Artículos científicos

 

Efecto Inhibidor del Extracto Acuoso de las Teliosporas Telióides del Hongo Puccinia pampeana Speg., sobre Agentes Causales de Royas

 

Inhibiting effect of the aqueous extract from telioid teliospores of the fungus Puccinia pampeana Speg., on causal agents of rusts

 

Martha Maria Passador¹, Mário Barreto Figueiredo(+)², y Edson Luiz Furtado¹

 

¹ UNESP, Departamento de Produção Vegetal, Setor de Defesa Fitossanitária da Faculdade de Ciências Agronômicas (DPV–SDFFCA), Botucatu–SP, Brasil CP 18610–307. Correspondencia: marthamaria_p@yahoo.com.br

² Instituto Biológico de São Paulo, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Laboratório de Micologia Fitopatológica, SP, Brasil CP 04014–002.

  

Recibido: Mayo 20, 2008
Aceptado: Junio 24, 2008

 

Resumen

La roya de ají y del pimentón es provocada por el hongo Puccinia pampeana. Este hongo presenta dos clases teliales distintas, por eso es clasificada como una roya biteliomórfica. La primera ocurre en el inicio de los síntomas, puede producir las teliosporas aecidióides, en cadenas de color amarillo–oro y envueltos por el peridio. La segunda ocurre al final del ciclo vital del hongo en el hospedante, con las teliosporas telióides pulvinadas, bicelulares, pediceladas de color marrón oscuro. Estas teliosporas bicelulares contienen en sus paredes sustancias auto–inhibidoras de la germinación que se pueden remover con lavados de estas esporas. Extractos acuosos de las esporas fueron hechos con 20 mg de teliosporas telióides de Puccinia pampeana, evaluándose la inhibición producida en la germinación de las teliosporas aecidióides de la misma roya, en urediniosporas de Coleosporium plumierae y Hemileia vastratrix. Ese efecto inhibidor fue demostrado a lo largo de los metabasidios (teliosporas aecidióides de P. pampeana) y de los tubos germinales del C. plumierae y H. vastratrix. El efecto inhibidor fue comprobado después de 4 y 6 h del contacto de las esporas con los extractos.

Palabras claves: Auto–inhibidor, germinación, metabasidio, tubo germinal.

 

Abstract

Green pepper rust is caused by the fungus Puccinia pampeana. Since this fungus has two distinct telial forms, it is classified as a biteliomorphic rust. The first form occurs at the beginning of symptom appearance, with aecidioid, golden–yellow, catenulate teliospores surrounded by a peridium. The second one occurs at the end of the fungus cycle in the host, with dark brown, pulvinate, bicellular, pedicellate telioid teliospores, which contain germination self–inhibiting substances in their walls, that can be removed by washing. Aqueous extracts were prepared with 20 mg of Puccinia pampeana telioid teliospores, and tested on germination inhibition of aecidioid teliospores of the same rust and of urediniospores of Coleosporium plumierae and Hemileia vastratrix. The inhibiting effect was demonstrated by measuring metabasidial length (aecidioid teliospores of P. pampeana) and germ tube length of C. plumierae and H. vastratrix. The inhibiting effect was verified after 4 and 6 h of contact of spores with the extracts.

Keywords: Self–inhibitor, germination, metabasidium, germinative tube.

 

