Artículos científicos

 

Competencia por Nutrientes; Modo de Acción de Candida oleophila Contra Penicillium expansum y Botrytis cinerea

 

Nutrient Competition; Action Mode of Candida oleophila Against Penicillium expansum and Botrytis cinerea

 

Víctor Manuel Guerrero Prieto¹, Ana Cristina Blanco Pérez¹, César Guigón López², Carlos José Tamayo Urbina², Francisco Javier Molina Corral², David Ignacio Berlanga Reyes², Elizabeth Carvajal Millán³ y Graciela Dolores Ávila Quezada⁴

 

¹ Facultad de Ciencias Agrotecnológicas, Universidad Autónoma de Chihuahua, Campus Cuauhtémoc, Chih., Presa La Amistad s/n, Cuauhtémoc, Chih., CP 31500, México. Correspondencia: vguerrero@uach.mx

² Centro de Investigación en Alimentos y Desarrollo, A.C., Unidad Cuauhtémoc, Av. Río Conchos s/n, Parque Industrial, Apdo. Postal 781, Cuauhtémoc, Chih, CP 31570, México.

³ Centro de Investigación en Alimentos y Desarrollo, A.C., Unidad Hermosillo, Carr. a La Victoria, km 0.6, Hermosillo, Son., CP 83000, México.

⁴ Centro de Investigación en Alimentos y Desarrollo, A.C., Unidad Delicias, Av. 4^a Sur No. 3820, Delicias, Chih., CP 33089, México.

 

Recibido: Enero 28, 2011
Aceptado: Mayo 21, 2011

 

Resumen

Tres cepas de Candida oleophila y su combinación, se evaluaron para determinar la competencia por nutrientes, como modo de acción para el biocontrol de Penicillium expansum y Botrytis cinerea. Los tratamientos con C. oleophila redujeron la germinación de conidios de ambos patógenos, al ser enfrentadas en jugo de manzana 'Golden Delicious' al 1%. Conidios de P. expansum germinaron a 1x10⁷ mL^-1 y conidios de B. cinerea germinaron a 5x10⁵ mL^-1. Los tratamientos con C. oleophila disminuyeron la germinación de conidios de 2-7x10⁴ mL^-1 para P. expansum y de 1-4x10⁴ para B. cinerea. Los tratamientos con C. oleophila redujeron la germinación de conidios con promedios de 99% para P. expansum y de 96% para B. cinerea. Los azúcares consumidos por L07 rugosa fueron de 0.026 mg mL^-1 contra B. cinerea y de 0.056 mg mL^-1 contra P. expansum. El consumo de azúcares corrobora la reducción de germinación de conidios. P. expansum consumió 1.69 μg L^-1 de proteínas, mientras que L07 rugosa consumió la mayor cantidad con 47.95 μg L^-1. B. cinerea consumió 8.95 μg L^-1 y L06 36.89 μg L^-1, que fue estadísticamente igual al de L07 rugosa con 27.96 μg L^-1. Las cepas de C. oleophila, ejercieron un biocontrol de B. cinerea y P. expansum, en parte, por competencia de nutrientes.

Palabras clave: Control biológico.

 

Abstract

Three strains of Candida oleophila and their combination were evaluated for nutrient competition as a mode of action for the biocontrol of Penicillium expansum and Botrytis cinerea. C. oleophila treatments reduced germination of conidia of both pathogens when challenged on 1% 'Golden Delicious' apple juice. P. expansum conidia germination was 1x10⁷ mL^-1 and B. cinerea conidia germination was 5x10⁵ mL^-1. C. oleophila treatments lowered conidia germination from 2-7x10⁴ mL^-1 for P. expansum and from 1-4x10⁴ for B. cinerea. C. oleophila treatments reduced conidia germination on an average of 99% for P. expansum and 96% for B. cinerea. Sugar consumption for L07 rugose was of 0.026 mg mL^-1 against B. cinerea and of 0.056 mg mL¹ against P. expansum. Sugar consumption supports conidia germination reduction. P. expansum consumed 1.69 μg L^-1 of proteins, while L07 rugose consumed the greatest amount with 47.95 μg L^-1. B. cinerea consumed 8.95 μg L^-1 and L06 consumed 36.89 μg L^-1, which was statistically equal to that of L07 rugose with 27.96 μg L^-1. C. oleophila strains biocontrol B. cinerea and P. expansum, in part, by nutrient competition.

