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El género Brenneria fue descrito en 1998 (Hauben et al., 1998) para agrupar a seis especies bacterianas, anteriormente incluidas en el género Erwinia (González et al., 2002). Las 6 especies incluidas en el género Brenneria son: B. alni, B. nigrifluens, B. paradisiaca, B. quercina, B. rubrifacies y B. salicis. De las especies antes mencionadas, B. nigrifluens y B. rubrifaciens son las más estudiadas debido a que afectan al nogal de castilla (Juglans regia L.), que es un cultivo de alto valor económico en el mundo. B. nigrifluens es causante del cancro superficial de la corteza y B. rubrifaciens del cancro profundo de la corteza del nogal de castilla. En Europa B. nigrifluens fue identificado en huertas de nogal de castilla. Posteriormente, la bacteria fue detectada en Francia e Italia en plantas jóvenes y árboles adultos (Saccardi et al., 1998; Morone et al., 1998; Ménard et al., 2004; Nelson y Hudler, 2007; Scortichini, 2008; Abeysekara, 2014; Narayanasamy, 2011). En España B. rubrifaciens ha sido reportada en nogales de castilla y en árboles importados de California (González et al., 2002; Nelson y Hudler, 2007). En México no se ha reportado Brenneria en los cultivos de nogales pecanero Carya illinoensis (Wang.) K. Koch ni de castilla, pero SENASICA ha establecido mapas de riesgo por la importancia económica del nogal pecanero a nivel nacional, ya que en el país, la superficie sembrada fue según SIAP (2014) de 108 011 ha, con una superficie cosechada de 75 439 ha, con una producción de 125 758 ton y un rendimiento de 1.67 ton ha-1. Los principales estados productores de nuez pecanera son: Chihuahua con el 54 % del volumen nacional, Sonora 16 %, Coahuila 14 %, Durango 6 % y Nuevo León 5 %. El 98.8 % de la nuez es pecanera, 1.1 % de castilla y 0.1 % criolla (SAGARPA-SIAP, 2013). En el país la producción de nuez de castilla se obtiene de forma tradicional desde hace tres siglos, esta se concentra en los estados de Puebla, Tlaxcala, Estado de México, Oaxaca y Querétaro (Luna et al., 2013). La importancia de la enfermedad y dificultades en el control de Brenneria spp. resaltan el impacto de un diagnóstico oportuno (Bettiol et al., 2014; López y Peñalver, 2005), sin embargo, la enfermedad puede ser asintomática en un inicio, esto puede dificultar el diagnóstico. Entre las técnicas para el diagnóstico de Brenneria se encuentran las pruebas bioquímicas, utilización de medios selectivos, técnicas moleculares, técnicas serológicas y pruebas de patogenicidad (Moretti y Buonario, 2010). En el presente trabajo se tiene como objetivo presentar la situación a nivel nacional y mundial del cancro del nogal, así como la revisión de las técnicas de diagnóstico de la enfermedad.
Distribución de la enfermedad
Nivel mundial. B. nigrifluens y B. rubrifaciens han sido reportados en distintas regiones del mundo como causantes del cancro del nogal. Los principales países en los que se han reportado son: Irán (Yousefi et al., 2007; Jamalzade et al., 2012; Roshangar y Harighi, 2009), Francia, España (Loreti et al., 2008), Italia (Loreti et al., 2005; Pardatscher y Schweigkofler, 2009) y Estados Unidos (Wilson et al., 1957). En el Cuadro 1 se resumen reportes de Brenneria causante de cancro del nogal en distintas regiones del mundo, así como las técnicas utilizadas para la identificación de los patógenos.