La roya (Puccinia pampeana Speg.) del ají (Capsicum baccatum L.) y del pimentón (Capsicum annuum L.) es conocida como una roya biteliomórfica (López–Franco et al., 1990), pues presenta dos clases sexuales (teleomorfos) provenientes del mismo micelio, siendo uno aecidióide (en cadena y polvoriento) del tipo Endophyllum, y otro telióide (pulvinado) del tipo Puccinia (Hennen et al., 1987; Lindquist, 1963). Esa característica hace que sea un importante patógeno para estudios de posibles variaciones de los ciclos vitales de las royas (Martins et al., 1995). En las teliosporas telióides, por medio de estudios en laboratorio, se comprobó la existencia de sustancias auto–inhibidoras de la germinación. Eso permite que las esporas permanezcan en estado latente durante los períodos desfavorables a la infección, pues impiden la germinación rápida de todas las esporas al mismo tiempo, y también posibilitan la supervivencia del patógeno en la ausencia del hospedante. Tales sustancias son hidrosolubles y son removidas durante el período de las lluvias al final del verano, posibilitando la infección de nuevos hospedantes (Figueiredo y Carvalho Jr., 1994a, 1995). Los auto inhibidores de las esporas de las royas son factores importantes que previenen la germinación prematura y contribuyen a una dispersión eficiente de las esporas (Wolf, 1982). Figueiredo y Carvalho Jr. (1994a), y Figueiredo y Coutinho (1994) comprobaron en laboratorio, la relación entre el lavado de los soros y la germinación de las teliosporas de las royas, determinando que el lavado promueve una lenta solubilización de los auto–inhibidores, lo cual provoca que las esporas germinen normalmente. Algunos extractos acuosos que utilizan otras estructuras fúngicas han sido estudiados para algunas enfermedades de las plantas. Piero (2003) utilizó extractos obtenidos a partir del polvo seco de basidiocarpos del hongo Lentinula edodes (Berk.) Pegler y Agaricus blazer Murill, comprobando que presentaron compuestos que activan las respuestas de defensa en plantas y pueden auxiliar en el control de enfermedades vegetales, dependiendo de la naturaleza del agente causal, como por ejemplo, la antracnosis en el pepino (Cucumis sativus L.). Tonucci y Pascholati (2004), verificaron y comprobaron en experimentos in vitro la acción inhibitoria de los extractos preparados con L. edodes sobre el crecimiento del Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Pereira) Gonçalves y Rosato y Colletotrichum sublineolum Henn. Aún con extractos de L. edodes y A. blazei, Silva et al. (2006), demostraron el potencial de éstos en el control de la marchitez bacteriana causada por Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi, Kosako, Yano, Hotta y Nishiuchi. Diversos trabajos mostraron el potencial del Saccharomyces cerevisiae Meyen en el control de enfermedades de las plantas. La acción protectora de la levadura formulada con la levadura Fleischmann^® fue constatada por Piccinin et al. (2005) , en sorgo (Sorghum spp. L.) contra la antracnosis causada por C. sublineolum y la mancha de las hojas, provocada por Exserohilum turcicum (Pass.) K.J. Leonard y E.G. Suggs. En experimento conducido en campo, por medio de aplicaciones semanales de S. cerevisiae, hubo reducción significativa de la antracnosis en sorgo, y también una única aplicación con la levadura fue suficiente para reducir el progreso de la mancha de las hojas. Esta levadura presenta un buen desempeño en campo para el control de enfermedades foliares en sorgo. Utilizando extractos de S. cerevisae, Bonaldo y Pascholati (2007), obtuvieron inhibición de la formación de apresorios en Colletotrichum lagenarium (Pass.) Ellis y Halst. y C. sublineolum. De acuerdo con Martins et al. (1986), la aplicación del filtrado del cultivo de S. cerevisiae en hojas de café (Coffea arabica L.), 72 h antes de la inoculación con Hemileia vastratrix Berk. y Broome, agente causal de la roya del cafeto, indujo resistencia al patógeno, sin afectar la germinación y formación de apresorios de las urediniosporas del hongo. La presente investigación que se realizó durante el año 2006, tuvo como objetivo experimentar y evaluar la acción de los extractos acuosos de esporas (EAE) preparados a partir de teliosporas telióides, en la geminación de las teliosporas aecidióides de Puccinia pampeana, y también, sobre urediniosporas de Coleosporium plumierae Pat., agente causal de la roya de frangipani (Plumeria rubra L.), y de Hemileia vastratrix.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de las teliosporas telióides de Puccinia pampeana. Las teliosporas telióides, tipo Puccinia, fueron obtenidas a partir de plantas de ají escabeche (Capsicum baccatum L.), previamente inoculadas con aislados de P. pampeana, colectada de ají panca (C. chinense Jacq.), proveniente de Botucatu–SP (FCA–UNESP, Campus de la Hacienda Lageado – Brazil). Las plantas de ají inoculadas con la roya, fueron plantadas en macetas de 10 cm de diámetro y 10 cm de altura, permaneciendo en invernadero, luego se transfirieron a una cámara con temperatura controlada (18–20°C) y fotoperíodo de 14 h con luz, donde se realizó la inoculación. Después de aproximadamente 65 días de la inoculación, cuando la enfermedad termina su ciclo, las teliosporas fueron colectadas bajo microscopio estereoscópico con ayuda de una aguja histológica, e inmediatamente fueron acondicionadas en criotubos con capacidad para 1.5 mL, y éstos se almacenaron a 9°C hasta su utilización.

