Construcción de los plásmidos recombinantes

Para analizar las interacciones proteicas se realizó la construcción de los plásmidos codificantes a las homeoproteínas y hTBP. La construcción de pCS2VC155-Ubx, pCS2VC155-UbxHD y pCS2VC155-AbdBHD se realizó mediante subclonación a partir de los vectores pCS2VNm9-Ubx, pCS2VNm9-UbxHD, pCS2VNm9-AbdBHD, utilizando las enzimas de restricción AgeI y XbaI (Thermo Scientific, Estados Unidos). Estos vectores, junto con los ya construidos pCAG-mCherry, pCS2VNm9-hTBP, pCS2VNm9-hTBPDQ40, pCS2VC155-Antp, pCS2VC155-AbdB, pCS2VC155-Scr, pCS2VC155-AntpHD, pCS2VC155-AbdBHD y pCS2VC155-ScrHD, se propagaron en bacterias Escherichia coli TOP10 calcio competentes y se realizó la extracción de ADN plasmídico mediante la técnica de lisis alcalina.¹⁸

Análisis de las interacciones proteicas mediante BiFC

Las interacciones proteicas de hTBP con las homeoproteínas se analizaron mediante técnica de complementación bimolecular fluorescente (BiFC) en células de epitelio renal humano HEK293.¹⁹ Las células se cultivaron en medio DMEM pH 7.3 (Sigma, Saint Louis, Missouri, Estados Unidos) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB) y 1 % de penicilina-estreptomicina en una atmósfera de 95 % de humedad y 5 % de CO₂ a 37 °C. Las células HEK293 se sembraron durante 72 horas antes de realizar la transfección en placas de cultivo de seis pozos (Corning Life Sciences, Lowell, Massachusetts, Estados Unidos) a una densidad de 1.6 × 10⁵ células/pozo.

Se realizaron co-transfecciones de los plásmidos pCS2VNm9-hTBP o pCS2VNm9-hTBPΔQ40 en distintas combinaciones con pCS2VC155-Antp, pCS2VC155-Scr, pCS2VC155-Ubx, pCS2VC155-AbdB, o sus versiones que expresan solo el HD: pCS2VC155-UbxHD pCS2VC155-AntpHD, pCS2VC155-AbdBHD y pCS2VC155-ScrHD, junto con el plásmido pCAG-mCherry como control de eficiencia de transfección. La transfección se llevó a cabo agregando 2 μg de cada plásmido (VN-, VC- y Cherry) por pozo y 1 μL de polietilenimina a 15 mM por cada μg de ADN. Después de 48 horas de incubación, se observó la señal fluorescente en un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axio Imager 2 (Carl Zeiss, Alemania) con un objetivo 20×. Se tomaron fotografías de tres campos en los canales de Venus (BiFC) y de Cherry (control) utilizando tiempos de exposición de 100 y 30 ms, respectivamente. Las imágenes de las células transfectadas con la reconstitución de Venus fluorescente se analizaron con el programa ImageJ. El porcentaje de interacción se obtuvo con el siguiente cálculo:

Venus/Cherry × 100

Estos ensayos se realizaron tres veces por triplicado y se llevó a cabo un análisis de varianza de un factor (ANOVA), así como una comparación múltiple de medias de Tukey con ayuda del programa GraphPad Prism 5.0.

Mantenimiento y generación de cruzas genéticas de Drosophila melanogaster

Para la generación de líneas de moscas que expresaran hTBP con la region PolyQ normal y expandida, se utilizaron los plásmidos pUASTattB-hTBP34Q y pUASTattB-hTBP80Q, respectivamente, donados amablemente por el doctor Jun-Ma.²⁰ La integridad de estos plásmidos se confirmó mediante secuenciación por parte de la compañía Macrogen (Estados Unidos); la microinyección para la generación de las moscas transgénicas se realizó en la compañía Best Gene Inc. (Chino Hills, California, Estados Unidos). Las líneas de Drosophila melanogaster utilizadas se mantuvieron a 20 °C en tubos con comida estándar (agar, harina de maíz, azúcar, levadura y propionato de sodio) suplementada con levadura activa seca. Para dirigir de forma tejido-específica la expresión de las proteínas de interés, se utilizó el sistema binario UAS-GAL4.²¹ Para ello se realizaron cruzas genéticas de las moscas transgénicas con la línea productora ELAV-GAL4 que dirige la expresión de hTBP en células progenitoras neurales y gliales del cerebro de Drosophila.²²

