Obtención del néctar

Para elaborar el néctar se utilizó mango (Mangifera indica L.) de la variedad Ataúlfo en madurez de consumo. Los frutos se desinfectaron y escaldaron para inactivar las enzimas como la polifenoloxidasa, peroxidasa, poligalacturonasa y catalasa. La pulpa resultante se estandarizó con agua en la proporción establecida por el Codex Alimentarios (25 % v/v) y efectuando una Regularización de Azúcar (RA) a 13.5° Brix (Ec. 1).

El néctar obtenido se almacenó a -20 °C con el fin de garantizar la conservación del producto para su análisis.

Preparación del inoculo

Escherichia coli 0157:H7 ATCC 25922 resistente a rifampicina, aislada y estudiada previamente por ^{Castro-Rosas et al. (2012)} fue donada al Instituto Tecnológico de Tepic. La cepa se activó en agar soya tripcaseína adicionado con rifampicina a una concentración de 100 mg/L y se incubó durante 48 h a 35 °C. Se realizaron diluciones hasta obtener una concentración de 1x10⁶ CFU/ mL, usando la cámara de Neubauer.

Tratamiento de HHP

100 mL de néctar inoculado se envasaron (Bolsas para alto vacío FoodSaver® ROL28), se sellaron al alto vacío en una maquina selladora V3835 (FoodSaver®, USA) y fueron procesadas en la prensa isostática CIP 42260 (Quintus, Technologies, Ohio, USA) de acuerdo con ^{Ruíz-Montañez et al. (2014)}. Se empleó un diseño experimental 3³, presión (150, 200 y 250 MPa), temperatura (25, 35 y 45 °C) y tiempo de residencia (0, 10 y 20 min), el tiempo de 0 min se consideró como el tiempo necesario para que las muestras alcanzaran la presión indicada en el equipo de HHP (come up time, CUT=2.65 min). Después de los tratamientos las muestras se almacenaron a 4 °C durante 6 días para su análisis.

Inactivación de Escherichia coli 0157:H7

Para determinar la inactivación de E. coli se realizó el recuento de las células sobrevivientes después de aplicar los tratamientos por HHP. Se realizaron diluciones decimales en solución isotónica al 0.85 % de NaCl, subsecuentemente, la siembra de las diluciones se realizó en agar ATBS con 100 mg/L de rifampicina. Las placas se incubaron por triplicado a 35 °C de 24 a 48 h, para cada tratamiento. La inactivación fue calculada como la diferencia entre los logaritmos de los recuentos de las colonias de las muestras inoculadas y las muestras inoculadas tratadas (log N₀ - log N).

Identificación y cuantificación de los compuestos volátiles por SPME-CG-MS

La muestra se preparó colocando 10 mL de néctar de mango en un vial con capacidad de 20 mL, mismo que se selló con un septum, después se homogeneizó con 1g de NaCl (1:10) en un agitador magnético modelo C-MAG H57, incubado a una temperatura de 40 °C durante 30 min, logrando el primer equilibrio termodinámico entre el espacio de cabeza y la muestra. Después de este tiempo, se insertó la fibra de microextracción en fase sólida (SPME Fiber Assembly 65 mm PDMS/DVB, Fused Silica 24Ga, Manual Holder, 3pk, SUPELCO), exponiéndola en el espacio de cabeza dentro del vial durante 20 min. Experimentalmente en este tiempo se alcanza un segundo equilibrio termodinámico, en el cual los compuestos aromáticos adsorbidos en la fibra, son una muestra representativa de los contenidos en el espacio de cabeza. Finalmente, se extrajo la fibra de SPME e inmediatamente se insertó en el puerto de inyección, exponiendo la fibra durante 4 min para la desorción de los aromas (^{Solís-Solís et al., 2007}). La cuantificación de los compuestos aromáticos del néctar de mango, se realizó en un cromatógrafo de gases CP-3800 (VARIAN, USA), con inyección manual, equipado con un detector de ionización a la flama (FID), provisto de una columna capilar de sílica fundida WCOT, de 3000 x 0.25 mm, cubierta con CP-SIL 5CB (espesor 25 µm). Se utilizó nitrógeno como gas acarreador con un flujo de 1mL/min. Las condiciones de operación del cromatógrafo de gases, de acuerdo a ^{Solís-Solís et al. (2007)} fueron; temperatura del inyector 250 °C, temperatura inicial del horno 40 °C aumentando hasta 200 °C a una velocidad de 3 °C/min, posteriormente, se aumentó nuevamente hasta alcanzar 230 °C, con una velocidad de 5 °C/min.

