var. pseudostrobus y apulcensis (Figura 2b). Aunque la inclusión de las características de acículas en general no agrega información adicional a la de conos en la discriminación de las primeras tres variedades, sí reduce el traslape de var. pseudostrobus y apulcensis (Figura 2c).

La matriz de estructura canónica muestra la relación bruta entre las variables de acículas y conos con las VC (Cuadro 5). Los coeficientes representan la contribución relativa de cada característica a las VC. En acículas, las variables estomas totales (ET) y líneas con estomas (LE) son las más importantes asociadas a VC₁, y longitud de acícula (LAc) y número de estomas (NE) a VC₂; en conos, las características altura (Alt_A) y profundidad de la apófisis (P_A), así como su relación (R_PAlt) son las más importantes asociadas a VC₁, mientras que el diámetro de cono abierto (DC_A) y coeficiente de forma de cono (CF_C) son importantes en VC₁ y VC₂. En el análisis conjunto ninguna variable de acículas es relevante para VC₁, pero ET y células endodérmicas (CE) son importantes en VC₂ y contribuyen a la separación de la var. apulcensis de las otras (Figura 2c).

Figura 2 Estructura de las variables canónicas (VC₁ y VC₂) de características morfoanatómicas de acículas (a), conos (b) y en conjunto (c) en la discriminación de cuatro variedades putativas de Pinus pseudostrobus. Acículas: LE = líneas con estomas, ET = estomas totales, RV = relación longitud vaina-longitud acícula, NE = número de estomas, NAc = acículas por fascículo, LAc = longitud de la acícula, CE = células endodérmicas. Conos: DC_A = diámetro de cono abierto, Alt_A = altura de la apófisis, P_A = profundidad de la apófisis, LC_C = longitud de cono cerrado, CF_C = coeficiente de forma, R_PAlt = relación profundidad/altura de la apófisis, LP = longitud del pedúnculo, GA_C = grado de apertura. 

La similitud morfológica de conos entre var. pseudostrobus y apulcensis se puede deber a la relación semisimpátrica que comparten (^{Carvajal & McVaugh, 1992}) y a la amplia variabilidad que posee la primera, en especial en la altura de apófisis que en ocasiones dificulta distinguirla (^{Farjon et al., 1997}); sin embargo, cuando se agregan características del follaje aumenta la capacidad de discriminación (Figura 1c). Al parecer, el número de estomas y de células endodérmicas, asociado al tamaño del haz vascular, son útiles para distinguir las variedades. Por un lado, la densidad de estomas es un rasgo funcional importante en el control del balance hídrico y la captura de CO₂ por unidad de área foliar (^{Hetherington & Woodward, 2003}); además, el tamaño del haz vascular (xilema y floema) influye en la eficiencia y seguridad hídrica, base en la regulación del intercambio de gases (^{Domec, Palmroth, & Oren, 2016}). En este sentido, los resultados apoyan las observaciones de que la var. apulcensis ocupa una parte del hábitat natural de la variedad típica, pero está ausente en ambientes más xéricos (Farjon & Styles, 1997). Las características de conos separan con claridad a la var. oaxacana de apulcensis, por lo que estas dos UTO no deberían considerarse sinónimos.

La aportación reducida de las características de acículas a la discriminación entre variedades se reflejó en los resultados de validación cruzada. El Cuadro 6 muestra que, al utilizar los dos grupos de variables, se alcanzaron porcentajes de acierto similares a los que se obtuvieron con las características de conos, con errores promedio de 7 % y 9.2 %. Las características de conos fueron más eficientes en la identificación y discriminación correcta de las UTO. La mayor facilidad y menor costo de medición de características en conos, en comparación con las de follaje, compensa las limitaciones y costos de recolección de conos que solo es posible en una época del año. No obstante, no debe excluirse la utilidad de algunos rasgos funcionales de valor adaptativo en las acículas como estomas totales y células endodérmicas. Este es el caso de la distinción de P. patula var. longipedunculata en la Sierra Madre del Sur con marcadores morfológicos de valor adaptativo (^{Dvorak et al., 2001}).

En el análisis de validación cruzada, la var. pseudostrobus presentó menor porcentaje de aciertos con los dos grupos de caracteres (Cuadro 6). La dificultad en su discriminación se debe a la variabilidad morfológica alta como resultado de la amplia distribución geográfica y de la interacción con otros procesos como la diversificación, seguida por flujo génico y tasas bajas de evolución (^{Gernandt & Pérez-de la Rosa, 2014}), que ocasionan mayor variación fenotípica con respecto a las otras variedades y dificultan su delimitación taxonómica (Figura 1). El amplio traslape que se observa en la variación morfológica de esta variedad con respecto a las otras puede deberse a individuos en zonas de transición intertaxa o en proceso de especiación, producto de hibridación introgresiva con otras especies del mismo grupo filogenético (^{Gernandt et al., 2009}). ^{Delgado et al. (2007}) solo lograron clasificar 40 % de los individuos híbridos putativos de P. pseudostrobus, debido a la gran variabilidad de las características morfológicas por hibridación con otras especies.

Los resultados del estudio confirman la amplia variación intraespecífica de P. pseudostrobus, coincidente con hallazgos en otras características fenotípicas como el desempeño y supervivencia de plantas en varios ambientes de crecimiento (^{Villegas-Jiménez, Rodríguez-Ortíz, Chávez-Servia, Enríquez-del Valle, & Carrillo-Rodríguez, 2016}; ^{Viveros-Viveros et al., 2005}; ^{Viveros-Viveros et al., 2006}), resistencia a heladas (^{Viveros-Viveros, Sáenz-Romero, López-Upton, & Vargas-Hernández, 2007}) y variación izoenzimática (^{Viveros-Viveros, Tapia-Olivares, & Sáenz-Romero, 2014}). La identificación de las UTO de P. pseudostrobus y el reconocimiento de la amplitud de la variación intraespecífica en características de valor adaptativo son requisitos indispensables para el manejo adecuado y uso sostenible de los recursos genéticos de la especie.