Detección de hTBP mediante inmunofluorescencia en el cerebro de Drosophila

Los cerebros de las moscas adultas de cada grupo de edad (dos, 10, 20 y 50 días) que expresaban hTBP34Q o hTBP80Q se disecaron en paraformaldehído a 4 % diluido en PBS 1X con Tritón pH 7 a 0.1 %; posteriormente se fijaron en paraformaldehído a 4 % (peso/volumen) en PBS 1X a temperatura ambiente durante 60 minutos de acuerdo con Tito et al.²³ Los cerebros fijados se bloquearon durante tres horas en PBT 1X con 5 % de suero de caballo, 5 % de suero de cabra y 5 % de suero fetal bovino, después se añadió el anticuerpo primario anti-TATA binding protein (Abcam, ab818) (1:200) y se incubaron toda la noche a 4 °C. Al término de la incubación, los cerebros se lavaron cinco veces en PBT 1X, se les agregó el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón acoplado a Alexa Fluor 488 (1:1000) y se incubaron toda la noche a 4 °C. Posteriormente, se retiró el sobrenadante y los cerebros se incubaron con DAPI 1:10000 en PBS 1X; finalmente, se montaron en Vectashield (Vector Laboratories).

Las micrografías de las inmunofluroescencias fueron obtenidas a través de microscopia confocal láser con un microscopio Olympus BX61W1 con un módulo FV1000. Se procesaron seis cerebros por grupo de edad para cada variante de hTBP expresada y se analizaron en tres experimentos independientes. Las imágenes obtenidas fueron analizadas en el programa ImageJ y los resultados se analizaron con ANOVA de dos vías seguido por correcciones de Bonferroni en el programa GraphPad Prism.

Prueba de escalada en Drosophila

Se utilizaron 20 moscas para cada versión de hTBP (hTBP34Q y hTBP80Q) y de cada grupo de edad (dos, 10, 20 y 50 días). Estas moscas se monitorearon durante 55 días y la prueba de escalada se realizó cada dos días. La prueba se llevó a cabo en tubos de vidrio conforme el método descrito por Barone y Bohmann.²⁴ Se tomó nota del total de moscas que pasaron los 3 cm en cinco segundos o menos y las diez repeticiones se promediaron para después comparar los grupos con análisis de ANOVA de dos vías seguido de correcciones de Bonferroni.

Interacción de hTBP con Scr, Ubx y AbdB a través de las regiones PolyQ

El análisis de interacción realizado mediante BiFC en la línea celular HEK293 indica que hTBP interacciona con las homeoproteínas Scr, Ubx, y AbdB mostrando la señal fluorescente de Venus en el núcleo de la célula, ya que al ser factores de transcripción se ubican en el núcleo celular. Scr y Ubx presentaron un porcentaje de interacción con hTBP de 72 y 70 %, respectivamente (Figura 1), de forma muy similar al porcentaje de la interacción entre hTBP-Antp que se utilizó como control positivo.⁹ Por otra parte, la interacción con AbdB presentó 95 % de interacción con hTBP, lo que indica una mayor afinidad en la interacción. También se evaluó la implicación de la región PolyQ de hTBP al probar el efecto de la deleción de esta región de glutaminas en hTBPΔ40 para su interacción con las homeoproteínas. Los resultados muestran una reducción significativa en el porcentaje de interacción de hasta 25 % para Scr, 34 % para Ubx y 49 % para AbdB. Estos resultados fueron similares al decremento obtenido con la deleción de PolyQ en hTBP para su interacción con Antp, que disminuyó de 78 % a 41 %.

Figura 1 hTBP interacciona con homeoproteínas a través de su región rica en glutaminas. Para el análisis de interacción mediante BiFC se realizó la coexpresión de las proteínas hTBP y las homeoproteínas Scr/Ubx/AbdB o sus versiones mutantes (diagrama izquierdo). La reconstitución de la fluorescencia verde de Venus en las células transfectadas de la imagen derecha es indicativa de las interacciones proteína-proteína. El recuadro superior derecho indica la interacción en una sola célula. La expresión de la proteína fluorescente Cherry se empleó como control interno de transfección y la interacción con Antp se utilizó como control positivo (78 %). En todos los casos se muestra el porcentaje de interacción en la esquina inferior derecha de la imagen. Barra de escala de 50 μm. 