Keywords: Biological control.

 

Durante el almacenamiento en refrigeración de la manzana, se presentan pérdidas de importancia económica. Éstas son causadas por varios factores, siendo el más común, la invasión de la fruta por Penicillium expansum y Botrytis cinerea (Gholamnejad y Etebarian, 2009; Sharma et al., 2009). En la actualidad el control químico con fungicidas sintéticos es el más utilizado contra estos hongos (Droby et al., 2009). Aunque este tipo de control es eficiente, también presenta desventajas; selección de cepas resistentes (Kim y Xiao, 2010), riesgo para la salud humana y el ambiente. La residualidad de los fungicidas sintéticos puede contaminar agua, suelo y aire, así como alimentos en los que se aplican. Debido a los riesgos toxicológicos involucrados, varios fungicidas han sido retirados del mercado (Calvo et al., 2007; Gholamnejad et al., 2010). Las tácticas alternativas de control de estas enfermedades son necesarias debido a los altos costos económicos para el desarrollo de nuevos grupos de agroquímicos (Yu et al., 2007). El uso de levaduras antagonistas, es una estrategia viable y prometedora para el biocontrol de las enfermedades en poscosecha (Droby et al., 2002; Droby et al., 2009; Gholamnejad et al., 2010; Janisiewicz y Korsten, 2002; Sharna et al., 2009). Un número significativo de levaduras han sido estudiadas para controlar las pérdidas en poscosecha de frutas, mostrando una gran eficacia de control (Droby et al., 2009; Gholamnejad et al., 2010; Janisiewicz y Korsten, 2002; Punja y Utkhede, 2003). Las levaduras endémicas, presentes en frutas y hortalizas, han sido utilizadas debido a una serie de características que les confieren mayores posibilidades de colonizar las superficies de frutas y heridas en las mismas (Sharma et al., 2009). Una condición previa para mejorar la actividad de biocontrol de Candida oleophila o de otras levaduras de biocontrol en general, es el conocimiento de su modo(s) de acción para el control de patógenos (Sharma et al., 2009). Reportes demuestran que la actividad de biocontrol puede implicar diversos modos de acción, entre estos, uno de los más comunes es la competencia por nutrientes y espacio (Chan y Tian, 2005; Droby et al., 2009; Janisiewicz et al., 2000; Sharma et al., 2009). La competencia por nutrientes es un fenómeno bien documentado (Droby et al., 2009) y se define como la demanda simultánea de los mismos recursos por dos o más poblaciones microbianas. Este modo de acción es común en bacterias y hongos, debido a la relación superficie/volumen que éstos tienen. Estas características les permiten asimilar los nutrientes disponibles y diluir las soluciones nutritivas con más rapidez y en mayor cantidad que los tubos germinativos de hongos patógenos filamentosos (Janisiewicz et al., 2000). En este contexto, Vero et al. (2002) reportan que Cryptococcus laurentii y Cryptococcus flavus pueden colonizar rápidamente las heridas de manzana y pera y de otras frutas bajo condiciones atmosféricas desfavorables para el desarrollo de los patógenos (1.5-2% de CO₂). Entre otros antagonistas que se han evaluado con éxito se encuentra Rahnella aquatilis, una bacteria antagónica, que se reporta como inhibidora de la germinación de conidios de P. expansum y B. cinerea en manzana, por medio de la competencia por nutrientes (Calvo et al., 2007). Candida oleophila también muestra una reducción en el número de germinación de conidios germinados, tanto para P. expansum como para B. cinerea (Janisiewicz et al., 2000). El rápido crecimiento y la amplia colonización de la herida por antagonistas son características importantes de muchos de los agentes de biocontrol en poscosecha (Droby et al., 2009). El crecimiento activo de las células de microorganismos antagonistas, supone el agotamiento de los nutrientes y/o la invasión del espacio disponible para los agentes patógenos y, por lo tanto, reduce su tasa de crecimiento y la incidencia de la infección (Sharma et al., 2009). Guerrero et al. (2004) aislaron cinco levaduras de la superficie de la manzana 'Golden Delicious'. Tres cepas de estas correspondieron a C. oleophila, cuya actividad antagonista fue comparable incluso con los productos químicos sintéticos utilizados para el control de hongos patógenos como P. expansum y B. cinerea. El objetivo de este estudio consistió en determinar si la competencia por nutrientes, es un modo de acción utilizado por C. oleophila, para el control de P. expansum y B. cinerea en manzanas en poscosecha.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos. Las cepas de C. oleophila L06, L07 lisa y L07 rugosa, así como Penicillium expansum y Botrytis cinerea, se obtuvieron de la colección 'Microorganismos de la Zona Templada', de la Unidad Cuauhtémoc, Chih., del CIAD, A. C.

