Introducción

La hiperplasia intimal es la respuesta celular y molecular caracterizada por una proliferación continua y anormal, predominantemente de células musculares lisas, tejido conectivo y matriz extracelular, que conduce a hiperplasia de la capa íntima del vaso y estenosis luminal¹,². Varios factores de crecimiento, que estimulan la proliferación celular, son las principales moléculas reguladoras del crecimiento para las células in vitro y probablemente también in vivo³. Estos factores de crecimiento se han identificado como precursores en la generación de hiperplasia intimal. Es de particular interés, que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ha sido identificado como un marcador de hiperplasia intimal del endotelio vascular⁴. Es importante reconocer la expresión de mediadores durante la patogénesis de la hiperplasia intimal, los cuales incluso pueden ser potenciales blancos terapéuticos⁵. En las fases iniciales del desarrollo de hiperplasia intimal se ha demostrado que los factores de crecimiento constituyen importantes reguladores de migración y proliferación celular². Los factores de crecimiento más importantes de proliferación y migración celular son péptidos que tienen la capacidad de unirse a receptores de tirosina cinasa⁶. Los dos factores de crecimiento más estudiados son PDGF y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Existe evidencia de liberación de PDGF durante los primeros minutos posteriores a la manipulación de células endoteliales. El FGF tiene una liberación en etapas más tardías⁷-⁹.

El PDGF fue originalmente descrito en sangre, pero también es producido por células musculares lisas y endoteliales. Se trata de una glicoproteína compuesta por dos cadenas de polipéptidos con peso de 27 a 31 kd. El PDGF está formado por moléculas diméricas que pueden existir como homodímeros o heterodímeros de dos cadenas peptídicas diferentes pero relacionadas, llamadas PDGF-A y PDGF-B (es decir, PDGF-AA, PDGF-BB y PDGF-AB). Las células endoteliales secretan de forma predominante, el homodímero PDGF-BB. El PDGF es un importante mitógeno y desempeña un papel importante en la migración de células musculares lisas desde la capa media a la capa íntima¹⁰-¹².

La producción de este factor de crecimiento se ha evaluado experimentalmente. Los injertos venosos implantados en la circulación arterial aumentan de forma significativa la producción de PDGF. Cuando estos injertos son reimplantados en la circulación venosa, la producción disminuye¹³. La administración de antagonistas contra el PDGF en ratas sometidas a angioplastia arterial provocó una reducción del 40% de hiperplasia intimal¹⁴. El PDGF se libera durante los primeros minutos después de la manipulación del endotelio vascular¹⁵. Es un importante factor quimioatrayente que estimula la migración de las células musculares lisas hacia la capa íntima durante los primeros 7 días después del daño endotelial. Secundario a ello, las células musculares lisas cambian su fenotipo contráctil a uno proliferativo⁵. A partir de entonces, el posterior engrosamiento intimal depende casi exclusivamente de la deposición de matriz extracelular, sobre todo estimulada por el FGF¹⁶. Debido al importante papel del PDGF en la generación de hiperplasia intimal, la terapia antiplaquetaria se ha propuesto como un modulador en la respuesta endotelial, teniendo como objetivo terapéutico el bloqueo de la activación de las plaquetas¹⁷-¹⁹.

El objetivo de nuestro estudio fue evaluar la hiperplasia de la íntima y su asociación con el PDGF en un modelo experimental (conejo de raza Nueva Zelanda) de lesión tensional (barotrauma) en la vena femoral por medio de una lesión inducida por balón. De esta forma se puede desarrollar un modelo experimental para el estudio de nuevos objetivos terapéuticos en hiperplasia intimal venosa.

Material y métodos

Resultados

El modelo experimental demostró generar hiperplasia intimal en el endotelio venoso. Este modelo piloto fue factible y reproducible. El conejo de raza Nueva Zelanda como modelo experimental para la hiperplasia intimal cumplió las expectativas técnicas sin complicaciones (0% de mortalidad, 0% de morbilidad). La hiperplasia intimal producida por el modelo se demostró con el análisis histopatológico.

La medición de la capa íntima en el grupo de venas de control fue 126.12 mm² ± 10.8, y en el grupo experimental, 232 mm² ± 22.7. La diferencia entre el grupo control y el grupo experimental fue de 106 mm² ± 11,9. Al comparar el grupo experimental frente al grupo control, se observó una diferencia estadísticamente significativa (Fig. 1).