Preparación de los extractos. La preparación de los extractos se realizó de acuerdo a Figueiredo y Carvalho Jr. (1995), con algunas modificaciones. Muestras de 20 mg de teliosporas telióides se colocaron en tubos de PVC con capacidad para 12 mL, luego se les adicionaron 1.5 mL de agua destilada estéril conteniendo tween a 0.01%. Los tubos se cerraron y las teliosporas permanecieron a 9°C por 24 h; luego fueron centrifugados durante 10 min a 3,500 rpm, en una centrífuga Tominaga de mesa, modelo TD65, que posee un rotor con aproximadamente 19.8 cm de diámetro. Después, el líquido sobrenadante se recogió en criotubos los cuales se almacenaron en un congelador a –5°C hasta su utilización. El proceso se repitió durante 4 días, reutilizando los residuos de las teliosporas del lavado anterior, constituyendo de esta manera 4 muestras de extracto acuoso de esporas denominadas EAE₁, EAE₂, EAE₃, EAE₄. En cada repetición el producto final fue diluido. Para evaluar el efecto de los extractos acuosos en la germinación de las esporas de royas, se midió de longitud de los tubos germinales de las urediniosporas, y de los metabasidios para las teliosporas aecidióides.

Patógenos utilizados en estudios con extracto acuoso de esporas (EAE). Se utilizaron teliosporas aecidióides (tipo Endophylum) de Puccinia pampeana [= Endophyllum pampeanum (Speg.) Lindq.], colectadas de plantas de ají de la variedad ají escabeche, anteriormente inoculadas con un aislado de P. pampeana, colectado de ají panca (C. chinense) proveniente de Botucatu–SP, Brasil, como se mencionó anteriormente. También se utilizaron urediniosporas de Coleosporium plumierae, agente causal de la roya de la frangipani (Plumeria spp.) y de Hemileia vastratrix, agente causal de la roya del cafeto, colectadas de plantas naturalmente infectadas existentes en la área del Instituto Biológico de São Paulo– SP, Brazil. Los experimentos se realizaron en láminas excavadas con una a tres cavidades. Para cada muestra de espora y tratamiento (EAE) se hicieron 4 repeticiones en un diseño completamente al azar y la comparación de media se hizo mediante la prueba de Tukey (0.05). El análisis de varianza se hizo mediante el programa Estat (Sistema para Análises Estatítisticas, v. 2.0; Universidad Estadual Paulista, Câmpus de Jaboticabal). Los metabasidios de P. pampeana y los tubos germinales de C. plumierae y H. vastratrix fueron medidos en microscopio óptico con ocular de medida, utilizando 20 esporas elegidas al azar. Las lecturas se realizaron después de 4 a 6 h (Figueiredo y Carvalho Jr., 1995) para cada estructura de roya y de extracto. Las teliosporas aecidióides de P. pampeana y las urediniosporas de H. vastratrix se colectaron con una aguja histológica, y enseguida se preparó la suspensión de esporas. Para C. plumierae, de acuerdo con la técnica de Figueiredo y Carvalho Jr. (1994b), las hojas de frangipani infectadas con roya se colectaron y se rasparon con un pincel de pelos ásperos, bajo agua corriente. Enseguida se colocaron en cajón plástico con tapón, midiendo 35 x 30 cm y 12 cm de altura, forradas con espuma de nylon humedecida. Después de 24 h, se colectaron las urediniosporas que se desarrollaron, para la preparación de suspensión. Este procedimiento se realizó porque estudios previos han demostrado que urediniosporas recién producidas tienen la capacidad de germinación de 80 a 90%, mientras que las más viejas presentan un 45%. Para las tres royas utilizadas en los experimentos, la