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En México los estados con mayor superficie de producción de Capsicum chinense Jacq. son Yucatán, Tabasco, Campeche y Quintana Roo, siendo Yucatán la entidad federativa con más superficie de producción con 170 hectáreas y una producción de 1,826 toneladas (SIAP, 2013). Además debido a sus características organolépticas, de mayor vida de anaquel y picor el chile habanero producido en la Península de Yucatán se considera de calidad superior a los cultivados en otras partes del mundo (Medina et al., 2008). La reducción del rendimiento del cultivo de chile está asociada a la presencia de fitopatógenos. El género Fusarium es uno de los fitopatógenos más importantes asociados al marchitamiento y a la reducción del rendimiento de chile. Fusarium spp. y F. oxysporum fueron los hongos con mayor frecuencia asociados a marchitez en un 100 % de muestras de Capsicum annuum L. de diferentes tipos de chile como serrano y jalapeño (Albañil et al., 2015). En C. annuum L., se han identificado F. oxysporum, F. solani y F. equiseti afectando al cultivo y reduciendo significativamente el rendimiento (Martínez et al., 2011). El método de control más común de estos patógenos es el uso de fungicidas sintéticos que contaminan el ambiente. Por ello una alternativa de control biológico es el empleo de rizobacterias antagonistas, capaces de ejercer un control de patógenos (Guillén et al., 2006). Este antagonismo se atribuye en parte a la producción de quitinasas (Chang et al., 2010) y lipopéptidos como: iturina, surfactina, fengicina y bacilomicina (Ramarathnam et al., 2007). Las rizobacterias más utilizadas son del género Bacillus. Las especies de B. megaterium y B. lincheniformis, además de promover el crecimiento e inducir un mayor rendimiento de C. annuum L., están relacionadas con la reducción de la incidencia de fitopatógenos (Amaresan et al., 2014). La aplicación de B. megaterium en C. annuum infectadas con Phytophthora capsici Leonian redujo la severidad de la enfermedad en un 50.4 % (Akgül y Mirik, 2008). Las rizobacterias activan mecanismos de defensa de las plantas contra fitopatógenos (Ahemad y Khan, 2011). En rizobacterias que promueven el crecimiento vegetal, se ha observado la reducción de algunas enfermedades en las plantas, y están relacionadas con la capacidad de inducir enzimas de defensa, como peroxidasas, polifenol oxidasa, fenilalanina amonio liasa, quitinasas y β-1,3 glucanasa, que pueden tener efecto en la reducción de la incidencia y severidad de las enfermedades (Saravanakumar et al., 2007). Guillén et al. (2006), aplicaron B. amyloliquefaciens B1, B. licheniformis B3, y B. subtilis B9 y B13 sobre Fusarium spp., Rhizoctonia solani Kühn y P. capsici Leonian, patógenos causantes de pudriciones de raíz de chile (C. annuum L.); la aplicación de las bacterias redujo la incidencia en 80 % y severidad de pudrición de raíz en 39 % respecto al testigo. En este estudio se evaluaron cepas de Bacillus spp. con actividad antifúngica in vitro y su efecto en la respuesta de resistencia a la marchitez en C. chinense, inducida por F. equiseti y F. solani.
Materiales y métodos
Microorganismos utilizados y preparación de inóculos.
Se utilizaron 10 cepas de Bacillus, aisladas y caracterizadas en trabajos previos, nueve cepas con actividad in vitro contra diferentes hongos fitopatógenos (Sosa et al., 2012: Mejía et al., 2013; Ruiz et al., 2016) y una cepa (B. cereus BL18) reportada con propiedades en la promoción de crecimiento en C. annum L. (Peña et al., 2016). Los inóculos bacterianos se obtuvieron de cultivos en caldo nutritivo® (CN), de siete días en agitación a 200 rpm a 29 °C, el tiempo utilizado fue para permitir la formación de esporas, lo cual fue verificado con ayuda de un microscopio óptico. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 8,000 x g por 10 min, al paquete celular se le realizó un lavado con solución 0.9 % de NaCl, y se ajustó a una concentración de 1x108 UFC mL-1 con la ayuda de una cámara de Neubauer (Luna et al., 2013). Las cepas de Fusarium solani y F. equiseti fueron previamente aisladas de C. chinense. Los fitopatógenos fueron reactivados en medio de agar de papa dextrosa (PDA). Para su multiplicación se usaron hojuelas de avena esterilizadas en autoclave; para ello se depositaron 100 g de hojuelas en matraces de 250 mL de capacidad y se adicionó 40 mL de extracto de papa (300 g de papa cruda en 1 L de agua hirviendo por 15 min), posteriormente se depositaron dos discos de 0.5 cm del micelio en crecimiento activo de cada hongo fitopatógeno y fueron incubados en cámara de cultivo a 30 °C durante diez días (Bruna, 1991), esto se utilizó como inoculo para pruebas posteriores.