Cuadro 1 Reportes de Brenneria sp. como causante del cancro del nogal y técnicas de diagnóstico.
| Región | Hospedero | Patógeno | Técnica de diagnóstico | Referencia |
| California | Nogal Inglés (Juglans regia L.) | Erwinia nigrifluens | Síntomas, pruebas bioquímicas | Wilson et al., 1957 |
| Persia | Nogal persa (Juglans regia L.) | Brenneria rubrifaciens (Erwinia rubrifaciens) | Signos y síntomas | Schaad y Wilson, 1971 |
| Irán | Nogal persa (Juglans regia L.) | Brenneria nigrifluens | Caracterización bioquímica | Rahimian, 1989 |
| España | Nogal persa (Juglans regia L.) | Brenneria nigrifluens | Caracterización bioquímica | López et al., 1994 |
| Italia | Nogal persa (Juglans regia L.) | Erwinia nigrifluens | Caracterización bioquímica | Morone et al., 1998 |
| Europa | Juglans hindsii | Brenneria rubrifaciens | Caracterización bioquímica por API, ELISA y pruebas de patogenicidad | González et al., 2002 |
| Francia | Nogal (Junglans regia persas) | Brenneria nigrifluens | Pruebas bioquímicas y pruebas de patogenicidad. | Ménard et al., 2004 |
| Iran | Nogales persas (Juglans regia L.) | Brenneria nigrifluens | PCR (gen 16s) | Roshangar y Harighi, 2009 |
| No especifíca | Nogal (Juglans regia L.) | Brenneria rubrifaciens, Brenneria nigrifluens, otros. | Estudios de ADN, mutagénesis y ensayo de virulencia. | McClean y Kluepfel, 2009 |
| Francia, Nueva Zelandia, Italia | Nogales persas (Juglans regia L.) | Brenneria sp. and Xanthomonas sp. | Pruebas bioquímicas, pruebas de patogenicidad y F-AFLP | Hajri et al., 2010 |
| Iran | Nogales persas (Juglans regia L.) | Brenneria nigrifluens | rep-PCR, secuencias de inserción (IS50-PCR), RAPD | Jamalzade et al., 2012. |
| Italia | Nogal (Juglans regia L.) | Brenneria rubrifacienscis | PCR de genes responsables de la producción de rubrifacina. Hibridación dot blot. | Thapa et al., 2010 |
| Iran | Nogales persas (Juglans regia L.) | Brenneria nigrifluens | Pruebas bioquímicas, patrones electroforéticos y rep-PCR | Jamalzade et al, 2012. |
| Serbia | Nogal (Juglans regia L.) | Brenneria nigrifluens | Pruebas bioquímicas y PCR (gen 16s). | Popovic, et al., 2013 |
| Hungría | Nogal (Juglans regia L.) | Brenneria nigrifluens | Pruebas bioquímicas, pruebas de patogenicidad, PCR (gen 16s), RT-PCR. | Végh et al., 2014 |
Nivel nacional. En México no existen reportes de infección de nogales pecaneros con B. rubrifaciens o B. nigrifluens. No obstante, existen zonas con hospederos y condiciones climáticas similares a otras regiones del mundo en los que se ha presentado la enfermedad. Según las estadísticas mostradas por SIAP (2013)B. rubrifaciens representa un elevado riego para México ya que el nogal pecanero es uno de los cultivos más rentables a nivel nacional. Para el año 2011, la superficie sembrada fue superior a las 96 000 ha (SIAP, 2013). Por estas razones SENASICA (2013) ha establecido mapas de riesgo indicando las zonas de posible incidencia de B. rubrifaciens. La cercanía a Estados Unidos también pone en riesgo los cultivos de Nogal, ya que existen reportes de presencia del cancro del nogal en California y Texas (SENASICA, 2013). Por el riesgo de la infección de nogales en México, SENASICA colocó el cancro del nogal ocasionado por B. rubrifaciens en la lista de "Plagas bajo vigilancia activa" en el 2010 y 2011 (López, 2013).
Biología del patógeno
B. rubrifaciens se activa al final de la primavera y comienza a brotar de los cancros junto con la savia de la planta (SENASICA, 2013). La bacteria se propaga por la corteza y por el floema, afectando el transporte de nutrientes (UC IPM, 2007; SENASICA, 2013). Investigaciones sugieren que B. rubrifaciens pueden residir en el tejido vascular de los árboles y permanecer latente hasta que un cambio en las condiciones ambientales (como el estrés hídrico) lo activen (McClean y Kluepfel, 2010).