Figura 1 Histoquímica transversal. A: vena control (sin manipulación) y vena con lesión inducida por balón, al séptimo día en cada caso. Escala (barra) = 100 μm. B: grupo control vs. grupo con lesión inducida por balón, al séptimo día (área mm² ± SEM). Para el análisis histológico se utilizó imagen de microscopia óptica AXIOVERT. El análisis de densitometría se realizó con el software Image J versión 1.x. Se utilizó una prueba ANOVA de una vía seguida de una prueba post-hoc de Tukey para comparación de las medias. Nivel de significancia *p ≤ 0.05. SEM: standard error of the mean. 

En la medición de las concentraciones séricas de PDGF-BB en el grupo experimental, los niveles a las 0 horas fueron de 0.22 pg/ml ± 0.04. Se observó un pico a las 12 horas de 0,42 pg/ml ± 0,20, que disminuyó hacia el séptimo día a 0,17 pg/ml ± 0,09 (Fig. 2).

Figura 2 Niveles séricos PDGF-BB dependientes del tiempo después de una lesión inducida por balón. En el suero del grupo experimental, se analizó PDGF-BB (pg/ml) al tiempo 0.12 horas y 7 días. El análisis se realizó en un espectrofotómetro de microplacas Sky Multiscan. Grupo experimental n = 6 por grupo. 

Discusión

Este trabajo de investigación evalúa los primeros eventos de hiperplasia intimal, centrados en las señales fisiopatológicas secundarias a una lesión vascular por barotrauma sobre un endotelio venoso. Para este fin, hemos desarrollado un nuevo modelo experimental para la evaluación de los cambios histopatológicos de la hiperplasia de la íntima asociada al PDGF como un efector principal. Se evaluó la variante PDGF-BB, ya que es la más específica en el endotelio vascular⁹,²⁰.

Se ha demostrado que uno de los eventos que regulan las fases iniciales de la proliferación de células musculares lisas en la capa media, y su migración a la capa íntima es detonada por el PDGF, el cual se libera de plaquetas y células endoteliales²¹-²³.

Durante los últimos años se han desarrollado modelos animales para el estudio de la biología vascular. La hiperplasia intimal venosa se ha identificado como una de las principales causas de falla para reconstrucciones vasculares y fístulas arteriovenosas, por lo cual con estos modelos experimentales no solo se ha estudiado la fisiopatología vascular, sino que se han propuesto estrategias terapéuticas para disminuir estas complicaciones en cirugía vascular²⁴. Los modelos porcinos, unos de los más utilizados, tienen la ventaja de tener vasos de mayor calibre, accesibles y apegados a la anatomía de un ser humano, sin embargo, su manejo y costo hace que sea difícil su uso cotidiano²⁴,²⁵. Los modelos murinos han surgido como un excelente modelo para el estudio de la biología vascular, con el mayor potencial para obtener más información sobre los mecanismos moleculares subyacentes debido a la disponibilidad de tener ratones transgénicos. La principal limitación de este tipo de modelos es el tamaño de los vasos, debido a que se requiere una curva de aprendizaje en técnicas de microcirugía avanzada²⁶,²⁷. En rata se desarrolló un modelo de fístula aortocava para estudiar la patogénesis de la hipertrofia cardíaca y el efecto cardiovascular de la insuficiencia cardíaca congestiva. Se ha utilizado, también, para estudiar la fisiopatología de fístulas arteriovenosas²⁵,²⁸. Además de compartir limitaciones similares con los ratones, una desventaja de este modelo es que el desarrollo de lesiones estenóticas hemodinámicamente significativas en fístulas arteriovenosas es mucho más lento en ratas que en modelos murinos. Las ratas (sobre todo Wistar) también han demostrado ser un adecuado modelo para estudiar la fisiopatología en la falla de reconstrucciones vasculares²⁹,³⁰. Finalmente hay modelos experimentales que, aunque menos frecuentemente usados, también han demostrado su efectividad. Tal es el caso de perros, primates, ovejas y cabras³¹,³². Nosotros elegimos el modelo de conejo para estudiar las alteraciones histopatológicas y sistémicas de la influencia del PDGF en el endotelio venoso posterior a una lesión vascular por barotrauma. Se han descrito algunos experimentos en arterias de conejos, pero esta es la primera descripción de experimentos en venas, específicamente enfocados a hiperplasia intimal. Este modelo experimental demostró generar hiperplasia intimal en el endotelio venoso además de ser reproducible.

Por otro lado, la validez del estudio de alteraciones vasculares en animales ha sido un tema de debate poniendo sobre la mesa las similitudes con pacientes humanos, como por ejemplo estados de insuficiencia renal crónica terminal. Este escepticismo se relaciona principalmente con el uso de modelos animales relativamente sanos que podrían mostrar una respuesta diferente a alteraciones vasculares²⁴. Debido a este concepto hay grupos de investigadores que han creado modelos biológicos urémicos con la finalidad de poder replicar las fases más avanzadas de la enfermedad renal crónica terminal y su efecto en fístulas arteriovenosas y reconstrucciones vasculares³³.

