1. Introducción

Los laboratorios clínicos son una parte esencial del sistema de salud en México, sin embargo, enfrentan diversos desafíos que los hacen ser uno de los departamentos más discriminados. Entre estos desafíos se encuentran la necesidad de una sólida gestión administrativa y la dependencia de una amplia infraestructura, recursos materiales y personal altamente capacitado. Estas dificultades se vuelven especialmente críticas en el contexto del diagnóstico temprano de enfermedades, como la neumonía, que constituye la segunda causa de muertes por infecciones respiratorias en el país [¹] y la quinta causa de muerte en general [²], en la Tabla 1 se muestra una relación de las principales causas de muerte en el 2021.

Para detectar enfermedades causadas por microorganismos, como la neumonía, los laboratorios clínicos llevan a cabo exámenes que incluyen la inoculación de muestras en medios de cultivo para la proliferación de dichos microorganismos [³, ⁴]. Lamentablemente, estas técnicas de inoculación aún son realizadas de forma manual, lo que retrasa el avance tecnológico y la automatización del proceso [⁵-⁷].

La falta de automatización en la siembra de microorganismos en los laboratorios clínicos puede tener un impacto negativo en la eficiencia, precisión y capacidad de respuesta de estos laboratorios, ya que la implementación de tecnologías automatizadas puede ayudar a superar estos problemas y mejorar significativamente la calidad de los servicios de diagnóstico y atención médica proporcionados por los laboratorios clínicos, permitiendo mejorar los flujos de trabajo y reducir el uso de recursos [⁸-¹⁰].

Sin embargo, la automatización presenta desafíos significativos: la contaminación cruzada que puede ocurrir durante la inoculación, así como la descontaminación y esterilización posterior. Resolver este problema se vuelve crucial para garantizar resultados precisos y confiables en el diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas [¹¹].

En este contexto, es fundamental abordar los obstáculos que enfrentan los laboratorios clínicos en México para lograr una mejora significativa en la detección y diagnóstico de enfermedades, y así contribuir a la salud y bienestar de la población. La implementación de tecnologías automatizadas y métodos de prevención de contaminación podría marcar la diferencia en la eficiencia y precisión de los servicios médicos proporcionados por estos laboratorios. Para ello se propone el desarrollo de un dispositivo que automatice el proceso de inoculación de microorganismos de manera automática, haciendo énfasis en eliminar la contaminación cruzada sin comprometer el funcionamiento correcto de los materiales utilizados, así como su esterilización.

2. Estado del arte

Para que la automatización tenga éxito, debe ser flexible para reafirmarse, adoptar el elemento humano y adaptarse a los desafíos de la diversidad de muestras, entendiendo lo anterior mencionado, se muestra en la Figura 1 el proceso que se debe seguir en el proceso manual para obtener las siembras de microorganismos [¹²-¹⁴].

Figura 1 Flujo de trabajo para obtener cultivos microbiológicos (Fuente propia). 

La etapa preanalítica ocupa una gran parte de la carga de trabajo, donde la inoculación de las muestras en placas de agar consume el 25% del tiempo de procesamiento inicial de las muestras [¹⁵]. Actualmente existen equipos con diferentes diseños y alcances de automatización para la siembra de muestras que se comunican con el sistema informático del laboratorio y permiten seleccionar el tipo de medios de cultivo, inoculan, siembran y etiquetan las placas. Estos equipos pretenden resolver problemas de calidad y estandarización de la estría o inóculo, contaminación cruzada, tiempo de procesamiento y costos en reprocesos, por consiguiente, ahorro en tiempo y reactivos [¹⁶, ¹⁷]. En términos generales, todos estos equipos utilizan muestras líquidas o medios de transporte líquido.

Si bien, cada fabricante puede tener sus técnicas de cultivo, el problema de esterilización y contaminación cruzada sigue estando presente, para disminuir estos problemas, en técnicas manuales se controlan variables que garanticen una mejor bioseguridad para el usuario y un mejor resultado de siembra [¹⁸]. Las variables involucradas son las siguientes [¹⁹]:

Donde, las variables resaltadas son las de mayor importancia en el diseño del dispositivo, ya que, son propias del proceso, las que no están resaltadas se dividen entre la toma de muestra (ajena al proceso) y tareas que se anulan por efecto de la automatización.