Determinación de germinación de conidios. La germinación de conidios se utilizó para identificar la competencia por nutrientes, al ser enfrentados cada uno de ellos por separado contra los tratamientos de C. oleophila. Para el ensayo se usaron cajas para cultivo de tejidos de 24 pozos, en las que cada pozo contenía un inserto cilíndrico de plástico que contenía una membrana de poli carbonato de 13 mm y 4.5 µm de tamaño de poro (Corning, NY 14831 EUA). El medio de cultivo en el que se dio la competencia por nutrientes fue una solución al 1% de jugo fresco de manzana 'Golden Delicious' en agua destilada estéril. Este medio que contenía cada una de las tres cepas de C. oleophila y la combinación de las tres, a una concentración de 8 x 10⁶ UFC mL^-1 se inoculó individualmente a razón de 700 l en cada uno de los 24 pozos. Paralelamente, se prepararon dos soluciones: una de P. expansum y otra de B. cinerea, en agua destilada estéril, a una concentración de 2 x 10⁵ conidios mL^-1. De estas soluciones, se colocaron 500 1 en cada inserto, según fuera el caso. Todas las concentraciones de los microorganismos fueron ajustadas utilizando un hemocitómetro. Los hongos y levaduras se utilizaron después de 48 h de incubación a 28 °C. Las cepas de levaduras y los hongos utilizados como tratamientos en la caja de cultivo se incubaron a 26-27 °C por un periodo de 36 h (incubadora Precision Scientific, modelo 31534, EUA). Después de la incubación, se separaron los insertos, retirando por completo la membrana. La membrana se colocó en un portaobjetos, agregándole una gota de azul de algodón lacto fenol (HYCEL, México), para observar y contabilizar al microscopio (Carl Zeiss, Axiolab DRBKT), el número de conidios germinados mL^-1 de P. expansum y B. cinerea, según el caso (Janisiewicz et al., 2000). El diseño experimental fue un bloques al azar, utilizando seis repeticiones por tratamiento y el experimento se repitió tres veces, para cada uno de los hongos P. expansum y B. cinerea. La variable de respuesta fue el número de conidios germinados mL^-1 en cada hongo al ser enfrentados contra C. oleophila. La germinación de conidios después de la evaluación al microscopio, no incluyó la evaluación del crecimiento del micelio. El análisis de varianza se realizó para el número de conidios germinados mL^-1. Adicionalmente, se reportó la disminución de la germinación de conidios en porcentaje, con la finalidad de apreciar la disminución de la misma. El jugo de manzana restante de cada pozo, se almacenó en micro tubos Eppendorff de 2 mL para el análisis de azúcares por HPLC y de proteínas totales (Bradford, 1976).