Técnicas de diagnóstico
Técnicas tradicionales
Síntomas y signos. B. rubrifaciens presenta síntomas tardíos en árboles mayores a 15 años de edad, ocasionando una crónica disminución de vigor y rendimiento (McClean y Kluepfel, 2010). Los síntomas de esta enfermedad involucran hoyos en la madera, grietas profundas longitudinales en el tronco, exudado color oscuro marrón cargado de bacterias que fluyen de las grietas de las ramas y cancro profundo. Internamente, se observa en el cancro profundo de la corteza del nogal, líneas negras y zanjas obscuras. Además se pueden presentar largas y profundas rupturas con un color café marrón a negro, y exuda savia (SENASICA, 2013; Growing and protecting New Zeland, 2008; SAGARPA, Guía de síntomas de cancro profundo de la corteza del nogal (Brenneria rubrifaciens); McClean y Kluepfel, 2010).
Dworkin et al (2006) B. nigrifluens causa el cancro profundo en nogales ingleses. Mientras que, en el manual de "Post-Entry Quarantine Testing" de Nueva Zelanda en el 2008 señala que B. nigrifluen es responsable del cancro superficial de la corteza del nogal y ocasiona necrosis en la corteza exterior y manchas dispersas de exudado marrón oscuro en la corteza del árbol.
Otras especies de Brenneria como B. alni provoca cancros en la corteza, ramas y troncos, así como exudados en grietas. B. quercina en robles presenta síntomas similares. B. salicis es el agente causal de la "enfermedad de marca de agua" en los sauces, la cual reside dentro de los vasos del xilema de los árboles infectados y provoca marchitez seca con coloración marrón de las hojas (Dworkin et al., 2006).
Medios específicos y diferenciales. Permiten identificar a Brenneria según la producción de metabolitos específicos. El medio King B (KB) es apropiado para el aislamiento de B. nigrifluens y B. rubrifaciens a partir de exudados de cancros. B. rubrifaciens en medios KB y YPGA (agar, extracto de levadura, peptona, glucosa y almidón soluble) produce un característico pigmento rosa. En medio KB, las colonias de B. rubrifaciens después de 48 h de incubación a 26-28 °C, crecen de forma circular, lisa, de color crema claro (Biosca y López, 2012). La diferenciación de especies de Pseudomonas de especies de Brenneria, se logra tras la examinación con luz ultravioleta; así B. rubrifaciens produce un pigmento rosa difusible en YDCA. El medio YPGA o el YDCA (agar dextrosa carbonato de calcio extracto de levadura) se utilizan para aislar B. nigrifluens y B. rubrifaciens, respectivamente (Loreti et al., 2008; McClean et al., 2008; Biosca et al., 2008). B. rubrifaciens produce un pigmento rojo en YDCA llamado rubrifacina (SENASICA, 2013).
Brenneria sp. se caracteriza por su resistencia a algunos antibióticos. McClean et al., (2006) evaluó 11 antibióticos que revelaron que B. rubrifaciens es resistente a la eritromicina y novobiocina a una concentración de 10 mgL-1 y 30 mgL-1, respectivamente. Por ello el uso de estos antibióticos en el medio de cultivo hace posible la elaboración de medios semiselectivos para B. rubrifaciens. Ambos antibióticos afectan la fisiología bacteriana comúnmente, la eritromicina inhibe la síntesis de proteínas y la novobiocina inhibe la enzima de enrollamiento del ADN. Dichos antibióticos pueden ser añadidos a medios de cultivo como YDCA, 10 % TSA, LBA o M9 medio mínimo para la elaboración del medio semiselectivo de B. rubrifaciens.