Temperatura

Los microorganismos tienen un margen de temperaturas en el cual pueden crecer. Este margen viene delimitado por la temperatura máxima de crecimiento, a partir de la cual no pueden vivir e incluso mueren; la temperatura mínima por debajo de la cual no pueden crecer, aunque generalmente no mueren; y la temperatura óptima a la cual ofrecen el mejor crecimiento. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto, al tiempo de generación). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienen constantes) muestra una curva característica, como la mostrada en la Figura 2, de tasa de crecimiento en función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos llamados temperaturas cardinales [²⁰].

Figura 2 Efectos de la temperatura en el crecimiento microbiológico. [²³] 

Durante la siembra, es esencial mantener una temperatura adecuada en el laboratorio. Una temperatura excesivamente alta o baja puede afectar la estabilidad de los medios de cultivo y la calidad de los resultados. Por lo general, se busca mantener una temperatura ambiente controlada y estable en torno a 20°C a 25°C [²⁰].

2.1. Luz UV-C como germicida

La luz UV es la radiación electromagnética con longitud de onda más corta que la luz visible y más larga que los rayos X; se divide en UV-Cercano (380-200 nm), UV-Lejano (200-10 nm) y UV-Extremo. Considerando el efecto de la radiación sobre la salud humana y el medio ambiente, a una longitud de onda de 100 a 400 nm, se divide en: UV-A (320-400 nm), UV-B (280-320 nm), UV-C (200-280 nm) y Vacío-UV (100-200 nm) (a veces considerada UV-C o UV-Extremo). En la literatura, han sido documentadas variaciones en los intervalos y la nomenclatura. La luz UV-C posee el mayor efecto germicida, específicamente entre 250 y 270 nm, y la máxima eficiencia para la desinfección se sitúa específicamente a 254 nm [²¹].

La inactivación del número de microorganismos depende principalmente de la dosis, pudiéndose compensar un menor tiempo de exposición con una mayor irradiación. La dosis necesaria para conseguir inactivaciones del 99, 99,9 y 99,99% son, respectivamente: 2, 3 y 4 veces la dosis para un 90% de inactivación o un 10% de supervivencia, es decir, si una determinada exposición a los rayos UV inactiva al menos el 90% de una población bacteriana, duplicar el tiempo o la intensidad de la exposición puede inactivar el 90% del 10% de microorganismos restantes, para una eficacia germicida general del 99%. En la mayoría de los casos las dosis usadas abarcan un intervalo desde los 0,2 hasta los 20 kJ/m2 [²²]. En la Tabla 2 se muestra una relación entre los microorganismos a eliminar y la dosis de radiación necesaria.

Ahora bien, igualmente la distancia entre la lámpara y el sustrato, el grado de turbidez de la vía de propagación de la luz, afectan la dosis que finalmente alcanza la muestra. Igualmente, este tipo de tratamiento requiere que toda la superficie del objeto quede expuesta a la luz UV durante el tiempo suficiente para que cualquier microorganismo presente pueda acumular la dosis letal. Por lo que es limitada la capacidad de predicción de la tasa de desinfección de la luz UV. Dado que pueden producirse interacciones complejas entre los microorganismos y la composición de la superficie, la eficacia de la luz UV depende de la estructura de la superficie o topografía y presenta su limitación debido al efecto sombra. Una distancia menor o igual a ocho pies es una distancia adecuada para un 99.9% de desinfección, considerando un tiempo de funcionamiento de aproximadamente 30 minutos [²³]. La intensidad de irradiación (mW/cm²), se puede calcular mediante la ecuación (1).

Donde:

Mecanismo de desinfección

El mecanismo de desinfección por luz UV-C, se efectúa por una reacción de foto sensibilidad del microorganismo ante la radiación de onda corta, en donde su ADN es afectado, logrando de esta manera la inactivación. La reacción de inactivación ocurre debido a un mecanismo de dimerización del ADN, efecto que es causado debido a la inducción de la formación de dímeros de pirimidina, que alteran las hélices de ADN y los bloques de replicación de las células microbianas, que destruyen la capacidad de reproducción y otras funciones de la célula. El mecanismo de daño biológico es consistente con la absorbancia de la luz ultravioleta por el ADN, que alcanza su máximo en la banda UV-C alrededor de 260 nm [²⁴], el daño puede verse representado en la Figura 3.