Determinación de azúcares por HPLC. Se realizó la cuantificación de tres fuentes de carbono utilizadas por las cepas estudiadas (Guerrero et al., 2004) en el jugo de manzana. Las fuentes fueron; glucosa, fructosa y sacarosa. Para estas determinaciones, las condiciones del equipo de cromatografía líquida de alta resolución (VARIAN, detector Uv-Vis 9050, índice de refracción 9040 y bomba 9012, software VARIAN Star, versión 5.5) fueron las siguientes: columna Supelcogel C18 de 30 x 7.8 mm (Supelco, SIGMA), flujo para la fase móvil de 0.50 mL min^-1, temperatura de la columna 70 °C y loop de 20 μL, volumen de inyección de 100 μL, agua destilada desionizada como fase móvil. El arreglo de tratamientos fue un factorial, con los factores: azúcar por tratamiento y azúcar por microorganismo, con tres repeticiones. El experimento se repitió dos veces. La variable de respuesta consistió en las cantidades consumidas en mg mL^-1 de cada azúcar cuantificada. El consumo de azúcar fue evaluado para cada tratamiento, ya fuera solo o en combinación.

Determinación de proteínas totales. Las proteínas totales (Bradford, 1976) se determinaron colocando 800 μL de la muestra y 200 μL de reactivo para proteínas (Bio-Rad, México), en una cubeta de poliestireno de 1.5 mL. Las muestras se dejaron reposando durante 5 min y se leyó la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro (VARIANUV-Vis Cary 1E, EUA). Para los cálculos finales, se elaboró una línea de calibración utilizando albúmina de suero de bovino y se determinó la concentración de las muestras mediante la ecuación Y=1.4511x +0.0486 (R²=0.9971). El arreglo de tratamientos fue un factorial, con los factores, proteínas totales por tratamiento y proteínas totales por microorganismo, con tres repeticiones. El experimento se repitió dos veces. La variable evaluada fue la cantidad de proteínas totales consumidas en μg mL^-1 por cada hongo al ser enfrentado contra los tratamientos de C. oleophila. También se consideró el consumo de proteínas totales en porcentaje, para los diferentes tratamientos.

Análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANDEVA), por el programa estadístico SAS (Statistical Analysis System, versión 6.12. Cary. NC, EUA) y las medias se compararon por la prueba de Tukey (p<0.05).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para los ensayos se utilizó un sustrato similar a las condiciones naturales, en el cual el antagonista no permite la germinación de conidios. En este trabajo fue posible determinar la competencia por nutrientes con una mayor precisión ya que el antagonista y el patógeno estuvieron divididos por una barrera física (Janisiewicz et al., 2000).

Germinación de conidios de Penicillium expansum y Botrytis cinerea. Todos los tratamientos con C. oleophila redujeron la cantidad de conidios germinados por mL en P. expansum. Las cepas de C. oleophila, solas o combinadas redujeron significativamente el número de conidios germinados por mL. La cepa L07 lisa ocasionó un 99.8% de reducción de germinación de conidios de P. expansum (Cuadro 1). El consumo más alto de azúcares y proteínas totales (Figura 1 y Cuadros 2 y 3, respectivamente) por todos los tratamientos de C. oleophila, en comparación a P.expansum, dio por resultado un promedio de reducción de germinación de conidios del 99%. La significativa reducción de la germinación de conidios de P. expansum demuestra la capacidad de C. oleophila para inhibir el desarrollo de este hongo. En el caso de B. cinerea, el efecto de los tratamientos a base de C. oleophila fue similar a los resultados observados en las muestras de P. expansum. Se observó un decremento significativo en la germinación de conidios al compararlos con el testigo, presentando valores promedios de reducción de germinación de conidios del 96%. La cepa L07 rugosa y la combinación de las tres cepas presentaron los mayores efectos en reducciones de germinación de conidios (Cuadro 1). Las diferencias en la reducción de la germinación de conidios en B. cinerea correspondieron con el consumo de azúcares (Cuadro 1 y Figura 1). La germinación de conidios, para ambos hongos, fue inhibida durante 48 h. Los resultados obtenidos en este trabajo son similares a los reportados por Janisiewicz et al. (2000), en los cuales encontraron que el antagonista Aureobasidium pullulans redujo la germinación de conidios en 50%. Bencheqroun et al. (2007), utilizaron levaduras como antagonistas contra P. expansum y B. cinerea y observaron una reducción de la germinación de conidios de 71% en jugo de manzana al 0.5% después de 24 h de incubación, concluyendo que el principal modo de acción de las levaduras fue la competencia por nutrientes y espacio. Cuando se utilizó Metchnikowia pulcherrima (Chian y Tian, 2005), se concluyó que el principal modo de acción de esta levadura fue la competencia por nutrientes y espacio, infiriendo que el medio ambiente nutritivo que se presenta en las heridas de la manzana fue favorable para que esta levadura antagonista colonizara rapidamente el tejido de la fruta y compitiera con el patógeno por nutrientes y espacio.

