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INTRODUCCIÓN
Xanthomonas fragariae es el agente causal de la enfermedad mancha angular de la hoja (MAH), de importancia económica en el cultivo de fresa (Fragaria × ananassa Duch). México es el tercer productor de fresa a nivel mundial; los principales estados productores son Baja California, Guanajuato, Jalisco, Estado de México y Michoacán (SIAP, 2015). El primer reporte de X. fragariae en México fue en Zamora, Michoacán, con incidencia del 80 % en plantas de fresa de la variedad Aromas (Fernández-Pavía et al., 2014).
X. fragariae fue considerado el único patógeno bacteriano en fresa; sin embargo, en 1993 se reportó una nueva enfermedad en el norte de Italia y Turquía denominada “tizón foliar bacteriano” (TFB) y el agente causal se identificó como Xanthomonas arboricola pv. fragariae (X. a. fragariae) (Janse et al., 2001; Ustun et al., 2007). Se ha citado que X. fragariae y X. a. fragariae pueden coexistir en el mismo tejido, ya que ambos patógenos se han aislado con tejido tanto de síntomas de MAH como de TFB (Scortichini y Rossi, 2003).
Actualmente, no existen reportes oficiales de la presencia de X. a. fragariae en el cultivo de fresa en México. Se analizaron en laboratorio muestras de tejido foliar de diferentes genotipos de fresa provenientes de Cd. Guzmán, Jalisco, México, con síntomas de manchas angulares acuosas en el área adaxial de las hojas y manchas necróticas en las nervaduras, de las cuales se aislaron colonias bacterianas con características morfológicas similares a las descritas para X. fragariae. Por lo anterior, en consideración de que actualmente no existe información de referencia sobre el perfil fenotípico y genético de cepas de X. fragariae aisladas de fresa en México, o si se encuentra presente X. a. fragariae en los síntomas antes descritos, el objetivo del presente estudio fue identificar mediante la caracterización fisiológica, bioquímica, morfológica, pruebas de patogenicidad y genético por PCR, las bacterias aisladas de este tejido y comparar los resultados con el perfil descrito para cepas tipo y de referencia de X. fragariae y X. a. fragariae.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se colectaron muestras de tejido foliar de cinco genotipos de fresa: Frag26.S, Frag29.M, Frag32.D, Frag35.O y Frag38.B, en Ciudad Guzmán, Jalisco, México con síntomas de manchas angulares acuosas, exudado en el margen de las nervaduras y manchas necróticas (Figura 1).
Figura 1 Síntomas foliares en genotipos de fresa. A) Manchas angulares acuosas en el área adaxial de las hojas, B) Manchas necróticas en nervaduras primarias y secundarias.
Aislamiento de bacterias y condiciones de cultivo
Hojas de cada genotipo con síntomas se desinfestaron con hipoclorito de sodio (NaClO) al 0.5 %. Porciones de tejido se colocaron en 5 mL de agua destilada estéril; de esta suspensión se sembraron 100 μL en los medios de cultivo B de King (BK), Agar Nutritivo (AN) y Wilbrink´s agar (WA), y se incubaron a 25 ± 1 ºC por 5 d.
Caracterización fisiológica, bioquímica y morfológica
Las cepas aisladas de fresa: X. fragariae-7 (Frag32.D) y X. fragariae-22 (Frag26.S) se caracterizaron fisiológica y bioquímicamente de acuerdo con los procedimientos descritos por Schaad et al. (2001) y sensibilidad in vitro a antibióticos (Klančnik et al., 2010). La descripción morfológica se realizó en la cepa X. fragariae-22 con un microscopio electrónico de barrido JSM-35C® (JEOL LTD, Tokio, Japón), en la unidad de microscopía electrónica del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo (CP-UME).