Figura 3 Dimerización del ADN, como efecto de la incidencia de luz UV-C [²⁵] 

3. Metodología

Por medio de una investigación mixta de alcance experimental, se desarrollaron modelos 3D con el software fusión 360 del dispositivo de automatización para inoculación en medio de cultivo. Se realizó el modelo de la zona de inoculación, tomando como inspiración el funcionamiento de las incubadoras neonatales, ya que según CENETEC, la incubadora neonatal es un equipo médico cerrado, que consta de un capacete transparente lo que permite aislar al paciente sin perder contacto visual con él, con el fin de proporcionarle un medio ambiente con temperatura y condiciones preestablecidas, esto para favorecer el desarrollo del neonato [²⁵, ²⁶], a diferencia del neonato, el desarrollo en el diseño es para crear un ambiente optimo con las variables controladas necesarias para el crecimiento microbiológico en la zona aislada, los aspectos importantes que se consideraron en el diseño son; la doble cúpula o capacete y el principio de transferencia de temperatura por convección [²⁷], justificados por su simple mecanismo en el que se hace ingresar un flujo de aire del exterior, se calienta con una resistencia y se dirige con un ventilador hacia el espacio existente entre la doble cúpula, se consideró un área para el flujo de entrada y una de salida, aquí donde termina su recorrido dentro del capacete para posteriormente ser expulsado hacia el exterior, es importante mencionar que en el recorrido que realiza el flujo de aire se colocan sensores de temperatura y controles que manipulan las variables para obtener las acciones deseadas, así como la implementación de filtros de aire que cumplen con otra función preventiva del ingreso de partículas contaminantes y la salida de estos mismos.

El control de la temperatura es fundamental en el proceso automático, por ello, se hace uso de la teoría de control clásico [²⁸], se usa el esquema de lazo cerrado de la Figura 4.

Figura 4 Diagrama de bloques de un sistema de control de lazo cerrado [²⁹]. 

Donde, la planta a controlar está constituida por el sistema de temperatura, el diseño del controlador se ha hecho pensado en el problema que existe al manipular la temperatura que es una dinámica lenta. El sistema térmico estará constituido por una resistencia calefactora, montada sobre una placa que estará debajo del capacete [³⁰, ³¹].

La etapa de potencia, está constituida por una fuente de corriente que tiene como elemento de potencia un transistor. Para la retroalimentación, se usará un sensor de temperatura comercial como lo es el LM35DZ, este se colocará en el área de salida del flujo.

En la etapa de control, el diseño de la acción proporcional nos otorgara la diferencia entre el valor medido de la variable y el valor de referencia. Esta diferencia, conocida como error, se multiplica por una constante proporcional (Kp), donde la acción proporcional responde de manera directamente proporcional al error, la acción integral toma la integral del error acumulado y lo multiplica por una constante integral (Ki) para obtener la salida del controlador y finalmente la derivativa que permite evitar las fuertes oscilaciones que se pueden producir en torno a la referencia dotando al sistema de dotar al sistema de una cierta capacidad de “anticipación”.

Se desarrolló el control PID de manera que se pudieran variar las ganancias de cada acción para encontrar los valores que mejor se adapten a nuestra planta. La faceta estética del proyecto se plasmó mediante el uso de MDF de 3mm como material base, y su diseño se desarrolló utilizando la plataforma Fusion 360 para crear vectores de corte y mediante el uso de la herramienta “origin” propia del software, se exporto como archivo SVG para cortarse en una maquina CNC laser.

El diseño del PID se realizó de manera electrónica, esto pensando en disminuir la demanda computacional para el prototipo, bajo esta premisa, se emplearon amplificadores operacionales TL084 que albergan internamente cuatro amplificadores operacionales de entrada JFET de alta velocidad.