Aislamiento. Biosca et al. (2008), obtuvieron aislamientos de Brenneria de material vegetal (peridermis, parénquima cortical, exudados y frutos). Dichos aislamientos fueron observados tras 48 h de incubación a 26 °C en medio B de King suplementado o no con cicloheximida (utilizado para inhibir el crecimiento de hongos). El aislamiento puede ser obtenido a partir de tejido exterior o interior del cancro y de exudados, la muestra se puede tomar del borde entre parte de tejido enfermo y parte de tejido aparentemente sano (Biosca y López, 2012). El tejido debe ser desinfectado con soluciones de hipoclorito de sodio y alcohol y triturado en 5 mL de PBS estéril (8 g de NaCl; 0,2 g de KH2PO4; 1,15 g de Na2HPO4, 0,2 g de KCl, pH 7.2 por 1 litro de agua destilada) o solución salina estéril (SS) (0,9 % de NaCl en agua destilada, pH 7,0). Posteriormente se siembra el medio de cultivo seleccionado (Biosca y López, 2012; Charkhabi et al., 2011). La temperatura óptima para el desarrollo de la bacteria en medios de cultivo es de 30 a 33 °C. En este rango y con oxígeno la bacteria fluoresce y produce colonia crema a blanco (SENASICA, 2013).
Pruebas de patogenicidad. Árboles inoculados artificialmente con B. nigrifluens, han puesto de manifiesto la dificultad de reproducir los chancros observados en condiciones naturales (Biosca et al., 2008). En el nogal de castilla Ménard et al., (2004) comprobaron la patogenicidad de tres cepas, al inocular con 108 UFC heridas de ramas de 7 años de edad. La cepa de referencia y agua fueron inoculadas de manera similar como testigos. Dos y cinco meses más tarde, se observaron lesiones necróticas en el interior de la corteza y líneas oscuras en la madera interna, pero no cancros externos sobre los árboles inoculados con las cepas locales y de referencia. Posteriormente, B. nigrifluens se reaisló de las líneas oscuras en la madera interna hasta aproximadamente 10 cm desde el punto de inoculación.
Técnicas bioquímicas
Caracterización fenotípica. Biosca en el 2008, realizó la caracterización fenotípica por medio de sistema API 20 E, API 20 NE, API 50 CH, API ZYM, el sistema Biolog y el análisis de los ácidos grasos celulares (Moretti et al., 2007). Dworkin et al., (2006) llevaron a cabo el diagnóstico por pruebas bioquímicas convencionales. Brenneria spp. son bacterias Gram-negativas, oxidasa negativa, catalasa-positiva, bacilos fermentivos de 1.3 a 3 ηm de largo por 0.5 a 1 ηm de ancho (Hauben, 1998). Bioquímicamente, las especies de Brenneria son similares a Pantoea, Pectobacterim y Erwinia debido a que no producen arginina dehidrolasa y no pueden descarboxilar aminoácidos como la ornitina y lisina. Brenneria produce ácidos de la fermentación de D-glucosa, D-fructuosa, salicina, manosa y sucrosa y no produce amilasas. La mayoría de las especies son sensibles a carbenicilina, cefalotina, cloranfenicol, ácido nalidìxico y tetraciclina, y resistente a bacitracina, eritromicina y gentamicina (Dworkin et al., 2006). Las características diferenciales para clasificar especies del género se muestran en el Cuadro 2.
Cuadro 2 Características diferenciales entre especies de Brenneria (Dowrin et al., 2006; Hauben et al., 1998; Lelliott y Dickey, 1984).
| Característica | B. alni | B. nigrifluens | B. paradisiaca | B. quercina | B. rubrifaciens | B. salicis |
| Indol | - | - | + | - | - | - |
| Β-Galactosidasa | - | + | + | + | + | + |
| Degradación de pectato | - | - | + | - | + | + |
| Producción de ácidos a partir de: | ||||||
| L-arabinosa | + | + | + | - | + | - |
| Rafinosa | - | + | + | - | - | + |
| Xilosa | + | + | + | - | - | - |
De las especies de Brenneria, B. nigrifluens y B. rubrifaciens son las principales causantes del cancro del nogal de castilla por lo que Biosca y López en el 2012 utilizaron un sistema API para señalar las diferencias bioquímicas de ambas especies. Los resultados de la prueba API para señalar las diferencias bioquímicas entre B. nigrifluens y B. rubrifaciens se muestra en el Cuadro 3.