Caracterización genética por PCR
La amplificación del gen 16S rADN de las cepas X. fragariae-7 y X. fragariae-22 se realizó con el protocolo descrito por Weisburg et al. (1991) y las secuencias obtenidas se alinearon con las depositadas en el GenBank del Centro Nacional de Biotecnología de los Estados Unidos (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La amplificación del gen hrp de X. fragariae se realizó con los iniciadores XF9 y XF11 bajo las condiciones de PCR descritas por Roberts et al. (1996). Como control negativo se utilizaron las cepas X. vesicatoria y X. phaseoli, patógenas de tomate (Solanum lycopersicum L.) y frijol (Phaseolus vulgaris L.), respectivamente.
Pruebas de patogenicidad
Se utilizaron cinco plantas de fresa var. Jacona susceptible a MAH y se inocularon con la cepa X. fragariae-22 por el método descrito por Hildebrand et al. (2005).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización fisiológica, bioquímica, morfológica, genética y patogenicidad
De los diferentes genotipos de fresa se aislaron 12 colonias pequeñas, las cuales mostraron desarrollo lento a las 24 h y se tornaron amarillas a las 96 h de incubación. El aislamiento fue más eficiente en el medio Wilbrink´s agar (WA) que en B de King (BK) y Agar Nutritivo (AN). La caracterización de las cepas X. fragariae-7 y X. fragariae-22 las identificaró como X. fragariae con alto porcentaje de similitud con el perfil descrito para la cepa tipo PD885 de X. fragariae y diferente de la cepa de referencia PD2780 de X. a. fragariae (Cuadro 1).
Cuadro 1 Caracterización fisiológica y bioquímica de las cepas 7 y 22 aisladas de fresa.
| Prueba | Cepa 7 | Cepa 22 | X. fragariae (PD885)† | X. a. fragariae (PD2780)†† |
|---|---|---|---|---|
| Hipersensibilidad en tabaco | + | + | - | + |
| Pudrición blanda en tubérculo de papa | - | - | - | + |
| Hidrólisis de almidón | + | + | - | + |
| Hidrólisis de esculina | - | - | - | + |
| Tolerancia a NaCl en AN¶: | ||||
| + | + | + | nd | |
| - | - | - | + | |
| - | - | - | + | |
| Celobiosa | - | - | - | + |
| Arabinosa | - | - | - | + |
| Trehalosa | - | - | - | + |
| Sensibilidad a antibióticos en AN: | ||||
| Rifampicina¶¶ | + | + | nd | nd |
| Cloranfenicol¶¶ | + | + | nd | nd |
| Estreptomicina¶¶ | + | + | nd | nd |
| Ampicilina¶¶ | - | - | nd | nd |
| Ácido nalidíxicox | + | + | nd | nd |
+: reacción positiva; -: reacción negativa; nd: prueba no determinada; †Cepa tipo PD885 de X. fragariae (Janse et al., 2001); ††Cepa de referencia PD2780 de X. a. fragariae (Ustun et al., 2007). ¶Agar nutritivo; ¶¶Concentración 0.2 mg mL-1; xConcentración 0.03 mg mL-1.
Ambas cepas difieren de la cepa tipo PD885 de X. fragariae en la hidrólisis de almidón (Cuadro 1). La hidrólisis de almidón por X. fragariae aislada en México ha sido previamente documentada (Fernández-Pavía et al., 2014). Por otra parte, difieren de la cepa de referencia PD2780 de X. a. fragariae en la pudrición de tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.) (Cuadro 1). Estudios del genoma de X. a. fragariae mostraron que utilizan un sistema de secreción tipo II (SST2) para el transporte de proteasas y otras enzimas que degradan la pared de las células de la planta hospedante y que este SST2 es incipiente y no utilizado por poblaciones de X. fragariae.