Se realizaron pruebas del controlador en el software de Matlab, donde se le otorgaron valores simulados de una planta con un comportamiento similar al que se utiliza y su respuesta a un escalón unitario. Posteriormente, de realizo el modelo 3D en Fusion360 de un cuarto oscuro, esto con la intención de detectar la mejor posición que debe tener la fuente de luz UV-C respecto al material radiado y así tener la mayor exposición de dosis letal.

Se construyó el cuarto oscuro con dimensiones de 55cm de largo, 15cm de base mayor, 12cm base menor y 20cm de alto, con lamina lisa de calibre 90 y una fuente de luz UV comercial de longitud de onda 254nm, 15W y 120V.

Se realizaron cultivos de bacterias Gram (+) y Gram (-) con la intención de someterse a la radiación de la luz comercial y analizar sus efectos sobre las mismas [³², ³³]. Se realizaron los cálculos tomando en cuenta los materiales utilizados:

• Para la determinación de la intensidad de la lámpara se usa la fórmula de irradiación de una fuente de luz (2), en unidades de potencia (watts) por m², luego se transforma a unidades de W/m² para el uso de las dosificaciones recomendadas.

• La determinación del tiempo de exposición se encuentra representada por (3):

Donde:

Por tanto, las dosis obtenidas son:

Para determinar la eficacia de la descontaminación se utilizó el cálculo de reducción bacteriano, este se logra realizando un conteo bacteriano antes de comenzar el proceso. El resultado se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro o por gramo de muestra.

1. Después de completar el proceso de desinfección o tratamiento, se toma una muestra de la muestra tratada y se realiza un conteo bacteriano nuevamente. Esto proporcionará el número final de bacterias que quedan después del proceso. Al igual que en el paso anterior, el resultado se expresa en UFC por mililitro o por gramo de muestra.

2. La reducción bacteriana se calcula restando el número final de bacterias (NF) del número inicial de bacterias (NI) y dividiendo el resultado entre el número inicial de bacterias (NI). La fórmula para calcular la reducción bacteriana es (4):

3. La reducción bacteriana se expresa típicamente como un porcentaje, lo que indica la disminución de la población bacteriana después del proceso. Para ello, el resultado se multiplica por 100%.

A continuación, se muestran en la Figura 5 las áreas del proceso de inoculación y donde se realizarán las acciones anteriormente mencionadas, la toma de muestra, aunque es parte del pre analítico no se considera dentro de la automatización por lo que esta seguirá siendo tomada por personal capacitado o un profesional del área.

Figura 5 Proceso de automatización y áreas importantes de desinfección y control de temperatura. (Fuente propia). 

6. Resultados

Tomando en cuenta las características físicas de las incubadoras neonatales, se desarrolló el modelo del dispositivo, contando con la doble cúpula y entradas y salidas de aire, esto se muestra en la Figura 6.

Figura 6 Modelo 3D de dispositivo de inoculación en Fusion360 (Fuente propia). 

El proceso se realiza en un total de 4 departamentos, en la primer área, se elige el tipo de estriado entre una serie de patrones mediante un desplazamiento en el eje Z, posteriormente, avanza a la segunda área donde el dispositivo con el patrón del inóculo se impregna de muestra, en el tercer departamento se realiza el inoculo con el control de la variables para finalmente concluir en el cuarto departamento donde se realiza la esterilización de las áreas y se reinicia las configuraciones para comenzar nuevamente el proceso.

El diseño del PID se llevó de dos partes, la carcasa, se aprecia en la figura 7 el render del modelo 3D en fusión 360 y su corte en una maquina CNC y ensamblaje físico en la figura 8.

Figura 7 Modelo 3D de la carcasa del control PID en Fusion360 (Fuente propia). 

Figura 8 Modelo físico de la carcasa del control PID (Fuente propia). 

La segunda parte del control PID se divide en el segmento electrónico, en el que se desarrollaron los circuitos electrónicos mostrados en la Figura 9 y se realizó su parte física en baquelita con la técnica de planchado.

Figura 9 Circuitos electrónicos, Restador del lado izquierdo y Kd del lado derecho (Fuente propia). 

Se probó el funcionamiento del controlador con un motor de DC como planta que permite controlar la posición del mismo [³⁴], para ello se utilizó un osciloscopio, un setpoint que varía de 1-5V y un potenciómetro acoplado al eje rotatorio del motor que toma el trabajo de sensor, las pruebas se observan en las señales de la Figura 10.