Cuadro 3 Fisiología general y características bioquímicas de cepas de B. nigrifluens y B. rubrifluens (Biosca y López, 2012).
| Prueba* | B. nigrifluens NCPPB 564T | B. rubrifaciens NCPPB 2020T |
| Tinción de Gram o KOH 3 % | - | - |
| Oxidasa | - | + |
| Catalasa | + | + |
| O/F | +/+ | +/+ |
| Reducción de nitrato | - | - |
| dihidrolasa arginina | - | - |
| Ureasa | - | - |
| Indol | - | - |
| Hidrólisis de esculina | + | + |
| Degradación de pectato | - | - |
| β-galactosidasa | + | - |
| producción de ácido a partir de: | ||
| L-arabinosa | + | + |
| Rafinosa | + | - |
| Xilosa | + | - |
| Crecimiento a 36 °C | + | - |
| Crecimiento a 39 °C | - | - |
* Resultados a partir de 48h de inoculación a 26-28 °C
Técnicas serológicas
No están disponibles aún anticuerpos monoclonales específicos para B. nigrifluens y B. rubrifaciens. Algunos anticuerpos han sido evaluados pero han presentado reacciones cruzados con otras especies de Brenneria (Biosca y López, 2012).
Técnicas moleculares
Dentro de los métodos moleculares de diagnóstico se encuentra la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Poza-Carrión et al., 2008; Frutos D, 2010). McClean et al., (2008) desarrollaron técnicas de PCR tiempo real, basado en la identificación en de B. rubrifaciens en suelo y hojas inoculadas, sin embargo, no identificaron bacterias puras o de muestras infectadas. Prasad et al. (2010) realizaron la técnica PCR para la identificación de B. rubrifaciencies utilizando el gen responsable de la síntesis del pigmento rojo rubrifacina producido por B. rubrifaciens, presente solo en esta especie, según indica el autor. Los pares de iniciadores utilizados por Prasad (2010) fueron (a) BrAF y BrAR los cuales corresponden a las posiciones 33-54 y 548-569 del gen B. rubrifaciens asparagina sintetasa (Genbank accession no. FJ205695) y (b) 2BrIF y 2BrIR (ver, Cuadro 4) (McClean y Kluepfel, 2009) diseñado para el gen autoinductor de sintetasa involucrados en la producción de rubrifacina, con tamaño de amplicones esperados de 536 a 671 pb. El límite de detección según el trabajo de Prasad et al., (2010) fue de ~5 × 102 y 5 × 104 UFCmL-1 (~5 células bacterianas por reacción) de suspensión bacteriana y ~5-50 pg ADN genómico total, respectivamente.
Cuadro 4 Primers para Brenneria nigrifluens y Brenneria rubrifaciens.
| Primer | Secuencia (5'-3') | Referencia |
| Fl
C3 |
CCTGCGCCATGTTGCCAGATCGCTAT
ACCTGAGTAGCAGTTTCGACTATTT |
Loreti et al., 2008
(B. nigrifluens) |
| BRI
BR3 GSPIF GSPIR GSP2F GSP2R |
CAGCGGGAAGTAGCTTGCTACTTTGCCGG
TGAAAAAGTCTCTCTTAAACCTTTCC TAGTGTTGCATTAGCCGATTTAG GCATTTAAAGACTATGTTTCCTG CATTACTGTTTCTCCTCGCTAATG GATGTAAATTAGCCATACACGGAATG |
McClean et al., 2008
(B. rubrifaciens) |
| BrAF
BrAR 2 BrIF 2BrIR |
ATGTACGCAGTCTCTATTTGG
CCATCAGCCTGAAATAACTCA CGGGATCCATGTTAGAAATATTCGATGTC ATCAGCTGTCAAGCCTCTTCCTTTTTG |
McClean y Kuepfel, 2009;
Thapa et al., 2010 (B. rubrifaciens) |
McClean et al (2006) describió un par de iniciadores, BR-1 y BR-3, que amplifican una región de 409 pb de la secuencia 16S rDNA, los cuales demostraron sensibilidad y especificidad para la detección de B. rubrifaciens. Al utilizar estos iniciadores en PCR-tiempo real es posible detectar ocho unidades formadoras de colonia (UFC), con límite de detección de 0.45 UFC. Además se puede identificar Brenneria spp mediante análisis de secuenciación parcial del 16S rDNA (Biosca et al., 2006). Los primers diseñados para B. nigrifluens y B. rubrifaciens se resumen en el Cuadro 4 (Biosca y López, 2012).