Los resultados en este estudio son congruentes con lo citado por Vandroemme et al. (2013a, b), quienes caracterizaron a X. a. fragariae como cepas altamente pectinolíticas, a diferencia de X. fragariae. Se destaca que las cepas X. fragariae-7 y X. fragariae-22 fueron resistentes a la ampicilina (Cuadro 1); este resultado puede aportar información útil para el desarrollo de protocolos con medios de cultivo más selectivos y eficientes para el aislamiento de este patógeno de tejido de fresa; o bien, para otros estudios biotecnológicos. El estudio morfológico de la cepa X. fragariae-22 (Figura 2) reveló una topografía celular con la presencia de hebras de apariencia algodonosa (Figura 2B).
Figura 2 Morfología de las células de la cepa X. fragariae-22. A) Células bacilares en una colonia, B) Células bacilares con hebras algodonosas (flechas).
Estos resultados coinciden con lo reportado por Allan-Wojtas et al. (2010), quienes destacan en células de X. fragariae estructuras (hebras) que se originan por la producción abundante de polisacáridos extracelulares, principalmente xantana, asociados con los síntomas de manchas acuosas y necrosis.
La inoculación de las cinco plantas de fresa con la cepa X. fragariae-22 produjo lesiones angulares y necrosis del tejido adyacente a la nervadura central de las hojas 15 días después de la inoculación; no se observó el desarrollo de síntomas en las plantas testigo (Figura 3). Las colonias bacterianas aisladas a partir de este tejido en medio de cultivo WA mostraron una morfología idéntica a la cepa originalmente inoculada.
Figura 3 Síntomas en hojas de fresa var. Jacona. A) Testigo, B) Lesiones angulares y necrosis de tejido adyacente a la nervadura central.
Las 12 cepas aisladas amplificaron un fragmento del gen hrp de aproximadamente 537 pb. No se obtuvo amplificación con las cepas de X. vesicatoria y X. phaseoli, patógenas en otras plantas hospedantes (Figura 4). El alineamiento en el GenBank de las secuencias obtenidas de la amplificación del gen 16S rADN de la cepa X. fragariae-7 (No. acceso CP016833.1) y X. fragariae-22 (No. acceso HQ223085.1) tuvieron 98 y 100 % de identidad con X. fragaraie, respectivamente.
Figura 4 Amplificación del gen hrp de 12 cepas aisladas de diferentes genotipos de fresa. M: marcador molecular 100 pb; 1 a 12: 3 (Frag26.S), 6 (Frag26.S), 7 (Frag32.D), 8 (Frag35.O), 14 (Frag38.B), 22 (Frag26.S), 19 (Frag35.O), 21 (Frag32.D), 24 (Frag29.M), 27 (Frag35.O), 28 (Frag35.O), 29 (Frag26.S), 13 (X. vesicatoria), 14 (X. phaseoli), W (agua).
Las cepas X. fragariae-7 y X. fragariae-22 produjeron una respuesta de hipersensibilidad (RH) en tabaco (Nicotiana benthamiana L.) (Cuadro 1). Estudios genéticos con la cepa LMG 2586 de X. fragariae reveló que ésta alberga el grupo de genes hrp que codifican para un distintivo sistema de secreción tipo III, los cuales son esenciales en la virulencia y desarrollo de síntomas en Xanthomonas spp. fitopatógenas (Hajri et al., 2009; Vandroemme et al., 2013a). La expresión de los genes hrp se evidencia por una RH en poblaciones bacterianas fitopatógenas con una gama de hospedantes específicos y una característica distintiva de X. fragariae como patógeno, es su especificidad a Fragaria spp. la cual se reconoce como su único hospedante natural (Mirmajlessi et al., 2015; Vandroemme et al., 2013a).
En conclusión, las cepas bacterianas aisladas de diferentes genotipos de fresa se identificaron como X. fragariae. La amplificación del gen hrp puede ser de gran utilidad para una detección rápida, confiable y específica de este patógeno en México. La inoculación de la cepa X. fragariae-22 en plantas susceptibles de fresa confirmó la patogenicidad de los aislamientos.