Figura 10 Pruebas del controlador en osciloscopio (Fuente propia). 

La señal amarilla representa el valor deseado o el comportamiento que queremos tener en el sistema y la azul el error, a su vez, del lado izquierdo acción proporcional y lado derecho acción proporcional con KP que hace que el sistema se encuentre en estado crítico. En ambos casos, las variables K del controlador PID hacen que el sistema reaccione de formas distintas.

Con el correcto funcionamiento del controlador PID analógico, se cambió la planta a una de control de temperatura, donde se realiza el sensado por medio de un transductor de temperatura y se corrige el error haciendo aumentar o disminuir el voltaje en una resistencia eléctrica calefactora, con esto, se garantiza una temperatura adecuada en el interior del tercer departamento donde se realiza el inoculo.

Para el modelo del cuarto oscuro, se tomaron en cuenta las medidas y distancias adecuadas para obtener mejor dosis de exposiciones de la luz UV-C, en base a eso se realizó el diseñó del sistema tal como se muestra en la Figura 11, este sirvió como base para realizar la construcción física, tal como se ve en la Figura 12.

Figura 11 Modelo 3D de cuarto oscuro en Fusion360 (Fuente propia). 

Figura 12 Construcción de cuarto oscuro (Fuente propia). 

Se construyó el cuarto oscuro para realizar las pruebas de exposición de diversos microorganismos [³⁵].

Los microorganismos utilizados para la exposición fueron colonias de bacteria tomadas de colonias lactobacillus Gram (+), lactobacillus Gram (-), así como muestras de diversas frutas (manzana, fresa, guayaba, pera, tomate y aguacate), todas a la misma exposición de tiempo y distancia, los resultados son representados en la Tabla 3.

Se logró controlar el disparo de luz UV en tiempos programados, según los resultados obtenidos, la mejor dosis se logra con un tiempo de exposición de 5 minutos en el área designada para el dispositivo, ya que, con 1 minuto aún hay crecimiento de microorganismos y con 10 minutos o más, es mínima la diferencia que existe en comparación a 5 minutos, con el problema que hace lento el proceso y genera calor que puede dañar la integridad del agar.

4. Conclusiones

La siembra microbiológica permite el cultivo y aislamiento de microorganismos para su posterior análisis y estudio. La correcta realización de esta técnica requiere prácticas en condiciones ideales y esterilización para evitar la contaminación cruzada y obtener resultados precisos.

En el contexto de la desinfección y esterilización, la luz ultravioleta (UV) es una alternativa atractiva a los productos químicos desinfectantes debido a su capacidad germicida y la ausencia de residuos tóxicos. La irradiación UV actúa dañando el material genético de los microorganismos, lo que inactiva su capacidad de replicarse y los destruye. Sin embargo, es importante considerar las limitaciones de la luz UV en términos de penetración y sensibilidad de ciertos microorganismos.

A su vez, la implementación de un control PID es útil para eliminar errores en estado estacionario, lo que garantiza que el sistema alcance el valor de referencia de temperatura con precisión y rapidez, a su vez, al hacerlo analógico, ofrece simplicidad y respuestas en tiempo real sin la latencia asociada con la conversión digital. Esto es especialmente importante ya que, la respuesta por si sola es lenta y se busca obtener mayor velocidad en el control, además, suelen ser más simples en diseño y construcción en comparación con sus contrapartes digitales ya que no requieren sistemas de procesamiento altos. Esto se traduce en costos de fabricación más bajos, lo que puede ser ventajoso.

Por otro lado, es importante mantener una temperatura ambiente controlada y estable en el laboratorio y la zona de inoculación para garantizar la estabilidad de los medios de cultivo y preservar la viabilidad de las muestras.

En general, tanto la siembra microbiológica como el control de temperatura y desinfección de las zonas aisladas son cruciales para el diagnóstico y la investigación en microbiología. Al seguir protocolos adecuados y mantener un control riguroso en todas las etapas de estos procesos, se puede garantizar la precisión y confiabilidad de los resultados microbiológicos deseados para la correcta automatización del proceso de inoculación.