Debido a que la región N-terminal de algunas homeoproteínas contiene regiones PolyQ y otros dominios funcionales relacionados con la regulación de la transcripción, probamos la interacción de hTBP con mutantes que solo contienen la región C-terminal con el HD de la homeoproteína. Los resultados mostraron una disminución en el porcentaje de interacción: 44 % en Scr, 50 % en Ubx y 61 % en AbdB (Figura 1). Cuando se probó hTBPΔ40 con las versiones mutadas de las homeoproteínas, se presentó un porcentaje aún más bajo de interacción, de hasta 14 % en Scr, 15 % en Ubx y 35 % en AbdB, lo que evidenció el efecto combinado de la deleción de las regiones PolyQ, tanto de hTBP como de las homeoproteínas en las interacciones.

Modelaje de SCA17 y formación de agregados en el cerebro

Para modelar SCA17, se dirigió la expresión de dos versiones de hTBP en células progenitoras neurales y células gliales embrionarias del cerebro de la mosca. La inmunodetección mostró que a los dos días de edad no se formaron agregados de hTBP en el cerebro de moscas que expresaron hTBP34Q (Figura 2A), mientras que las que expresaron hTBP80Q mostraron pequeños agregados (Figura 2B). De la misma forma, a los 10 días de edad, los cerebros con hTBP34Q expusieron una expresión homogénea sin agregados (Figura 2C), mientras que los cerebros con la expansión de glutaminas 80Q (hTBP80Q) mostraron agregados de forma focalizada en regiones cerebrales como el centro motor y antenal mecanosensorial, el neuropilo ventrolateral "wedge", el neuropilo ventromedial "vest", protocerebro ventrolateral anterior, ganglio gnatal adulto y comenzaron a aparecer en médula y lóbulo (Figura 2D’). A los 20 días, hTBP34Q presentó una distribución uniforme de fluorescencia ligera (Figura 2E’), mientras que hTBP80Q se encontró en agregados más grandes e intensos (Figura 2F’). A los 50 días, los cerebros que expresaron hTBP34Q presentaron pequeños agregados, principalmente en el ganglio gnatal adulto (Figura 2G’), mientras que los agregados en el cerebro de moscas que expresaron hTBP80Q no mostraron cambio en el tamaño ni en la intensidad comparados con los de moscas de 20 días de edad (Figura 2H’).

Figura 2 Los agregados de hTBP34Q y 80Q se incrementan con la edad de los cerebros de Drosophila melanogaster. La inmunodetección de hTBP mediante fluorescencia permitió visualizar los agregados de hTBP en diferentes tiempos (dos, 10, 20 y 50 días). A-H: cerebros marcados con DAPI. A’-H’: inmunofluorescencia para hTBP34Q y hTBP80Q. A’’-H’’: traslape de las marcaciones de DAPI, hTBP34Q y hTBP80Q. Las flechas blancas indican algunos de los agregados presentes en los cerebros. Los agregados hTBP80Q incrementan en concordancia con la edad de la mosca hasta el día 20, después, al día 50, no se observan cambios. 

Efecto de la expresión de hTBP80Q en la habilidad de escalada de la mosca

El efecto de la expresión de hTBP34Q y hTBP80Q en la función locomotora de Drosophila no es evidente en los primeros 15 días de vida, pues todos los grupos experimentales se comportaron de forma normal. A partir de los días 16, 17 o 18 se presentó un declive en la habilidad de escalar en las moscas que expresaron hTBP80Q, en comparación con las moscas que expresaron hTBP34Q. Al día 37, solo 70 % de las moscas que expresaron hTBP80Q lograron pasar la línea de 3 cm en menos de cinco segundos en comparación con los otros grupos experimentales, en los cuales más de 95 % logró pasar la marca en el mismo lapso de tiempo. En el día 55, se observó un declive casi total en la habilidad de escalada de la línea que expresaba hTBP80Q, donde menos de 10 % pudo superar la prueba, mientras que cerca de 40 % de las moscas que expresaron hTBP34Q y aproximadamente 70 % de las moscas de los grupos control aún lograban escalar (Figura 3). Estos resultados indican que las moscas presentan un impedimento locomotor tardío cuando expresan hTBP80Q, de manera similar a lo que ocurre en humanos con la patología neurodegenerativa SCA17.

Figura 3 La expresión de hTBP80Q en el cerebro de Drosophila melanogaster afecta su habilidad de escalada. Grupos de 20 moscas de los genotipos hTBP 34 y 80Q se sometieron a los ensayos de escalada en comparación con moscas de las líneas ELAV-GAL4 y Oregon (silvestre). La prueba de escalada se realizó cada dos días durante 55 días. Las diferencias significativas entre las moscas que expresaron hTBP80Q y hTBP34Q están marcadas con asteriscos, en donde p < 0.0001 (ANOVA de dos vías con correcciones de Bonferroni). Se realizaron 10 repeticiones por cada grupo.