La identificación de los compuestos aromáticos se realizó en un cromatógrafo de gases 7890A (Agilent Technologies, california, USA); acoplado a un espectro de masas 240 Ion Trap GC/MS (Agilent Technologies, california, USA), utilizando helio como gas portador a un flujo 1 mL/min y una columna RFX-SSil MS (3000 x 0.25mm DIx0.25µm Film), la línea de transferencia se mantuvo a 250 ºC, los espectros de masas se escanearon a 70 eV en el rango m/z de 60 - 600 unidades de masas. La inyección se realizó manualmente mediante la fibra SPME. Los compuestos volátiles se identificaron mediante la comparación de los índices de retención lineal y los datos del espectro de masas con datos de la literatura y con el banco de datos (NIST/49 K Mass Spectral Database, Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA EE.UU. y Registro de datos espectrales de masas con Structures, Wiley 6.1, NY, EE. UU.).

Caracterización fisicoquímica

Los sólidos solubles totales (SST) se midieron con un refractómetro digital NAR-T1 (ATAGO, USA) el cual previamente se calibró con agua destilada. El Potencial de hidrogeno (pH) se midió utilizando un pH-metro HI18653 (Hanna, Italia). Todas las mediciones se hicieron por triplicado.

Análisis sensorial

El análisis sensorial se realizó con 26 jueces no entrenados empleando una prueba de preferencia triangular (^{Pedrero & Pang, 1997}). Los datos fueron analizados usando un ANOVA y software SAS system versión 10.0 (p<0.05).

Análisis estadístico de resultados

El análisis de los datos se realizó mediante un ANOVA con un diseño de bloques aleatorizados utilizando el software estadístico SAS system versión 10.0 (p<0.05). La optimización del proceso se realizó con la técnica de superficie de respuesta con el software Statgraphics® plus 4.0.

Inactivación de Escherichia coli O157:H7 por HHP

Los valores de reducción logarítmica de E. coli en las muestras de néctar de mango presurizadas y almacenadas a 4 °C durante 6 días, demuestran que a mayor presión existe mayor letalidad de la bacteria (Tabla 1). A 250 MPa se obtiene una mayor reducción logarítmica con respecto a los tratamientos a 200 y 150 MPa (p<0.05). La HHP induce cambios en la célula, el principal daño se presenta sobre la membrana celular, estructura encargada de regular la entrada y salida de nutrientes, y constituida por lípidos que son particularmente sensibles a los efectos de la presión, pero más resistentes que las proteínas (^{Vázquez-Gutiérrez et al., 2011}). El aumento de la presión incrementa el orden de las cadenas de hidrocarburos, así como la temperatura de transición de fase de la membrana en estado gel al estado cristalino líquido (^{Bartlett, 2002}).

La Food and Drug Administration (FDA) ha propuesto una reducción de 5-log en los microorganismos patógenos (pasar a discusión). En este estudio, a 150 MPa y 45 °C se inactivó completamente E.coli (6 Log); mientras que el mismo grado de inhibición se logró a 200 MPa y 35 °C. El tratamiento de 250 MPa fue suficiente a 25 °C por 10 min para inactivar completamente E. coli. Con lo que se logra lo demandado por la FDA. El análisis estadístico para la reducción logarítmica, indica que el tiempo, temperatura y presión afectan significativamente el proceso de inhibición (p<0.05).