Inhibición de crecimiento micelial in vitro de Fusarium spp. por Bacillus spp.
Los bioensayos se realizaron por confrontación directa con la técnica de cultivo dual ampliamente utilizada (Li et al., 2011; Essghaier et al., 2012; Rios et al., 2016); en cajas Petri de 90 x 15 mm con medio agar de papa y dextrosa (PDA), se colocó un disco de 0.5 cm de diámetro de micelio del fitopatógeno de crecimiento activo de 10 d en el centro de la caja y se inocularon 6 μL de una suspensión bacteriana de 1x108 UFC, en cuatro puntos equidistantes alrededor del crecimiento micelial a una distancia de 2 cm, las cajas se incubaron a 28 °C durante 7 d. Se midió el crecimiento radial y con los datos se calculó el porcentaje de inhibición micelial, tomando como testigo el crecimiento del hongo en PDA sin la presencia de bacterias.
Pruebas de patogenicidad de Fusarium equiseti y F. solani en chile habanero.
Se utilizaron semillas de chile habanero cv. criollo desinfectadas con 2 % de hipoclorito de sodio y lavadas tres veces con agua destilada estéril. Se realizó la siembra en charolas de plástico de 98 cavidades con sustrato estéril comercial Cosmopeat®, esterilizado en una autoclave a 120 °C por 15 min. Se obtuvieron plántulas de 28 días después de la germinación (DDG) a las cuales se les realizó pruebas de patogenicidad para determinar la virulencia por acción de los hongos fitopatógenos. Se prepararon macetas en vasos de poliestireno expandido (unicel) de 32 oz, con 600 g de sustrato de una mezcla de suelo K´ancab (nomenclatura regional Maya) del tipo Luvisol y bovinaza (1:1) (Soria et al., 2002), el tipo Luvisol son suelos arcillosos de color pardo rojizo ligeramente ácido (Bautista, 2005). El sustrato fue esterilizado a 120 °C por 15 min. A este sustrato se le adicionó 10 g de avena con el crecimiento de los fitopatógenos de 1x106 conidios por gramos de avena; el cual se cuantificó tomando un gramo de avena con inóculo y adicionando 9 mL de agua destilada estéril, se realizó el conteo con la ayuda de una cámara de Neubauer, se depositó una plántula por maceta, y con el fin de permitir la entrada del patógeno a la planta, se le hizo un corte de 1 cm al ápice de la raíz, para determinar su virulencia (Herrera et al., 2011).
Evaluación de la resistencia a la marchitez por Fusarium spp. en plantas de chile habanero inoculadas con Bacillus spp.
Las semillas de chile habanero desinfectadas se sembraron en charolas de plástico de 98 cavidades con sustrato estéril comercial Cosmopeat®. A los 15 días después de la germinación (DDG) se realizó una inoculación de 1 mL de suspensión bacteriana de 1x108 UFC mL-1 en la base del tallo de las plántulas, al testigo se le aplicó 1 mL de 0.9 % de NaCl. A los 28 DDG se realizó el trasplante en vasos de unicel de 32 oz con 600 g de sustrato (mezcla Luvisol y bovinaza), previamente inoculados con 10 g de avena que contenían 1x106 conidios·g-1. Se aplicaron 3 mL de la solución bacteriana a los 28 y 35 DDG. La fertilización fue con la fórmula 125-100-150 de N-P-K (Soria et al., 2002). Se estableció el experimento bajo condiciones de un invernadero tipo macrotúnel del Instituto Tecnológico de Conkal (21° 04’ N y 89° 31’ O), con seis tratamientos para cada fitopatógeno evaluado; cuatro cepas bacterianas, un tratamiento que consistió sin la inoculación bacteriana pero con la presencia de los hongos fitopatógenos y un testigo que consistió en plántulas sin inoculación de fitopatógenos ni de cepas bacterias. Se estableció en un diseño completamente al azar con 10 repeticiones para cada tratamiento, cada maceta representó una unidad experimental. Para asociar la resistencia inducida por la inoculación de las bacterias; cada cuatro días después de que aparecieron los síntomas, se estimó la severidad con apoyo de una escala de cinco clases: 1=0 %, 3=10 %, 5=25 %, 7=50 % y 9=100 % de daño (CIAT, 1987). Con los datos de severidad, se construyeron curvas del progreso de la enfermedad, y con el modelo del Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE) se calculó la intensidad de la enfermedad. A los 28 días después de la inoculación con los fitopatógenos, se calculó la severidad final de la enfermedad con la instrucción de arcoseno; y=arsin (sqrt(y/100)), mediante el parámetro de Yfinal (Campbell y Madden, 1990). Finalmente mediante el procedimiento de Abbott (1925) se validó la eficacia de las cepas bacterianas como inductoras de resistencia. Se aplicó el comparador de medias cuando se determinó significancia entre tratamientos con Tukey (p≤0.05). Con el propósito de verificar la reproducibilidad de resultados, los experimentos se repitieron en dos periodos (diciembre de 2014 y febrero de 2015), para el análisis se utilizaron los promedios de las dos evaluaciones. Los análisis estadísticos se hicieron con el programa SAS versión 9.3 para Windows (SAS Institute Inc. 2010).