suspensión se preparó en agua destilada a una concentración de 10⁴ esporas por mL^–1 y tween a 0.01%. Luego se distribuyeron 50 nL de la suspensión en las cavidades de las láminas, y en seguida se añadieron 50 μL del extracto acuoso en proporción 1:1. El tratamiento testigo se constituyó de 100 μL de la suspensión de esporas. Las láminas excavadas se colocaron en cristalizadores de 20 cm de diámetro y 4 cm de altura, forrados con espuma de nylon humedecida para evitar deshidratación, manteniéndolas en la oscuridad y en cámara de temperatura controlada a 12°C para P. pampeana, a 21°C para C. plumiearae, y a 24°C para H. vastratrix.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Estudios acerca de la influencia de los extractos acuosos de esporas (EAE) en la germinación de esporas de royas. Después de la preparación, los extractos presentaron color amarillo paja, cambiando a más claro a medida que fueron hechas las diluciones (EAE₁ para EAE₄). Para los experimentos con teliosporas aecidióides de P. pampeana, las lecturas para EAE₁ (extracto acuoso de esporas), después de 4 h como después de 6 h, no hubo germinación. Esas teliosporas no tienen estado latente y germinan bajo condiciones apropiadas (Figueiredo y Carvalho Jr., 1995). Con los extractos acuosos diluidos EAE₂, EAE₃ y EAE₄ los metabasidios pudieron ser medidos, y hubo aumento de longitud correspondiente con la dilución del extracto, tanto en los EAE como después de 4 y 6 h. Para el testigo, fue notada germinación completa, y los metabasidios presentaron mayor longitud que los otros tratamientos. Como se sabe, esos extractos no provocan la muerte de las esporas, pero solamente retrasan la germinación (Figueiredo y Carvalho Jr., 1995). En los experimentos realizados con urediniosporas de C. plumierae, también hubo correlación entre la germinación y los tratamientos con EAE. El testigo presentó mayor longitud del tubo germinativo. Las urediniosporas recién producidas de esta roya se colocan en agua destilada a temperaturas entre 18 a 21°C, presentan una germinación de alrededor del 90%, después de 4 h, produciendo 1 a 2 tubos germinativos (Figueiredo y Carvalho Jr., 1994b). Esporas de un gran número de agentes causales de royas contienen auto–inhibidores de la germinación (Figueiredo y Carvalho Jr., 1994a). Eso evita la germinación de todas las esporas al mismo tiempo, siempre que estén en presencia de agua y temperatura adecuada. Este mecanismo impide la extinción del patógeno, pues no germinan sin su hospedante. Así el porcentaje de germinación de una población puede presentar variaciones entre 30 a 40%. En los trabajos con urediniosporas de H. vastratrix, los porcentajes de germinación se quedaron entre 30 a 40%, aún cuando se utilizaron urediniosporas de hojas recién colectadas, y naturalmente infectadas. En estas pruebas también hubo correlación entre la germinación y los tratamientos con EAE. Las urediniosporas de esta roya son capaces de germinar dentro de 6 h a temperaturas entre 23 a 24°C, en presencia de agua, bajo condiciones de oscuridad y elevada humedad (Godoy et al, 1997; Guzzo, 2004; Zambolim, 1973). La presencia de sustancias inhibidoras de la germinación en las urediniosporas de H. vastratrix fue estudiada por Musumeci et al. (1974), por medio del lavado en agua destilada. Los autores también observaron que en suspensiones con el mismo volumen de agua, pero con cantidades crecientes de urediniosporas, el porcentaje de germinación disminuye. Ayliffe et