Finalmente, se debe tener en cuenta que la generación de hiperplasia intimal tiene fases y mecanismos fisiopatológicos diferentes, cuyo estudio se debe realizar por separado y el modelo experimental debe ser reproducible en estos escenarios en específico¹,². Los cambios hemodinámicos presentes en una anastomosis arteriovenosa son muy complejos y existen diferencias significativas dependiendo del momento y mecanismo de acción de estos eventos fisiológicos y fisiopatológicos⁶.

El paso de sangre a través de un sistema vascular genera dos fuerzas hemodinámicas principalmente: fuerzas de cizallamiento (shear stress), que están directamente relacionadas con la velocidad de flujo, la viscosidad de la sangre y el diámetro del vaso sanguíneo, y las fuerzas de tensión radial, que dependen de la presión de la sangre sobre las dimensiones (diámetro y grosor) del vaso sanguíneo³⁴,³⁵. Para estudiar los cambios hemodinámicos en una anastomosis arteriovenosa es muy importante separar ambos mecanismos hemodinámicos debido a que son muy diferentes en cuanto a cronología, vías de señalización y fisiopatología. El presente trabajo evalúa las alteraciones más tempranas, enfocadas en el mecanismo fisiopatológico generado por fuerza tensional radial⁵,¹⁶,³⁶.

En estudios experimentales se ha demostrado que las fuerzas tensionales sobre el endotelio venoso en una anastomosis arteriovenosa se elevan más de 10 veces, comparado con el nivel basal. Estos cambios moleculares se pueden detectar de una forma tan temprana como 8 minutos después de la lesión vascular¹⁵,³⁷. Posterior a una angioplastia con balón en el endotelio venoso se crea una obvia lesión vascular. Esta lesión genera denudación de las células endoteliales. Inmediatamente después de la lesión se adhieren y se granulan plaquetas dentro del vaso afectado. Las células musculares lisas inician su proliferación en la capa media aproximadamente en las primeras 12 horas después de la lesión. Durante los 4 días siguientes, las células musculares lisas migran hacia la capa íntima, donde algunas de ellas continúan proliferando generando estenosis del lumen del vaso³⁶,³⁸,³⁹. Posteriormente existe deposición de matriz extracelular alrededor de la capa íntima, lo cual agrava la estenosis. Se ha demostrado que uno de los eventos que regula las fases iniciales de proliferación de células musculares lisas en la capa media y su migración a la capa íntima es detonado por el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el cual es liberado de plaquetas y células endoteliales⁴⁰,⁴¹. Después de una lesión vascular secundaria a fuerzas de tensión radial, la matriz extracelular se encuentra desorganizada, las células pierden contacto entre ellas y entran en apoptosis. Para compensar aquellas células que sobreviven a la lesión inicial, los factores de crecimiento facilitan el engrosamiento de la capa íntima. Las fuerzas de tensión radial en las etapas más tempranas activan receptores de tirosina cinasa, en donde el PDGF juega un papel fundamental⁹,²⁰,²¹,⁴²,⁴³., Estos conceptos se demostraron en nuestro modelo experimental.

Conclusiones

En este trabajo, proponemos un modelo experimental que simula los eventos desencadenantes de la hiperplasia de la íntima, centrado en el PDGF como el principal efector. El modelo experimental fue capaz de generar eventos que detonaron la expresión de PDGF evaluados por ELISA, e hiperplasia de la íntima analizado por histopatología. Por lo tanto, constituye un modelo adecuado para caracterizar vías moleculares centradas en el PDGF e hiperplasia intimal en el endotelio venoso. Es importante reconocer la expresión de mediadores durante la patogénesis de la hiperplasia intimal, los cuales incluso pueden ser potenciales blancos terapéuticos. En las fases iniciales del desarrollo de hiperplasia intimal se ha demostrado que los factores de crecimiento constituyen importantes reguladores de la migración y proliferación celular.

Declaración de ética en animales

El estudio realizado según la Normativa Oficial Mexicana 062-ZOO para el uso y cuidado de animales de laboratorio. Todos los animales fueron operados bajo anestesia general utilizando el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Facultad de Medicina de Harvard.

Responsabilidades éticas

Protección de personas y animales. Los autores declaran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del Comité de experimentación humana responsable y de acuerdo con la Asociación Médica Mundial y la Declaración de Helsinki.

Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.