En el día del procesamiento (tiempo 0 de almacenamiento) el efecto de las presiones seleccionadas (150, 200 y 250 MPa) a temperatura ambiente presentaron diferentes niveles de inactivación. En el rango de 20 a 180 MPa, el crecimiento microbiano se retrasa y se inhibe la síntesis de proteínas. La pérdida de viabilidad de las células comienza a partir de presiones de aproximadamente 180 MPa, al incrementar esta presión, la velocidad de inactivación aumenta exponencialmente. Al aplicar presiones mayores, hay daño a la integridad de la membrana y se desnaturalizan las proteínas (^{Vázquez-Gutiérrez et al., 2011}). Cabe resaltar que los diferentes efectos que ejercen las HHP sobre los microorganismos dependen directamente de la etapa de desarrollo en la que éstos se encuentren, ya que las células en fase logarítmica presentan una mayor sensibilidad al tratamiento por HHP que aquellas en fase estacionaria. ^{Mañas & Mackay (2004}) observaron este comportamiento utilizando la cepa J1 de Escherichia coli en fase exponencial y estacionaria. Se observaron también diversas modificaciones celulares como agregación de proteínas citoplasmáticas y condensación de los nucleótidos, cuando las presiones eran iguales o mayores a 200 MPa. Esto puede deberse a que en la fase logarítmica los microorganismos se encuentran en división celular y por tanto, la membrana es más sensible a los factores externos (^{Ayvaza et al., 2012}).

La desnaturalización irreversible de las proteínas a presión superior a 300 MPa, corresponde al rango de presión necesaria para inactivar las células vegetativas (^{Tabilo-Munizaga et al., 2014}). En este estudio se aplicaron temperaturas de 35 y 45 ºC, consideradas aún temperaturas moderadas, para disminuir en mayor medida las posibilidades de supervivencia del microorganismo. Además, se ha reportado que la respuesta al estrés por presión a 53 MPa en el género Escherichia coli induce la síntesis de 55 proteínas, incluyendo 11 proteínas de choque térmico y 4 por choque frío como un mecanismo de defensa de la célula (^{Buzrul et al., 2008}). La presión es el único factor estresante que puede inducir simultáneamente la síntesis de proteínas de choque térmico y choque frío (^{Ambrosi et al., 2016}). Uno de los efectos de los tratamientos por HHP es la ruptura de los enlaces no covalentes (iónicos, hidrofóbicos, puentes de hidrógeno) de las proteínas; por lo tanto la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria pueden desplegarse y disociarse, mientras la estructura primaria se mantiene sin cambios (^{Dzwolak et al., 2002}). Según ^{Messens et al. (1997)} aplicando una presión menor a 150 MPa se observan cambios en la estructura cuaternaria, sin embargo, es necesario aplicar más de 200 MPa para modificar significativamente las estructuras secundaria y terciaria. La inducción de estas proteínas representa un intento por parte de E. coli para aminorar los efectos perjudiciales del incremento de la presión en la integridad de la membrana, los procesos de traducción, así como en la estabilidad de las macromoléculas (^{Bartlett, 2002}). Por esta razón, es importante que al aplicar presiones menores de 300 MPa se aplique temperatura, o bien se apliquen tiempos prolongados. El tratamiento combinado evita la posibilidad de tener células estresadas, que sinteticen proteínas de defensa y por lo tanto que el microorganismo pueda sobrevivir y recuperarse del daño subletal durante el almacenamiento.

Respecto al efecto del tiempo de residencia en el nivel de inactivación, se observa que la inhibición incrementa de 2.8 a 4.1 log CFU/mL cuando se incrementa el come up time, CUT=2.65 min a 20 min el tratamiento de 150 MPa a 25 °C. Algunos autores han sugerido que incrementar el tiempo de tratamiento para algunos casos, no genera una mejor respuesta tratándose del sistema de HHP (^{Raventós-Santamaría, 2005}). Sin embargo, una concentración elevada de solutos por encima del 30 %, puede inducir a una mayor resistencia del microorganismo a la presión, debido a las condiciones fisiológicas del organismo al reducirse la actividad del agua. Esta resistencia puede disminuir al aumentar la temperatura y el tiempo del tratamiento (^{Téllez-Luis et al., 2001}).