Resultados y discusión
Actividad in vitro de Bacillus spp. contra Fusarium spp.
Todas las cepas mostraron inhibir el crecimiento micelial de los patógenos, los porcentajes de inhibición en F. equiseti fueron de 21.28 a 71.70 % y para el caso de F. solani fue de 37.4 a 69.92 % (Cuadro 1) el mayor efecto fue observado con B. subtilis CBMT51 sobre el crecimiento de F. equiseti, y la cepa CBRF8 mostró el mayor efecto contra ambos patógenos con valores arriba del 63 %. La cepa B. cereus BL8, reportada como promotora de crecimiento, mostro porcentajes de inhibición significativamente menores a las dos cepas mencionadas. El rango de inhibición reportados por varios autores es amplio, porcentajes de inhibición de 90 % son reportados por cepas de B. subtilis contra Fusarium sp. (Badía et al., 2011), por el contrario porcentajes de inhibición de 29.4 % fue reportado para F. avenacum (Essghaier et al., 2012), y para B. methylotrophicus y B. amyloliquefaciens contra F. oxysporum de 42.0 y 51.5 % (Rios et al., 2016), estos últimos se encuentran dentro del rango obtenido en el presente estudio. Las cepas CBMT2 y CBMT51, fueron las únicas que presentaron halos de inhibición del crecimiento micelial en confrontación contra F. equiseti con halos de 3.76 y 6.37 mm, respectivamente, que corresponden al 18.3 y 31.5 % de inhibición (Figura 1). La actividad antagónica de Bacillus se debe a varios mecanismos como competencia por la colonización de la rizosfera (Compant et al., 2005), producción de lipopéptidos como Iturina, Fengicina y Surfactina (Kim et al., 2010), y producción de enzimas líticas (Pleban et al., 1997; Chang et al. 2010). La cepa B. subtilis Pla10 produce antibióticos de la familia Iturina A y Surfactina, las fracciones purificadas mostraron que solo Iturina A es la que presentó actividad fungicida (Ragazzo et al., 2011). La quitinasa purificada de Bacillus cereus YQ 308 inhibe la elongación de hifas de F. oxysporum y F. solani, disminuyendo la biomasa de los hongos en comparación al testigo (Chang et al., 2003). De acuerdo con los resultados se seleccionaron cuatro cepas de Bacillus para los ensayos de control de la marchitez en chile habanero con base en su actividad antifúngica; la cepa CBRF8 que mostró el mayor porcentaje de inhibición micelial en F. solani, la cepa CBMT51 que mostró el mayor porcentaje de inhibición y halo de inhibición en F. equiseti, la cepa CBMT2, con actividad antifúngica contra ambos patógenos y presencia de halo de inhibición en F. equiseti, y se incluyó a la cepa BL18 con moderada actividad antifúngica pero reportada con propiedades de promoción de crecimiento vegetal.
Cuadro 1. Actividad in vitro de Bacillus spp. contra Fusarium spp. a los siete días de confrontación.
○Medias con letra distinta son estadísticamente diferentes (p≤0.05)
Pruebas de patogenicidad de Fusarium equiseti y F. solani en chile habanero.
Las pruebas de patogenicidad por Fusarium equiseti ITCF1 y F. solani ITCF2 inoculadas en planta de chile habanero, mostraron virulencia, al inducir síntomas característicos como: clorosis, flacidez y defoliación parcial, pudrición de raíces y cuello, que en ocasiones ascendió de 3 a 7 cm de la base del tallo. A pesar de registrase el 100 % de incidencia con las dos especies de hongos, la severidad fue mayor con F. solani ITCF2 donde registró 90.0 % y menor con F. equiseti ITCF1 con 77.5 %, sin que represente diferencia estadística (Cuadro 2). Los síntomas de la enfermedad se empezaron a manifestar a la segunda semana de inoculación con el patógeno. Estos resultados en cuanto a la incidencia y severidad fueron similares a los obtenidos en otros estudios en Capsicum annuum L. y Solanum lycopersicum L., obteniendo un 100 % de incidencia y severidad de 80 a 100 % con dos cepas de F. oxysporum (Apodaca et al., 2004). En pruebas de patogenicidad en plantas de Thevetia peruviana inoculadas con especies de Fusarium, encontraron a F. solani provocando síntomas como: necrosis en el tallo, hojas cloróticas y marchitez, determinando a esta especie como la más virulenta (Herrera et al., 2011), resultados que concuerdan con las del presente estudio. Se realizó un análisis de varianza con el modelo del área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) para poder determinar la patogenicidad y agresividad de los dos hongos, se obtuvo para F. equiseti y F. solani 1120.0 y 1201.0 unidades.día-1, respectivamente, no hubo diferencia significativa en la virulencia de los hongos (Cuadro 2), sin embargo, se puede observar una mayor unidad de plantas enfermas por F. solani. Para el testigo sin la presencia de hongos hubo 0.0 unidades enfermas manteniéndose las plantas sanas y vigorosas hasta el final del experimento.