Métodos cromatográficos
Brenneria así como otros microorganismos, se pueden identificar por la producción de algunos metabolitos, utilizando técnicas cromatográficas, en las que comparando con estándares se identifican señales de algún compuesto en particular. Tal es el caso del estudio de McClean et al. en 2012, el cual se basa en la producción del pigmento rojo rubrifacine y acil-homoserina lactona (AHL) por cepas de Brenneria. Dicho autor utilizó HPLC para B. rubrifaciens, el cual fue cultivado en medio YDC a 28 °C. De los caldos de cultivo se realizaron extracciones repetidas con acetato de etilo y fueron secados con gas nitrógeno. Las muestras fueron resuspendidas en 200 ηL de 50 % metanol y separadas utilizando columna cromatográfica C18 en HPLC fase reversa (con gradiente de metanol de 10 a 100 %, rango de flujo de 1 mLmin-1, con duración de 70 min), esto con el propósito de cuantificar AHLs endógena total. Realizando previamente curvas de calibración.
Cromatografía en capa delgada, en la cual los extractos etanólicos (EtOAc) que contienen AHLs de cepas de Brenneria son corridos con 60:40 metanol-agua en una cámara de cromatografía de capa delgada, comparando con estándares. Dicha técnica fue descrita por McClean en 2012. El mismo autor, describe el análisis por cromatografía líquidaespectroscopia de masas (LCMS) de los extractos EtOAc de B. rubrifaciens y B. nigrifluens en la que estos son diluidos 1:5 previo al análisis LCMS. Los espectros son adquiridos con espectrómetro de masas con un sistema HPLC y una fuente de un atomizador de ionización, operando en el modo de ión positivo. En dicho estudio, la fase móvil contenía 0.1 % de ácido fórmico en agua (solvente A) y 0.1 % de ácido fórmico en acetonitrilo (solvente B). Finalmente, las muestras se separaron con una columna cromatográfica C18 utilizando un gradiente lineal de 5 a 90 % solvente B/solvente A, con 60 min de flujo a un rango de flujo de 200 mLmin-1.
Control
El control de Brenneria rubrifaciens para el nogal de castilla fuera de México, ya que la enfermedad no se ha detectado en el país y consecuentemente no se ha evaluado tratamiento, ni método de diagnóstico alguno. Puede utilizarse el control cultural, que involucra mantener el vigor del árbol a través de prácticas culturales; en especial el manejo del agua, empleando tensiómetros para monitorear la humedad del suelo. El control mecánico por remoción de tejido infectado (ramas, troncos) no es muy recomendado porque deja vulnerable al árbol y no elimina con efectividad al patógeno (SENASICA, 2013).
Conclusión
Debido a la importancia de las enfermedades ocasionadas por Brenneria spp. en plantas leñosas, el diagnóstico oportuno es fundamental. Razón por la que se han desarrollado diferentes métodos que buscan que el diagnóstico se lleve a cabo de una manera más eficiente, incluso en aquellos árboles que no se presentan síntomas. Entre las técnicas más estudiadas para el diagnóstico de Brenneria spp. se encuentran las pruebas bioquímicas, utilización de medios selectivos, técnicas moleculares, técnicas serológicas y de patogenicidad. Sin embargo, la elección del método dependerá de los recursos con los que se cuentan, la rapidez con la que se desean obtener los resultados, así también como de la normatividad y metodologías estandarizadas de cada país. Lo importante es valorar el costo beneficio que el diagnóstico oportuno puede traer al final de la producción.