La presión no genera efectos importantes sino hasta que se aplican tratamientos combinados con temperatura y en el caso de 150 MPa con mayores tiempo de residencia (Tabla 1). ^{Rivalain et al. (2010)} reportan que la aplicación de temperatura (entre 45 y 70 °C) sinérgicamente mejora la eficacia de la presión. También se genera una sinergia al combinar el bajo pH con HHP. Cuando el microorganismo está presente en un medio mayormente ácido, como en el caso de las bacterias Gram negativas, al aplicar HHP se genera un efecto de “electroporación”, debido al apilamiento de los compuestos lipídicos de la membrana celular, es decir, espacios vacíos sobre la membrana celular, por lo que no es posible regular la entrada de sustancias, así como de iones hidrogeno presentes en el jugo, propiciando una acidificación citoplasmática e induciendo una posterior muerte celular (^{Alpas et al., 2008}; ^{Vázquez-Gutiérrez et al., 2011}).

El néctar que se usó en este estudio presentó un pH ácido de 3.3 ± 0.1. Previamente se ha reportado la influencia que tienen los componentes propios del alimento en el efecto de la presión sobre los microorganismos (^{Patterson, 2005}). ^{Seiji (2004)} lograron obtener reducciones de 2.5 log de Escherichia coli O157:H7 al someter jugo de manzana (pH 3.69) a 200 MPa por 20 min. En el presente estudio, a esas condiciones de presión y tiempo, a 25 ºC se logró una reducción superior (4.3 log CFU/mL) de E. coli (Tabla 1). Valorando la inactivación a los diferentes tiempos de retención es posible considerar que el pH del néctar de mango, la temperatura y la presión del tratamiento resulta en un efecto sinérgico causando una mayor inactivación, lo que indica que posiblemente un bajo pH aumenta la inactivación de las bacterias vegetativas por alta presión (^{Van Opstal et al., 2005}) y se ha reportado que este microorganismo puede sobrevivir en alimentos ácidos de hasta un pH de 3.7 (^{Garlant-Miller & Kaspar, 1994}) siendo este valor mayor al que presenta el néctar de mango. Cuando se combina presión, temperatura y pH ácido, se observa una mayor inhibición de bacterias. Al exponer al microorganismo a una condición de estrés como la presión, se inactivan los microorganismos menos baroresistentes, cabe mencionar que existen microorganismos barodúricos que pueden sobrevivir a presiones de incluso 200 MPa pero no pueden crecer, pero al aplicar un tratamiento combinado con temperatura hay una mayor reducción logarítmica ya que al sintetizar continuamente proteínas como respuesta de defensa para las tres condiciones de estrés resultaría complicado para la célula ya que habría una demanda de energía bajo la forma de ATP, la cual se sintetizaría de manera muy limitada debido a la desnaturalización por la presión de la enzima ATPasa ubicada en la membrana celular. Además hay que considerar que durante el proceso de presurización se genera un calentamiento adiabático en el producto procesado, incrementando la temperatura de 2 a 3 °C por cada 100 MPa (^{Hernández-García, 2007}), o de 3 a 9 °C por cada 100 MPa (^{Patterson, 2005}), dependiendo de la temperatura inicial. Varios sistemas enzimáticos de los microorganismos son inhibidos o inactivados por la presión. Este es el caso de varias deshidrogenasas en Escherichia coli (100 MPa), carboxipeptidasas de las levaduras (400 MPa) y la ATPasa localizada en la capa de los fosfolípidos, involucrada en el fenómeno del transporte activo a través de la membrana. La actividad de la ATPasa Na+/K+ de la membrana celular se reduce por la alta presión. Seguramente este efecto es debido a la bicapa asociada (^{Chong et al., 1985}). Cuando se aplica la presión, varios sitios dentro de la célula bacteriana pueden dañarse y por lo tanto la ATPasa de la membrana no puede realizar su función, debido a la desnaturalización directa o por la dislocación de la membrana. El ATP ya no se hidroliza, y por lo tanto, ya no está disponible para llevar a cabo el transporte activo de protones, el pH celular se acidifica y la célula finalmente muere.