Evaluación de la resistencia a la marchitez por Fusarium spp. en plantas de chile habanero inoculadas con Bacillus spp.
La aparición de síntomas en plantas inoculadas con F. equiseti y F. solani se observaron a los ocho días posteriores a la inoculación. En general, en las plantas inoculadas, F. solani mostró mayor virulencia que F. equiseti; al inducir mayor severidad durante el progreso de la enfermedad; en plantas testigo sin la inoculación de patógenos, no se presentó la enfermedad (Figura 2). El análisis de la intensidad de la enfermedad, mostró menor ABCPE con la inoculación de las cepas CBMT51 y BL18 contra F. equiseti, sin embargo, solo la BL18 permitió menor severidad en las plantas infectadas con F. solani. Al final del experimento, el parámetro de Yfinal, registró con CBMT51 una severidad del 39.7 % en F. equiseti, mientras que con BL18 se obtuvo contra F. solani un 41.7 %. Esto permitió calcular los mayores niveles de control de la enfermedad con 47.8 y 50.9 % de eficacia, respectivamente (Cuadro 3). En ensayos con aplicaciones de B. subtilis CAS15 en C. annuum redujo la severidad de la enfermedad causada por F. oxysporum, con eficiencia de control del 56.9 %, similares a los obtenidos en este estudio, esta eficacia se atribuyó a una inducción de resistencia sistémica (IRS) (Yu et al., 2011). La IRS se ha evidenciado en C. annuum contra Phytophthora capsici cuando se utilizó B. megaterium al reducir la severidad de la enfermedad del 18.3-33.3 %, y una eficiencia de control del 23.1-57.7 % (Akgül y Mirik, 2008). En el cultivo de Cucumis sativus con problemas de F. oxysporum, evaluaciones con Bacillus B068150, redujo la severidad en un 49.32 % lo que significó un control del 50.68 % (Li et al., 2011). En S. lycopersicum se confirió resistencia contra Ralstonia solanacearum al utilizar B. subtilis (CYBS-5) con una eficacia de control mayor al 50 % (Chen et al., 2012). También en S. lycopersicum L. afectados por F. oxysporum la implementación de Pseudomonas fluorescens redujo significativamente la incidencia y severidad de la marchitez del 4.86-74.49 %, donde la pre-inoculación con las bacterias tiende a mejorar la activación de IRS (Yu et al., 2011). Algunas rizobacterias tienen la capacidad de producir ácido salicílico; responsable de la IRS, como se demostró con P. aeruginosa 7NSK2 contra Botrytis cinerea (De Meyer y Hofte, 1997). Estos atributos pueden ser aprovechados para el control biológico de fitopatógenos con origen en el suelo reduciendo, lo que puede disminuir el uso de plaguicidas sintéticos.
Figura 2. Curvas del progreso de la enfermedad de la severidad por marchitez inducida por Fusarium equiseti (A) y F. solani (B) a los 28 días después de la infección en plantas de chile habanero inoculadas con Bacillus spp.
Cuadro 3. Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE), severidad y eficiencia del control de Fusarium equiseti y F. solani en plantas de chile habanero inoculadas con Bacillus spp.
○Medias con letras diferentes en cada columna son estadísticamente diferentes (Tukey p≤ 0.05). DMS = diferencia mínima significativa; Testigo + con presencia del patógeno; Testigo - sin patógenos ni bacterias
Conclusiones
Las cepas bacterianas en estudio presentaron propiedades antagónicas in vitro contra F. solani y F. equiseti, estos patógenos presentaron virulencia en C. chinense al provocar marchitez a las plantas. Para la resistencia a la marchitez en C. chinense, la inoculación de las cepas B. subtilis CBMT51 y B. cereus BL18 redujeron la severidad provocada por F. equiseti, sin embargo, sólo la BL18 la redujo en F. solani. Se observó que la capacidad de control de la enfermedad está asociada con el tipo de cepa bacteriana y por la especie del fitopatógeno. Las cepas CBMT51 y BL18 mostraron propiedades en el biocontrol de marchitez ocasionas por Fusarium, por lo que pueden ser utilizadas en la protección del cultivo de chile habanero.