al. (1997) constataron la presencia de sustancias auto–inhibidoras de la germinación en urediniosporas de Melampsora lini (Ehrenb.) Desmaz. Este efecto se observó también en urediniosporas de otras royas (Allen, 1955; Bell y Daly, 1962; Staples y Macko, 1984), lográndose aislar algunas sustancias activas para la identificación de la naturaleza química de algunos inhibidores; por ejemplo, la roya del frijol [Uromyces phaseoli (Pers.) Wint.], la roya del maíz (Puccinia polysora Underw.), la roya del maní (Puccinia arachidis Speg.), la roya de la boca de león o boca del dragón (Puccinia antirrhini Dietel y Holw.) y la roya del girasol (Puccinia helianthi Schwein.), cuyo auto–inhibidor fue determinado como metil cis–3,4–dimetoxicinamato, y el de la roya del tallo del trigo (Pucciniagraminis Pers.: Pers. f. sp. tritici Eriks. y E. Henn.) fue identificado como metil cis–4–hidroxi–3–metoxicinamato (metil cis–ferulato) (Foundin y Macko, 1974; Macko et al., 1971a, b, 1976, 1977). También se han encontrado resultados positivos en estudios con extractos de hongos y levaduras (Martins et al., 1986; Piero, 2003). Resultados completos de las lecturas se presentan en el Cuadro 1, donde se observa que para las estructuras de los agentes causales de roya, hubo un aumento en la longitud de los metabasidios y de los tubos germinativos a medida que se fueron tratando con los diferentes extractos (EAE₁ a EAE₄). En todos los tratamientos testigo, los metabasidios y tubos germinativos se presentaron más desarrollados que en los otros tratamientos (Figs. 1 y 2A, F, K), y después de 6 h ya había formación de esterigmas e indicios de los basidiosporos. El tratamiento EAE₁ inhibió totalmente la germinación de metabasidios a las 4 y 6 h en P. pampeana (Figs. 1A y 2B), así como los tubos germinativos de H. vastratrix a las 4 h, pero a las 6 h mostraron un pequeño crecimiento (Figs. 1C y 2L), mientras que C. plumierae presentó crecimiento de los tubos germinativos a las 4 h y aún mayor a las 6 h (Figs. 1B y 2G). El tratamiento con el extracto EAE₂ tuvo un efecto similar en las tres royas; el rango de longitud de los metabasidios y tubos germinativos fue de 13.66 a 28.26 μm a las 4 h y de 24.99 a 41.94 μm las 6 h (Figs. 1 y 2C, H, M). El patrón de elongación de las estructuras fue similar con el EAE₃, pero mayor que EAE₂ (Figs. 1 y 2D, I, N); lo mismo sucedió con el extracto EAE₄ (Figs. 1 y 2E, J, O). En este último tratamiento el rango de longitud fue de 46.84 a 58.31 μm a las 4 h, y de 69.91 a 80.62 μm a las 6 h. La máxima diferencia en la elongación de las estructuras entre el tratamiento con el extracto acuoso EAE₁ y EAE₄ fue de 56.52 a las 4 h, y de 69.91 μm a las 6 h para P. pampeana, de 35.85 a las 4 h, y de 55.99 μm a las 6 h para C. plumierae y de 58.31 a las 4 h, y de 64.62 μm a las 6 h para H. vastratrix. Fue notable la consistencia en el incremento en cada uno de los metabadisios y tubos germinativos con las diluciones consecutivas de los extractos en las lecturas después de 4 y 6 h. Las urediniosporas de C. plumiearae utilizadas como testigo, germinaron produciendo un tubo germinal significativamente largo, principalmente después de 6 h (Figs. 1B y 2F). Las urediniosporas de Hemileia vastratrix utilizadas como testigo germinaron como los testigos anteriores, con esta roya se observaron tubos germinales largos en la lectura realizada después de 6 h. Cabe resaltar que el auto–inhibidor presente en los extractos provoca atraso en la germinación de