Consumo de azúcares. El consumo de azúcares se incrementó en los tratamientos a base de C. oleophila en relación a B. cinerea y P. expansum (Figura 1 y Cuadro 2). El consumo fue mayor para los tratamientos contra P. expansum. El Cuadro 2 y la Figura 1 muestran que B. cinerea consumió menos azúcares que P. expansum. Aunque el nivel general de consumo de azúcares fue más bajo para B. cinerea, las diferencias estadísticamente significativas se presentaron entre la cepa L07 lisa y la L07 rugosa, al compararlas contra la cepa L06 y la combinación de las tres cepas (Cuadro 2). Sin embargo, en los tratamientos contra P. expansum no hubo diferencias significativas entre ninguno de los tratamientos (Cuadro 2). La reducción en la germinación de conidios por los tratamientos corresponde con los resultados para el consumo de azúcares. Las tres cepas de C. oleophila y su combinación presentaron un comportamiento competitivo en el consumo de azúcares contra B. cinerea (Filonow, 1998). Aunque los tratamientos contra P. expansum dieron una porcentaje mayor de reducción de la germinación de conidios que para B. cinerea, las diferencias entre los tratamientos no fueron significativas (Cuadros 1 y 2). Los resultados concuerdan con los encontrados con anterioridad por Janisiewicz et al. (2000) y Vero et al. (2002) que demuestran la diferencia en el consumo de azúcares entre los tratamientos a base de C. oleophila y P. expansum.

Determinación de proteínas totales. El consumo de proteínas totales fue similar para P. expansum y para B. cinerea, ya que ambos hongos consumieron menor cantidad de proteínas contenidas en el jugo de manzana (Cuadros 3). No hubo diferencias significativas entre el contenido de proteínas totales en el jugo de manzana y el consumo del hongo. El consumo promedio de proteínas totales de los tratamientos a base de C. oleophila fue del 32.1%, contra un 1.3% para P. expansum (Cuadro 3). Los tratamientos de C. oleophila, al ser enfrentados contra B. cinerea presentaron un promedio de consumo de proteínas del 25.6%, contra un 7.0% para el hongo (Cuadro 3). Las cantidades de proteínas consumidas por P. expansum y B. cinerea no fueron significativas al compararlos con las cantidades de proteínas contenidas en el jugo de manzana y las cantidades de proteínas consumidas por los tratamientos a base de C. oleophila. El mayor consumo de proteínas por los tratamientos con C. oleophila, indica una competencia por el consumo de estos compuestos, lo que sugiere que esta competencia redujo la germinación de conidios mL^-1 (Cuadro 1).

 

CONCLUSIONES

Ya que hubo un mayor consumo de azúcares y proteínas por las levaduras, que el consumo de estos mismos compuestos por los hongos evaluados, la competecia por nutrientes se mostró como un modo de acción por el cual las cepas de Candida oleophila controlan, en parte, a Penicillium expansum y Botrytis cinerea.

 

AGRADECIMIENTOS. Al Fondo Mixto Estado de Chihuahua-CONACYT, México, por el apoyo brindado para la realización de este proyecto de investigación clave CHIH.-2006-CO2-58803. Este trabajo de investigación forma parte de la tesis de Maestría en Ciencias de Ana Cristina Blanco Pérez.

 

LITERATURA CITADA

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