Perfil aromático del néctar de mango tratado por alta presión hidrostática

En los 27 tratamientos que comprende este estudio, se detectaron en el néctar de mango (con un 98% de confiabilidad), etanol, α-pimeno, mirceno, 3-careno, mismos que han sido reportados como componentes del aroma impacto de la fruta (^{Beaulieu & Lea, 2003}; ^{Pandit et al., 2009}), así como el ácido nonanoico. En el análisis de los datos, para el perfil aromático (Tabla 2), se encontró que solo el incremento de temperatura presenta un efecto disminuyendo la concentración de algunos compuestos volátiles en el medio, tales como α-pimeno y etanol.

Es posible afirmar la no alteración del aroma en este alimento a diferentes niveles de presión, debido a que las altas presiones no afectan los enlaces covalentes que son típicos del aroma, pero los no covalentes como los puentes de hidrógeno típicos de la estructura terciaria de las proteínas sufren modificaciones importantes, esto es posible explicarlo ya que la distancia de un enlace covalente es muy pequeña 10 A°, la naturaleza química del enlace indica que hay una hibridación de la orbitas sp3 lo que conduce a una menor distancia presente entre C-C, C-H, C-O, S-S, entre otros y al aplicar presión, la distancia entre los elementos es menor, sin embargo debido a la compartición de electrones no les afecta dicha reducción de espacio, por lo que los compuestos aromáticos no son afectados a presiones menores a 1000 MPa (^{Sangronis et al., 1997}). El etanol se encontró en una concentración promedio de 30.92 ± 18.57 µg/L y sólo se ve afectado por la temperatura de tratamiento, existiendo una menor concentración cuando se aplican tratamientos a 35 y 45 °C, este compuesto ha sido reportado por ^{Lebrun et al. 2008}, en variedades Keitt y Kent, el cual es liberado durante el proceso de la maduración en la frutas. También α-Pimeno se ve afectado por las temperaturas (35 y 45 °C). Éste es un compuesto monoterpénico producto del metabolismo secundario de algunas frutas como el mango debido a la hidrólisis de azúcares. Esto ha sido reportado por ^{Salazar et al. (2007)} en la variedad de mango Ataulfo, en Kentt y Keitt (^{Lebrun et al., 2008}) y por ^{Pandit et al. (2009)} en 27 variedades de mango y en Tommy Atkins por ^{Moreno et al. (2010)}. El ácido nonanoico fue identificado en este estudio, compuesto que no se ve alterado por las condiciones de tratamiento. El β-mirceno y 3-careno, son monoterpenos sobre los que no mostró efecto la presión, tiempo o temperatura, el β-mirceno está presente en el fruto de mango en madurez fisiológica, ha sido reportado en diferentes variedades Ataulfo (^{Salazar et al., 2007}), Kent y Keitt en los estados de madurez fisiológica y de consumo (^{Lebrun et al., 2008}) y en 27 variedades de mango (^{Pandit et al., 2009}) y el 3- careno es producto de metabolismo segundario, producido por la hidrólisis de azúcares.