esporas. En las teliosporas aecidióides de P. pampeana, tratados con EAE₁, y pasadas 6 h del contacto de las esporas con los extractos no hubo germinación. Posiblemente porque son esporas de la misma especie que originó el extracto utilizado, y así más sensible a su propio auto–inhibidor. Los resultados obtenidos están de acuerdo con Figueiredo y Carvalho Jr. (1994a), que además de teliosporas de P. pampeana también utilizaron urediniosporas de C. plumierae, en un estudio semejante. La cantidad de teliosporas telióides utilizada para la extracción del EAE fue menor (20 mg) que la cantidad utilizada por los autores (35 mg), aún así, los resultados fueron similares. Se detectó aumento creciente en la longitud de las estructuras medidas (metabasidio y tubo germinal) a partir del EAE₂ al EAE₄, siendo ese aumento más grande en las lecturas después de 6 h. Eso comprobó que las sustancias auto–inhibidoras de la germinación presentes en las paredes de las teliosporas telióides son capaces de promover un retraso en la germinación, y no la muerte total de las teliosporas. En las teliosporas aecidióides de P. pampeana en contacto con EAE₁ no se observó germinación, aún pasadas 6 h. Pero en tratamiento con EAE₂ hubo germinación, eso puede ser porque en el primer lavado de las teliosporas (EAE₁) es posible obtener un extracto con mayor concentración de sustancias inhibidoras, y el mismo diminuye en los lavados siguientes. El retraso en la germinación de estructuras de royas, en el hábitat del hongo, deberá interferir en la ocurrencia de la enfermedad, pues, siendo necesario un período de temperatura favorable y agua libre, ocurre retraso de germinación de las esporas de un agente causal de alguna roya, impidiendo la infección y la ocurrencia de la enfermedad. En el caso de la roya del cafeto, las urediniosporas de H. vastratrix, para que penetren en su hospedante, necesitan la abertura de los estomas, y eso ocurre por la noche. En caso de que haya retraso de germinación de las uredinioporas, los estomas cierran bajo la luz del día y los tubos germinales pueden desecarse al sol, entonces las urediniosporas se vuelven inviables. Las diferencias en la germinación de las tres estructuras de agentes causales de royas utilizadas en este experimento están ilustradas y comparadas en la Figura 2. Existe un comportamiento diferenciado entre estructuras de cada especie de royas utilizadas en este estudio, cuando son puestas en contacto con los extractos. Parece que las teliosporas aecidióides de P. pampeana son más sensibles a la acción de la sustancia inhibidora presente en las teliosporas telióides, aunque pasadas 6 h no mostraron germinación. La presencia de sustancias auto–inhibidoras de la germinación en teliosporas de otras royas fue constatada por Figueiredo et al. (.990). Los autores comprobaron la presencia de estas sustancias en teliosporas de Puccinia cnici–oleracei Pers., roya que ocurre en pincilito o hierba socialista (Emilia sonchifolia L.), por medio de lavados sucesivos, utilizando un aparato denominado germinatélio, desarrollado en el laboratorio de Micología Fitopatológica del Instituto Biológico de São Paulo (Figueiredo y Coutinho, 1984).

 

AGRADECIMIENTOS

Nuestros agradecimientos al Ingeniero Agropecuario y alumno de Maestría de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la UNESP, Juan Fernan Sierra Hayer, por la colaboración y sugerencias.

 

LITERATURA CITADA

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