Efecto de HHP sobre los sólidos solubles totales y en el potencial de hidrogeno

El valor de los sólidos solubles totales (SST, °Brix) fue en promedio de 13.5 ± 0.22, valor estadísticamente igual al valor obtenidos en SSR para néctar de mango sin tratamiento, lo que indica que la presión, tiempo y temperatura no afectan la concentración de SST (Figura 1). Los principales azúcares existentes en el mango son mayoritariamente fructosa, sacarosa, glucosa, así como maltosa y xilosa (^{Tharanathan et al., 2006}), en estos azúcares predominan los enlaces covalentes, considerados enlaces estables en condiciones de presión menores a 1000 MPa. Este tipo de enlaces comparten uno o más pares de electrones en una órbita y son de alta energía (95 Kcal/mol), por lo que la aplicación de presión no libera la suficiente energía para romperlos. Se ha reportado que el jugo de uva sometido a HHP (500 MPa) no mostró cambios en el contenido de sólidos solubles totales (^{Zhao et al., 2013}); en melón, a una presión de 800 MPa se observó una ligera disminución de los SST (^{Wolbang et al., 2008}). El efecto en los sólidos solubles totales no resulta igual cuando se trata un jugo o un fruto entero, ya que los jugos son alimentos donde los compuestos químicos y nutrientes individualmente reciben y transmiten la presión en forma proporcional. ^{Butz et al. (2002)} reportaron que, al presurizar azúcares como fructosa, sacarosa, glucosa, éstos se mantienen sin cambios notables hasta los 21 días posteriores al tratamiento. El pH bajo en los jugos contribuye a tener un periodo de almacenamiento más largo. El pH promedio de las muestras tratadas por HHP fue de 3.2 ± 0.012, valor estadísticamente igual al pH del néctar de mango sin tratamiento (Figura 2). El análisis estadístico (R=0.902) indicó que no hay efecto de la presión, tiempo y temperatura (p<0.05) por lo que el valor de potencial de hidrogeno no se ve alterado. ^{Heremans (1995)} sostiene que hay una disminución del pH en 0.3 unidades por cada 100 MPa, pero durante el proceso de despresurización, el pH regresa a su nivel inicial.

Figura 1 Efecto de la alta presión hidrostática sobre el contenido de sólidos solubles totales en el néctar de mango a diferentes temperaturas (negro 25 °C, blanco 35 °C, gris 45 °C y T: testigo) 

Figura 2 Efecto del tratamiento de alta presión hidrostática sobre el potencial de Hidrogeno (pH) en el néctar de mango a diferentes temperaturas (gris 25 °C, blanco 35 °C, negro 45 °C y T: testigo). 

Optimización del proceso

Las condiciones óptimas para la inactivación de Escherichia coli O157:H7, para maximizar la conservación de cada uno de los compuestos aromáticos, realizándose de manera independiente, así como las condiciones para la conservación integral del néctar de mango, evaluada de manera global se presentan en la Tabla 2. La inhibición total de Escherichia coli O157:H7 es posible a partir de 250 MPa a 25 ºC durante 10 min, sin embargo el análisis de superficie de respuesta, en base a sus principios de cálculo, determinó como condiciones óptimas 250 MPa, 36.15 ºC y 14.08 min, es posible visualizar estas condiciones en la manta de superficie de respuesta (Figura 3), misma que muestra en color gris oscuro, la zona óptima para la inhibición de Escherichia coli O157:H7, bajo las condiciones empleadas en los diferentes tratamientos.

Figura 3 Superficie de respuesta para la obtención de las condiciones óptimas del tratamiento de altas presiones hidrostáticas sobre la inhibición de Escherichia coli O157:H7. 

Con respecto a los compuestos aromáticos evaluados, el efecto de la temperatura sobre el compuesto α-pimeno y etanol a temperaturas superiores a los 35 ºC, reportado por el análisis estadístico, se evidenció en el análisis de superficie de respuesta, el cual reporta como temperatura óptima para este compuesto 25 ºC, indicando que a niveles bajos de temperatura, se garantiza la conservación de estos compuestos. Al aplicar la metodología de múltiples respuestas en el análisis de superficie de respuesta considerando la concentración del 3-careno, etanol, β-mirceno, ácido nonanoico, α-pimeno y la reducción logarítmica de Escherichia coli O157:H7, se determinaron las condiciones óptimas del proceso (Tabla 2). Es importante señalar que estas condiciones coincidieron con las condiciones óptimas para la inhibición de Escherichia coli O157:H7, lo que garantiza la conservación de los compuestos aromáticos de interés del mango, así como la inocuidad del néctar.

Las condiciones óptimas se aplicaron a muestras de néctar de mango sin inóculo de Escherichia coli O157:H7 con la finalidad de evaluar sensorialmente las diferencias entre el néctar tratado con altas presiones y el néctar sin tratamiento. El análisis de varianza (p>0.05) permite afirmar que los jueces no detectaron cambios significativos en el sabor y olor del néctar de mango tratado con altas presiones hidrostáticas respecto al control sin tratamiento.